基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 比較不同產地黃芪飲片的成分差異

劉 倩,李 格,張 靜,蘭銀銀,韓福國,范雪梅,郝艷麗,劉清飛,3*

1.陜西中醫藥大學藥學院，咸陽 712046；2.清華大學藥學院，北京 100084；3.清華大學北京市中醫藥交叉研究所，北京100084

黃芪是常用的傳統中藥之一，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. 的干燥根；性微溫，味甘，歸脾、肺經，有補氣升陽、益衛固表、托毒生肌、利水退腫之功效［1］?，F代藥理學研究表明，黃芪主要含有皂苷、黃酮、氨基酸以及多糖等多種活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、調節免疫、降血壓等藥理作用［2］。黃芪在我國分布較廣，如甘肅、山西、陜西、內蒙古、東北等地，各地區海拔、土壤、光照等環境條件不同，導致各產地黃芪藥材及飲片的質量與等級也有顯著差異［3］。目前，有研究用高效液相色譜、超高效液相色譜等技術比較不同產地黃芪水提取液、醇提取液等化學成分，證實在各地黃芪中部分成分存在含量差異，為研究不同產地黃芪質量控制與評價提供了一定科學依據，但大多數研究僅對含量較高的化合物進行分析，并不全面［4-7］。因此，本研究以黃芪的3 個重要產地（山西渾源與朔州、甘肅渭源與岷縣、陜西子洲）所產的黃芪飲片為研究對象，用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）液質聯用系統全面檢測黃芪的化學成分，并用偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等統計學方法全面分析3 個產地黃芪飲片的化學成分差異，為不同產地黃芪飲片的基原鑒定與質量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液質聯用系統：Ultimate 3000 型超高效液相色譜儀（美國Dionex 公司）串聯Thermo Q Exactive Plus 型高分辨質譜（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RT-12SF粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；MS104S 分析天平（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LD5-2B 離心機（北京市京立離心機有限責任公司）。

1.2 試藥

15 批黃芪飲片分別由北京市萬泰利克藥業有限公司、陜西子洲縣永盛黃芪種植農民專業合作社提供，分別來源于甘肅、山西、陜西3 個省的主產地，為豆科植物蒙古黃芪的干燥根，見表1。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備

取黃芪飲片適量，粉碎過60 目篩，再取過篩粉末約1 g，精密稱定，加甲醇10 mL，稱定質量，浸泡30 min，超聲提取1 h，稱定質量，加甲醇補足減失的質量，以4 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為30 ℃；流速為0.2 mL·min-1；流動相為0.1 mL·L-1甲酸-乙腈（A）-0.1 mL·L-1甲酸水（B），梯度洗脫：0～10 min，100%B；10～20 min，100%～70% B；10～25 min，70%～60%B；25～30 min，60%～50%B；30～40 min，50%～30%B；40～45 min，30%～0%B；45～60 min，0% B。二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）的掃描波長設為190～400 nm。

表 1 黃芪飲片的來源Tab.1 Source of Astragali radix decoction pieces

2.3 質譜條件

離子源：加熱電噴霧離子化源（heated elektrospray ionization source，HESI）；鞘氣流量為40 arb，輔助氣體流量為15 arb，毛細管溫度為320 ℃，輔助氣體加熱器溫度為350 ℃，正噴霧電壓為3.2 kV，負噴霧電壓為3.0 kV。MS 的分辨率為70 000，MS/MS 的分辨率為17 500，掃描方式為全掃描模式，正、負離子模式同時檢測，掃描范圍m/z100～1 500。

2.4 數據處理及統計學方法

化合物用Compound Discover 3.1，m/zCloud 和m/zVault 數據庫進行鑒定，并與TCMSP 數據庫及文獻中黃芪化學成分進行比對。用SIMCA 軟件對所得化合物進行PLS-DA 分析，以VIP 值反映化合物對分組的貢獻大小，并進一步用t檢驗對差異成分進行顯著性分析，最終以VIP＞1、P＜0.05 為標準，篩選不同產地黃芪的差異成分。對不同產地黃芪的差異成分用SIMCA 再次進行PLS-DA 分析，繪制得分圖、聚類樹狀圖、Bipolt 圖，分析得不同產地的代表性差異成分。用Origin 軟件繪制差異成分熱圖，以更直觀地分析不同產地黃芪的差異成分的含量差異。

