構建犬聲帶瘢痕模型及初步篩選聲帶瘢痕形成相關靶基因*

黃玉 劉豆 黃文霞 梁耕田

聲帶瘢痕(vocal fold scar)是由于炎癥、外傷等各種原因引起喉腔損傷,使聲帶固有層細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中膠原纖維、彈性纖維和纖維連接蛋白形態和含量發生改變,成纖維細胞增殖活躍,進而導致肉芽組織過度增生并逐漸纖維化的結果[1,2]。ECM的合成和降解與組織纖維化密切相關,其合成主要依賴于轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路調節,降解則依賴于基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。與此相符,在聲帶損傷的瘢痕修復過程中,TGF-β1、Smmad7高表達[3,4]。Lim等[5]在大鼠聲帶瘢痕模型研究中發現,IL-1、NF-κB、TNF-α等也高表達。而本科研團隊前期通過CO2激光燒灼術成功構建了犬聲帶瘢痕模型,發現:賴氨酰胺氧化酶(lysyl oxidase,LOX)、基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP1)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP70)、透明質酸(hyaluronic acid,HA)等因子在聲帶瘢痕形成過程的不同時期表現出不同的表達水平,推測以上因子與聲帶創傷修復及瘢痕形成相關[6,7]。與聲帶瘢痕形成相關的基因眾多且較為分散,不能較全面地匯總出重點相關的基因家族。本研究通過等離子射頻消融術構建犬聲帶瘢痕模型,并采用高通量測序技術對正常聲帶和瘢痕化聲帶進行轉錄組基因檢測分析,篩選出與聲帶瘢痕形成密切相關的靶基因及所富集的信號通路,為探索聲帶瘢痕發生機制提供進一步參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 由三峽大學提供健康中華田園犬4只,均為1歲齡雄性犬,體重均為10 kg左右,全部通過湖北省疾病預防控制中心質量檢測,具備科學研究條件。研究期間所有犬在同等環境條件下飼養于武漢大學附屬同仁醫院(武漢市第三醫院)實驗中心犬飼養間,所有操作均通過動物倫理委員會審批(武三醫實倫SY2022-009)。

1.2實驗試劑及儀器 內窺鏡攝像系統(KARL STORZ)、醫用內窺鏡冷光源(KARL STORZ)、等離子動力系統(KARL STORZ)、0°內鏡鏡頭(KARL STORZ)、支撐喉鏡、負壓吸引器、光學顯微鏡(Olympus)、超薄切片機(Leica)、鉆石切片刀(Daitome)、透射電子顯微鏡(HITACHI)、蘇木素染液(Servicebio)、伊紅染液(Servicebio)、環保型脫蠟透明液(Servicebio)、電鏡固定液(Servicebio)、4%多聚甲醛固定液(Biosharp)、環氧樹脂812包埋劑(Servicebio)、RNA提取試劑盒(Omega)、PCR擴增試劑盒(Servicebio)。

1.3構建犬聲帶瘢痕模型 將4只中華田園犬禁食、禁水8 h,采用速眠新II 0.05 ml/kg+5%戊巴比妥鈉0.25 ml/kg右后上肢肌肉注射麻醉,在支撐喉鏡內鏡輔助下充分暴露雙側聲帶,等離子刀(切割功率7檔,電凝功率3檔)逐層消融左側聲帶中上1/2段,直至肌層,面積約7 mm2,右側聲帶作為自身對照側不予任何處理,蘇醒4 h后予以少許軟食,次日起恢復正常飲食。所有犬同等條件下飼養。

1.4聲帶大體形態觀察 在參考本團隊前期成功造模的基礎上[6],將本研究觀察時間點選為術前、術后即刻、術后3周和術后12周。將所有犬進行肌肉注射麻醉(方法同1.3),于支撐喉鏡內鏡輔助下充分暴露雙側聲帶,觀察形態學特征及變化。

1.5組織取材 術后12周,將所有犬予以安樂死,將喉完整離體分離,充分暴露雙側聲帶,于術側聲帶取多個典型標本,部分放入4%多聚甲醛固定液和電鏡固定液(主要成分為2.5%戊二醛)中固定,部分放入EP管中于-80℃新鮮凍存,同法處理對照側聲帶組織。所有樣本大小相當、重量相仿。

