湖南煙草彎孢菌葉斑病和炭疽病病原鑒定及生物學特性研究

肖艷松，李思軍，吳文信，劉天波，周向平，黎 萍，鐘 杰*

湖南煙草彎孢菌葉斑病和炭疽病病原鑒定及生物學特性研究

肖艷松1，李思軍2，吳文信2，劉天波3*，周向平4，黎 萍5，鐘 杰5*

（1.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；2.湖南省煙草公司郴州市公司桂陽縣公司，湖南 郴州 424400；3.湖南省煙草科學研究所，長沙 410004；4.湖南省煙草公司永州市公司，湖南 永州 425000；5.湖南農業大學植物保護學院，長沙 410128）

2020年到2023年，在湖南省郴州市的煙草上發現了類似彎孢菌葉斑病和炭疽病的兩種葉部病害，為了明確引起該病害的病原種類及生物學特性，本研究利用組織分離法對病葉進行分離純化，形態學觀察和柯赫氏法則驗證，并對其生物學特性進行研究。結合形態學及rDNA內轉錄間隔區（ITS）的進化分析，確定煙草彎孢菌葉斑病病原為車軸草彎孢菌；利用ITS及肌蛋白（ACT）、微管蛋白（TUB）、幾丁質合成酶（CHS-1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GPDH）多基因的系統進化分析，確定煙草炭疽病病原為喀斯特炭疽菌。生物學特性研究表明，車軸草彎孢菌菌絲生長最適溫度為25 ℃，最適pH為7，以水溶性淀粉為碳源、牛肉膏為氮源時對菌絲生長最有利；喀斯特炭疽菌菌絲生長最適溫度為25 ℃，最適pH為7，以葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時對菌絲生長最有利。這是湖南省首次在煙草上發現這兩種病害，且到目前為止我國尚無喀斯特炭疽菌引起烤煙病害的報道，研究結果可為科學有效防治該類病害提供參考。

車軸草彎孢菌；喀斯特炭疽菌；彎孢菌葉斑??；炭疽??；煙草病原菌

煙草（L.）是我國重要的經濟作物，煙葉總產量和總銷量都占世界的40%左右[1]。在部分煙區烤煙生長中后期葉斑類病害發生偏重，嚴重影響煙葉生產[2]。目前已報道的常見葉部病害包括真菌病害炭疽病、赤星病等[3-4]，細菌性病害野火病、青枯病等[5-6]以及由TMV、CMV、PVY等引起的煙草病毒病[7]。

彎孢菌屬（）寄主范圍廣泛，可引起多種植物葉斑、苗枯等癥狀[8]，危害水稻[9]、玉米[10]、燕麥[11]等多種禾本科植物。由彎孢菌引起的葉斑病新病害在許多作物中相繼出現，如由新月彎孢引起的鷓鴣茶葉斑病[12]、由引起的茭白葉斑病[13]以及由引起的紅薯葉斑病[14]等，表明彎孢菌屬真菌對農業生產的威脅在不斷加重。90年代我國首次在廣西壯族自治區發現由Tandou et Bilgrami引起的煙草葉斑病[15]，2016年CHEN等[16]在貴州省發現了由車軸草彎孢菌引起的煙草葉斑病。

炭疽病是煙草上發生最為普遍的真菌病害之一，在我國主要煙區均有發生，危害嚴重。2016年在貴州煙田[17]發現由果生炭疽菌引起的煙草炭疽病，2022年在湖南省[18]發現蘭花炭疽菌引起煙草炭疽病，其癥狀表現為水浸狀的黃綠色斑點，后變成褐色、合并成大的壞死斑。除了普通煙草，在2018—2019年間，海南省部分雪茄煙種植區發生了由喀斯特炭疽菌引起的嚴重煙草炭疽病[19]。