3 結果與分析

3.1 化學成分的鑒定

甘肅、山西、陜西3 個產地黃芪飲片的總離子流圖見圖1。

圖1 正負離子模式下3 個產地黃芪UHPLC-MS 總離子流圖Fig.1 UHPLC-MS TIC of Astragali radix decoction pieces from 3 origins in positive and negative ion modes

從正、負離子流圖可知，不同產地黃芪圖譜整體輪廓大致相似，但部分化合物峰高有差異。原始圖譜信息與Compound Discover 3.1、m/zCloud、m/zVault、TCMSP 數據庫及文獻中黃芪化合物信息進行比對，共鑒定出107 個化合物，并以相對分子質量由小到大對化合物進行編號。

3.2 差異化合物的篩選及鑒定

用有監督的PLS-DA 方法分析數據，所得模型參數為R2Y（cum）=0.935，Q2（cum）=0.202。PLSDA 得分圖見圖2。由圖2 可知，甘肅、山西產地5 個批次的黃芪較為分散，陜西子洲產地5 個批次的黃芪較為聚集且與其他2 個產地距離較遠。進一步計算各個化合物的VIP 值、組間統計學差異，發現同時符合VIP＞1 且P＜0.05 的成分共有21 個，主要涉及氨基酸、糖、酚酸、黃酮、維生素、木脂素、三萜等化合物，其中1 個成分在甘肅、山西2 個產地差異有統計學意義；11 個成分在山西、陜西2 個產地差異有統計學意義；18 個成分在甘肅、陜西2 個產地差異有統計學意義，見表2。其中葉酸僅在陜西子洲產地檢測到，其余20 個成分在3 個產地的黃芪中均存在，但含量有差異，見圖3。

圖2 PLS-DA 得分散點圖Fig.2 PLS-DA score scatter plot

圖3 不同產地差異化合物的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of differential compounds of different origins

表2 21 個差異化合物的信息Tab.2 Information of 21 differential compounds

3.3 差異成分的研究

基于21 個差異化合物對15 批樣本進行聚類，區分不同產地黃芪飲片的潛在指標成分。PLS-DA 法所得模型參數為R2Y（cum）=0.837，Q2（cum）=0.482，得分圖見圖4。聚類分析樹狀圖見圖5。由圖5 可知，21 個差異化合物可將3 個不同產地的黃芪區分開。若分為2 類，僅有陜西子洲與甘肅明顯區分開；若分為4 類，陜西5 批可聚為一類，甘肅5 批聚為一類，山西S-3、S-5 聚為一類，但與陜西相近，山西S-1、S-2、S-4 聚為一類，但與甘肅相近。

圖4 差異成分得分散點圖Fig.4 Score scatter plot of differential compounds

圖5 差異成分的聚類樹狀圖Fig.5 Hierarchical cluster analysis for differential compounds

Biplot 圖見圖6。由圖6 可知，各差異化合物與產地越接近表明成分與該產地相關性越強，含量也越高。熱圖中顏色越紅，表明含量越高。差異成分熱圖見圖7，結合Biplot 圖及熱圖可知，有12 個差異化合物在陜西子洲黃芪中含量高于其他產地。其中阿拉伯糖（15）、維生素B2（64）、葉酸（74）、黃芪異黃烷苷（85）、柚皮苷（90）、沙苑子苷（94）在陜西子洲與其他2個產地的含量差異有統計學意義，可作為陜西子洲黃芪潛在指標性成分；羽扇豆醇（70）、4-羥基肉桂酸（17）、精氨酸（20）、胱氨酸（26）、γ-氨基丁酸（1）、絲氨酸（3）、鷹嘴豆芽素A（43）、芒果苷（69）、L-乙酸冰片酯（25）9 種差異化合物在甘肅黃芪中含量較高，但其中羽扇豆醇與其他2 個產地含量差異均無統計學意義，無法區別于其他2 個產地。刺芒柄花素（35）、刀豆氨酸（21）等化合物在山西黃芪中含量較高。