1.6HE染色觀察聲帶病理結構 將多聚甲醛固定后的聲帶組織進行石蠟包埋,垂直于聲門區方向進行橫切制片,厚度為4 μm,然后依次經過脫蠟透明液(2次,每次20 min)、梯度酒精、PBS(5 min)脫蠟水化,后滴加蘇木素染色4 min,鹽酸酒精分化3 s、氨水返藍4 s后滴加伊紅染色2 min,最后將切片經過梯度酒精和脫蠟透明液(2次,每次10 min)進行脫水透明,中性樹膠封片后,于光學顯微鏡下觀察雙側聲帶組織結構及變化。

1.7電鏡下觀察聲帶超微結構 將取出的犬聲帶組織按順序進行多次固定(電鏡固定液室溫避光固定2 h→電鏡固定液4℃繼續固定2 d→0.1 M磷酸緩沖液漂洗后于1%鋨酸室溫避光后固定2 h),0.1 M磷酸緩沖液漂洗后經梯度酒精和丙酮(2次,每次15 min)脫水,然后丙酮∶環氧樹脂1∶2于37℃滲透包埋過夜,后于60℃聚合48 h制備樹脂塊。垂直于聲門區方向進行橫切超薄制片,厚度為60 nm,150目方華膜銅網撈片,2%醋酸鈾酒精染色8 min,70%酒精和雙蒸水各清洗3次,2.6%枸櫞酸鉛染色8 min后雙蒸水清洗、風干,于透射電鏡下觀察雙側聲帶超微組織結構及變化。

1.8兩組犬聲帶高通量轉錄組基因測序 按照RNA提取試劑盒說明書提取正常聲帶和瘢痕聲帶組織總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性,Nanodrop和Qubit分別對提取的RNA進行純度檢測和總量測定。利用Oligo(dT)富集mRNA,并將其打斷成200 bp左右的片段,以其為模板合成雙鏈cDNA,經過End Repair Mix進行末端補平和末端加A后,連接測序接頭并進行cDNA消化,留取單鏈cDNA后進行15個循環的PCR擴增,得到cDNA庫后采用illumina Novaseq6000雙端測序模式進行高通量測序。兩組聲帶測序后進行轉錄組基因差異性統計學分析。

聲帶組織中提取總RNA經瓊脂凝膠電泳檢測示28S:18S≥1.5,Nanodrop檢測RNA純度示OD260/280比值均在1.8～2.2范圍內,Qubit精確定量RNA總量≥500 ng。利用DESeq2軟件對正常聲帶組和瘢痕聲帶組的基因表達情況進行差異性統計學分析,為提高結果準確性和排除個體差異性,于正常聲帶組4只犬中留取的大小相當、重量相仿的典型標本中隨機選取3個樣本,將測得的基因表達量取平均值記為對照組G1,同法于瘢痕聲帶組典型標本中隨機選取3個樣本,將測得的基因表達量取平均值記為實驗組G2,以log2FC值為橫坐標,log10(PValue)值為縱坐標繪制火山圖,滿足|log2FC|≥1且P≤0.05表明基因表達有明顯統計學差異(其中log2FC≥1的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達顯著上調的基因,≤-1的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達顯著下調的基因,P≤0.05提示基因表達存在顯著差異性)。

2 結果

2.1不同時期聲帶大體形態 術前犬雙側聲帶均呈白色條帶狀、邊緣光滑整齊,活動對稱,閉合良好(圖1a)。左側聲帶等離子消融術后,術側聲帶組織損傷暴露至肌層,失去原有形態特征,對側聲帶與術前無明顯差異(圖1b);術后3周,術側聲帶創面已處于修復狀態,但邊緣不規則,組織仍有充血腫脹,可見紅色肉芽組織形成,對側聲帶與術前無明顯差異(圖1c);術后12周,術側聲帶創面已修復完成,未見充血腫脹及肉芽組織,但局部攣縮凹陷、邊緣不整齊,瘢痕形成,對側聲帶與術前無明顯差異(圖1d)。