2020—2023年間，在對湖南各煙葉生產區進行病害發生情況調查時，發現了類似彎孢菌葉斑病和炭疽病癥狀的2種葉部病害，通過鏡檢初步鑒定為彎孢菌和炭疽菌引起的病害。為了明確病害的具體病原，本研究進行了病原菌的分離、純化、形態學和分子鑒定以及科赫氏法則測定，為掌握該類病害病原菌發生特征，進一步對其生物學特性進行了研究，以期為煙草葉部病害的診斷識別及制定科學防治策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病害樣品采集自湖南省郴州市桂陽縣煙田中烤煙云煙87具有黃褐色壞死病斑的病葉。

1.2 試驗方法

1.2.1 病葉采集和病原菌分離 2020—2023年間在湖南郴州煙區桂陽縣煙田中發現了2種病斑不同的葉部病害。分別于2020和2022年5月將病葉采集后裝入干凈的牛皮紙袋中帶回實驗室。采取常規組織分離法進行病原菌分離[20]，剪取病健交界處約5 mm×5 mm的小塊葉片組織，用70%的乙醇消毒30 s，1%升汞消毒1 min，最后置于無菌水中漂洗3次，用滅菌濾紙吸干水分后移入PDA平板上（含50 mg/mL鏈霉素），28 ℃恒溫培養3 d。待菌落長出后，從菌落邊緣挑取少量菌絲轉接至新的PDA培養基上，通過單孢分離進行純化后置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 病原菌的致病性測定 采用盆栽煙草活體接種方法進行病原菌的致病性測定。將云煙87煙草種子播種于裝有滅菌育苗土（基質∶蛭石=1∶1）的小缽中，選取2月齡煙苗進行接種。將不同菌株接種于100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，于180 r/min，28 ℃的搖床振蕩培養5 d。經兩層滅菌紗布過濾，然后用無菌水清洗兩次，取過濾后的孢子液將濃度調整到106mL-1。將生長良好、長勢一致的煙苗葉片用70%酒精浸濕的棉球擦拭進行表面消毒，然后每盆煙草葉面噴灑5 mL各菌株的孢子液進行接種，每盆煙草接種2片葉，每個菌株處理3盆健康煙草。以同樣的方法噴灑無菌水作為對照組。將接種后的盆栽煙草植株放置在用酒精消毒的密封接種盒中保濕培養48 h后，置于溫室中（光照12 h/d）26 ℃培養，定期觀察發病情況，并記錄結果。待發病后從病組織處再次分離病原菌，并進行形態學和分子鑒定及科赫氏法則驗證。

1.2.3 病原菌菌落及孢子形態觀察 將分離純化的菌株轉接于PDA培養基上，28 ℃培養5 d左右，觀察菌落形態特征。在光學顯微鏡下觀察病原菌形態特征，記錄分生孢子形態、大小。通過誘導分生孢子萌發形成附著胞，觀察附著胞形態、大小，對病原菌進行形態學鑒定。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[21]作為模板，擴增病原菌的rDNA內轉錄間隔區（ITS）、肌蛋白（ACT）、微管蛋白（TUB）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GPDH）和幾丁質合成酶（CHS-1）基因部分區域[22]，并進行序列測定，所用引物如表1所示[3]。擴增反應體系為50 μL，包括：2×Es Taq Master Mix 25 μL、DNA模板2 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL。反應條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；最后72 ℃延伸8 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目標DNA片段，交由生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列提交到NCBI/GenBank獲得基因登錄號。對各個所測的基因序列用BLASTn在NCBI數據庫進行同源性比對。將多基因序列進行合并后，利用MEGA 6軟件的鄰接法（Neighbor-joining, NJ）構建多基因聯合的系統發育樹，采用自舉法（bootstrap）進行1000次重復檢驗[23]。