圖6 差異成分的Biplot 圖Fig.6 Biplot plot of differential compounds

圖7 差異成分熱圖Fig.7 Heat map of differential compounds

將差異性成分的峰面積用Origin 軟件進行歸一化處理，再對甘肅、山西、陜西3 個產地含量較高的顯著差異成分的相對含量進行比較分析，結果見圖8、圖9。結果顯示，甘肅產地黃芪中4-羥基肉桂酸含量顯著高于山西產地；精氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、絲氨酸、鷹嘴豆芽素A、芒果苷、L-乙酸冰片酯含量顯著高于陜西子洲產地。相對甘肅、山西2 個產地的黃芪，陜西子洲黃芪中阿拉伯糖、維生素B2、葉酸、黃芪異黃烷苷、柚皮苷、沙苑子苷的含量相對較高，可作為陜西子洲黃芪潛在質量指標成分。

圖9 陜西子洲產黃芪飲片含量較高的成分歸-化峰面積柱狀圖Fig.9 Histogram of normalized peak areas of components with higher content of Astragali radix decoction pieces from Zizhou in Shannxi

4 討論

黃芪為臨床常用中藥材，產地多，分布廣，其品種、品質、規格等亦多有不同。陜西、山西、甘肅作為黃芪的重要產區，地理位置（如經度與緯度、坡向與坡度等），氣候特征（如干旱與潮濕等），以及生長采收年限不同等，導致各地黃芪藥材及飲片質量存在顯著差異。陜西子洲黃芪為蒙古黃芪，生長于干旱的坡地，為半野生黃芪，生長年限大多超過5年，于2008年被批準為國家地理標志保護產品；山西恒山黃芪為蒙古黃芪，生長于干旱的坡地，為半野生黃芪，生長年限大多超過5年，于2014年被批準為國家地理標志保護產品，亦有部分家種黃芪，通常栽培2～3年；甘肅隴西黃芪主要為蒙古黃芪，生長于相對潮濕的平地，為栽培黃芪，生長年限為2年［8-9］。此外，從歷代本草有關黃芪產地的記述可以看出，黃芪的道地產地隨朝代的變更而變遷［10-11］，加之人工栽培所用種子來源多元化，為當地飲片的質量控制帶來一定困難。例如隨機采集甘肅主栽地區的黃芪資源，樣品中蒙古黃芪、膜莢黃芪所占比例最高，分別為59.65%、36.84%，剩余紅芪及東俄洛黃芪占3.51%［12］。為此，加強對黃芪基原與質量的研究，從而為黃芪藥材飲片的質量控制提供參考尤為必要。近年來多數研究基于UPLC-MS、核磁指紋圖譜、SSR 分子標記技術等方法從多指標含量測定、炮制前后化學組分對比等方面對黃芪飲片基源及質量進行研究［4-5，13-15］。本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液質聯用技術分析比較甘肅、山西、陜西3 個不同產地黃芪飲片的成分差異，通過數據庫及文獻對比鑒定出108 個化學成分，并經組間比較及統計學分析篩選出21 個顯著差異化合物，可作為特征成分對3個產地的黃芪飲片進行區分，為黃芪飲片的來源鑒定與質量評價提供參考。從差異化合物聚類分析圖可發現，21 個差異化合物可將甘肅、山西、陜西3 個不同產地黃芪飲片區分，但同一省不同地區黃芪并未有所區分，如山西渾源S-5 與山西朔州S-3 聚為一類，甘肅渭源G-2 與岷縣G-3 聚為一類，表明同省內黃芪飲片質量無明顯差異。因此本文重點分析3 個不同省份所產黃芪飲片的成分差異。

21 個差異化合物中有6 個成分在陜西子洲黃芪中的含量均顯著高于甘肅、山西2 個產地的黃芪，分別為沙苑子苷、葉酸、黃芪異黃烷苷、柚皮苷、阿拉伯糖、維生素B2，推測這幾種成分既可區別陜西子洲與其他產地所產黃芪，也可用于黃芪種源鑒定。上述黃芪異黃烷苷、沙苑子苷和柚皮苷屬于黃酮苷類，通過網絡藥理學及分子對接技術預測黃芪異黃烷苷具有治療兒童肥胖癥、糖尿病周圍血管疾病等藥理作用［16-17］，有研究報道，沙苑子苷能很好地與促進腫瘤血管形成的相關靶點結合，可調控原癌基因酪氨酸蛋白激酶（ABL1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）［18］。柚皮苷可對某些毒物產生拮抗作用，還具有降血脂、降膽固醇、抗骨質疏松、抗動脈粥樣硬化等作用［19］。維生素B2是體內多種氧化酶系統不可缺少的輔酶，其對維持人體正常物質代謝和某些特殊生理功能是不可缺少的［20］。黃芪異黃烷苷、柚皮苷、沙苑子苷等6 種差異成分在陜西子洲產的黃芪中含量較高，且具有多種藥理活性，也表明陜西子洲的黃芪飲片在抗癌、免疫調節、降血脂等作用方面較有優勢。