圖1 不同時期內鏡下聲帶大體形態學觀察 a. 術前犬正常聲帶; b. 等離子術后即刻聲帶; c. 等離子術后3周聲帶; d. 等離子術后12周聲帶

2.2HE染色觀察 正常聲帶組織結構完整、層次分明,外層為復層鱗狀上皮層,緊接著可見疏松的結締組織層以及排列有序、走向一致的纖維層和肌層(圖2a)。術側聲帶鱗狀上皮層明顯增厚,并可見多量散在纖維束,原有疏松結締組織層纖維化,原有纖維層增厚、排列紊亂、走向不一,局部成團狀或束狀聚集(圖2b);間質增厚、密度不均(圖2c);總體層次混亂,肌層亦可見散在紊亂的纖維束(圖2d)。

圖2 犬聲帶HE染色下病理結構觀察 a. 正常聲帶組織,見其結構完整、層次清晰(40×); b. 瘢痕聲帶組織,見鱗狀上皮增厚,原有纖維層排列紊亂(40×); c. 瘢痕聲帶間質增厚、不均(100×); d. 瘢痕聲帶結構混亂,肌層亦可見散在纖維束(100×)

2.3超微結構觀察 正常聲帶組織層次分明,復層鱗狀上皮層細胞多層有序排列,細胞未見腫脹,相對靜止(圖3a);結締組織層致密,間質密度較均,纖維層呈波浪形有序排列、走向一致(圖3b)。術側聲帶組織鱗狀上皮增厚,細胞呈腫脹狀態,細胞間亦可見散在纖維,纖維層排列紊亂(圖3c);間質增厚、密度不均,細胞腫脹,細胞間界線不清,細胞核增生、線粒體增多,細胞較為活躍(圖3d)。

圖3 犬聲帶透射電鏡下超微結構觀察 a、b. 正常聲帶組織超微結構(3 000×,6 000×);c、d. 瘢痕聲帶組織超微結構(3 000×,6 000×)

2.4高通量測序轉錄組基因分析 兩組基因表達差異的火山圖見圖4,可見,兩組聲帶組織基因表達總體存在較大差異性,實驗組較對照組基因表達呈現顯著上調、顯著下調和無顯著差異三種趨勢,其中表達顯著上調居多(圖4)。再以基因在對照組G1中的表達量為橫坐標,在實驗組G2中的表達量為縱坐標繪制散點圖(圖5),顯著差異基因表達篩選條件同火山圖,同樣表現為實驗組較對照組基因表達呈現顯著上調居多,趨勢同火山圖所示。

圖4 犬聲帶樣本間基因表達火山圖 左側紫色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著下調的基因,右側藍色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著上調的基因,而灰色的點則表示兩組間無顯著差異表達的基因

圖5 犬聲帶樣本間基因表達散點圖 左上側紅色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著上調的基因,右下側綠色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著下調的基因,而中間灰色的點則表示兩組間無顯著差異表達的基因

與聲帶瘢痕形成密切相關的基因家族見表1,包括炎癥相關的IL家族、趨化因子CCL和CXCL家族、基質金屬蛋白酶MMPs家族及其抑制劑TIMPs家族、參與多種細胞生理過程的Wnt家族、熱休克蛋白HSP家族、絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族和TGF-β家族等。其中,IL家族的IL16、IL18和IL33,CCL家族的CCL2、CCL8、CCL13、CCL14、CCL19、CCL20、CCL22和CCL23;CXCL家族的CXCL13和CXCL14;MMPs家族的MMP1、MMP2、MMP12、MMP16、MMP19、MMP25和MMP27、TIMP1均顯著上調;Wnt家族的Wnt8a和Wnt通路抑制劑Wif1、DKK1、DKK2顯著上調,但Wnt8b顯著下調;HSP家族相關的HSP90β1顯著上調,而HSPβ2、HSPβ2和HSPβ6顯著下調;MAPK家族相關的MAPK4、MAPK12、MAP3K13、MAP3K20、MAP3K7CL和MAPKAPK2顯著下調;TGF-β家族的BMP5和TGFβ2顯著上調。