其次，21 個差異化合物中可區別于甘肅、山西產地蒙古黃芪的成分僅有4-羥基肉桂酸，但甘肅黃芪與陜西子洲黃芪無顯著差異，推測此成分可能受甘肅地理環境影響，種源間差異較小，可作為甘肅蒙古黃芪飲片的質量標志物之一。4-羥基肉桂酸又稱對羥基肉桂酸，可通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，達到預防和治療色素沉著、黑色素瘤等目的［21］。劉利娜［22］研究發現，滇桂艾納香中的酚酸（對羥基肉桂酸）具有顯著的抗血小板活性。甘肅產黃芪中精氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、絲氨酸、鷹嘴豆芽素A、芒果苷、L-乙酸冰片酯含量顯著高于陜西子洲產黃芪，可分為氨基酸類、黃酮類等，但含量與山西產黃芪無顯著差異，推測這幾種成分也可作為黃芪種源鑒定的特征性成分。氨基酸結構具有既含羧基又含氨基的特點，在調節激素分泌及合成、調節能量代謝、抗腫瘤、調節血壓、提高記憶力等方面有重要藥理作用［23-24］。據報道，鷹嘴豆芽素A 可通過限制糖酵解和線粒體氧化磷酸化等抑制膠質母細胞瘤的生長［25］。芒果苷又稱莞知母寧，是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有良好的降糖活性，可通過增加小鼠成肌細胞葡萄糖吸收以及改善細胞胰島素抵抗活性等發揮降糖作用［26］。由此可推測，甘肅黃芪可能在抗腫瘤、調節內分泌以及降血糖等方面具有較強的藥理活性。山西產地黃芪中刺芒柄花素含量顯著高于陜西子洲產地，但與甘肅產地無明顯差異，刺芒柄花素為異黃酮類化合物，也是黃芪的主要成分之一，研究表明，其在抗炎、抗氧化應激、神經組織修復、抗癌等方面有重要作用。LI Z 等［27］研究發現刺芒柄花素可通過抑制白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）進而抑制神經炎癥反應，從而發揮其神經保護作用。其還可通過激活核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1（E2-related factor 2/hemo oxygenase-1，Nrf2/HO-1）信號通路改善腎功能、降低血糖血脂、抑制腎組織氧化［28］。其在結腸癌、胃癌、外陰鱗癌等疾病中可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡活性［29-31］，推測山西產黃芪可能在此類藥理作用方面有更強的活性。

綜上所述，基于PLS-DA 等分析方法得到21 個差異性化合物，可對不同產地黃芪道地性指標奠定理論基礎，并且差異化合物分類廣泛，涉及維生素、黃酮及其苷類、糖等，表明不同產地代表性差異成分可能在對應藥理作用方面具有臨床治療意義，也為深入研究其藥理作用提供思路。2020年版《中華人民共和國藥典》規定黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷為黃芪含量測定指標，而本研究中3 個產地的15批樣本中，黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均未見顯著性差異，表明僅以該2 種成分并不能有效區分不同產地的黃芪飲片，與文獻報道的甘肅與內蒙古產黃芪上述2 個指標差異無統計學意義相一致［32］。本研究為黃芪飲片的質量控制與評價納入更多活性強、含量高的有效成分提供理論依據。但研究每個產地僅購入5 批黃芪，樣本量小，今后應購入不同產地更多批次的黃芪來驗證本文分析所得的潛在質量標志物的準確性。 本文僅基于UHPLC-Q-Orbitrap-MS 液質聯用技術進行差異化合物檢測及分析，今后可進一步運用紅外、液質聯用、核磁共振等多種方法，并且結合多糖、蛋白、微量元素等物質基礎對黃芪飲片的道地性及種源方面進行更系統、全面地研究。