表1 犬正常聲帶和瘢痕聲帶間顯著差異性基因

3 討論

聲帶瘢痕是目前嗓音外科的常見并發癥[8],尚缺乏有效統一的方法從組織學上逆轉聲帶瘢痕,究其原因主要是因為聲帶瘢痕的發生機制尚不完全明確。聲帶損傷的預后與損傷程度相關,因透明質酸、核心蛋白聚糖等抗瘢痕形成物質的存在,上皮層及固有層淺層的損傷多可完全修復、不留瘢痕,但固有層深層乃至肌層的損傷會導致周邊小血管的廣泛閉合、纖維組織排序紊亂并過度增生,進而發生纖維化[9,10],導致瘢痕形成。低溫等離子消融術是一種電化學微創技術,通過激發電極與組織之間的電解質產生帶有能量的離子蒸汽層,即本質上是一種電熱創傷,快速打破細胞分子化學鍵,達到多層組織快速消融的目的,有定位精準、用時短等優勢[11],可對聲帶固有層深層及肌層造成所需程度的損傷,因此本研究所選用的低溫等離子消融術具備構建聲帶瘢痕模型的能力。

本研究對犬左側聲帶進行低溫等離子消融術,術后3周見術側聲帶組織充血腫脹,邊緣不齊,可見紅色肉芽組織形成,此時聲帶尚處于修復期;術后12周見術側聲帶創面局部攣縮凹陷、邊緣不整齊,此時聲帶已完成瘢痕修復。如前所述,聲帶損傷后,ECM發生降解與再合成,其膠原纖維、彈性纖維和纖維連接蛋白形態和含量改變,成纖維細胞增殖活躍,導致肉芽組織過度增生從而瘢痕化。本研究HE染色見術側瘢痕聲帶鱗狀上皮層明顯增厚,疏松結締組織層纖維化,纖維層增厚、排列紊亂,局部成團狀或束狀聚集,肌層亦可見散在纖維束;透射電鏡見間質增厚、密度不均,細胞腫脹,細胞間界線不清,細胞核增生、線粒體增多,細胞處于活躍狀態,與聲帶瘢痕化病理過程貼合。

本研究通過高通量測序分析發現瘢痕聲帶與正常聲帶間基因表達總體上存在較大差異性,瘢痕聲帶較正常聲帶基因表達呈現顯著上調、顯著下調和無顯著差異三種趨勢,其中顯著上調的基因有:IL家族的IL16、IL18和IL33,CCL家族的CCL2、CCL8、CCL13、CCL14、CCL19、CCL20、CCL22和CCL23,CXCL家族的CXCL13和CXCL14,MMPs家族的MMP1、MMP2、MMP12、MMP16、MMP19、MMP25和MMP27,Wnt家族的Wnt8a和Wnt通路抑制劑WIF1、DKK1、DKK2,以及TIMP1、HSP90β1、BMP5和TGFβ2等。MMPs是膠原降解的關鍵酶,瘢痕形成的早期能降解I、II、III型膠原,其生理狀況下與TIMPs以l∶l比例以非共價連接形成穩定復合物能維持ECM中膠原的動態平衡,二者動態平衡打破被認為是皮膚瘢痕形成及肝、腎、下呼吸道纖維化等疾病中的核心事件[12,13]。例如,MMP1表達異常會引起ECM的代謝紊亂,導致結構重塑、瘢痕形成等病理改變[14]。本研究測序發現包括MMP1在內的眾多MMPs家族基因在瘢痕聲帶中高表達,證明MMPs家族基因在聲帶纖維化和瘢痕形成中也發揮了重要作用。IL33、MMP2和TIMP1常被作為評價肝組織纖維化程度的指標,其中IL33可通過促進巨噬細胞向M2型轉化、誘導包括TGFβ在內的多種細胞因子、激活Th2細胞等多種作用誘導并促進纖維化;MMP2激活后可促進基質膜降解及血管生成,加速纖維化過程;而TIMP1作為MMP2的抑制劑,在MMP2激活后可被誘導高表達[15]。本研究測序發現這3種基因在聲帶過度纖維化致使瘢痕形成中也表現為高表達,還發現,CCL家族作為趨化因子,多數基因呈現高表達參與了ECM的重塑。

綜上所述,本研究通過低溫等離子消融術成功構建了犬聲帶瘢痕模型,并通過高通量測序富集出了與聲帶瘢痕形成密切相關的多個基因家族,初步篩選出了顯著差異表達的靶基因,為聲帶瘢痕機制的探索和靶點研究的選擇提供了一定的參考價值,但各個靶基因具體的功能定位和靶向調節作用以及靶基因及所在信號通路之間是否存在“竄擾”,尚需進一步研究。