1.3 病原菌生物學特性測定

1.3.1 碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響 參照朱俊子等[24]的方法，在基礎培養基中加入2%水溶性淀粉、2%蔗糖、2%半乳糖、2%葡萄糖、2%甘油、2%果糖、2%麥芽糖和2%甘露醇制成不同碳源培養基。在基礎培養基中加入2%葡萄糖，然后分別加入0.2%酵母浸膏、0.2%蛋白胨、0.2%牛肉膏、0.2%硝酸鈉、0.2%氯化銨、0.2%甘氨酸、0.2%酪氨酸和0.2%纈氨酸，制成不同氮源培養基。在培養5 d的代表性病原真菌菌株的菌落邊緣打取8 mm菌餅，接種至不同培養基平板中央，于26 ℃恒溫下培養5 d后測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑?處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。每處理3個重復。

1.3.2 溫度對病原菌菌絲生長的影響 將病原菌在PDA培養基上培養5 d后，在菌落邊緣打取8 mm的菌餅接種到PDA平板中央。分別置于5、10、15、20、25、30和35 ℃黑暗培養5 d后，測量菌落直徑并計算菌絲生長抑制率，每處理3個重復。

1.3.3 pH對病原菌菌絲生長的影響 以PDA為基礎培養基，用HCl和NaOH將PDA培養基pH分別調至4、5、6、7、8、9、10。將菌株菌餅接種至不同pH的PDA平板中央，于26 ℃恒溫下培養5 d后測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，每處理3個重復。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 病害癥狀特點及病原菌的分離純化

病害主要發生在烤煙旺長期和成熟期的葉片上。彎孢菌葉斑病最開始在葉片出現褪綠區，隨后變成深色壞死斑，隨著壞死區域擴大，變成灰色、灰褐色或淺棕色，圓形或橢圓形，邊緣深褐色，有少許黃色暈圈包圍（圖1-A）。選取典型癥狀葉片進行分離，共獲得6個菌落形態相似的菌株，選取Ct-4用于后續研究。炭疽菌葉斑病發生時在葉片上出現小圓點，中心淺灰色，邊緣有狹窄的褐色邊界，周圍有暗綠色暈圈（圖1-B）。選取典型癥狀的煙葉進行組織分離，共獲得形態相似的菌株8株，選擇Ck-8作進一步鑒定分析。

注：A，第一種葉斑病田間樣品癥狀；B，第二種葉斑病田間樣品癥狀。

Note: A, Symptoms of the first leaf spot disease; B, symptoms of the second leaf spot disease.

圖1 煙草葉片病害的田間癥狀

Fig.1 Field symptoms of tobacco leaf diseases

2.2 病原菌的致病性測定

利用活體接種將菌株Ct-4和Ck-8的孢子懸浮液噴灑于盆栽煙草葉片。接種Ct-4后，煙草葉片上產生水浸狀不規則型病斑，病斑中間灰褐色，葉肉變薄腐爛，邊緣有黃色暈圈（圖2A、B）；接種Ck-8的煙草葉片，最開始有黑綠色的小點產生，呈現水漬狀，病斑邊緣表現為棕色至棕黃褐色，中央灰白色，部分凹陷，后期隨著病情的擴展，出現穿孔的現象（圖2C、D）。接種清水的對照組煙草未見侵染癥狀。分別選取接種Ct-4和Ck-8菌株的顯癥葉片進行病原菌再分離，通過形態學和分子鑒定，確定了重新分離的菌株與接種菌株一致，證明菌株Ct-4和Ck-8分別為各自病害的病原菌。

注：A-B，接種病原菌4 d后煙葉的癥狀；C-D，接種4 d后煙葉的癥狀。

Note: A-B, symptoms of the leaves after 4 days of inoculation with the; C-D, symptoms of the leaves after 4 days of inoculation with the

圖2 人工接種煙草的癥狀

Fig. 2 Symptoms of artificially inoculated tobacco

2.3 病原菌形態學鑒定

菌株Ct-4在PDA培養基平板上生長較為緩慢，前期為灰褐色，后轉變為紅褐色至褐色，菌絲向外擴展，在PDA培養基上可分泌褐色色素（圖3-A、B）。分生孢子單生，彎曲，近紡錘形，大多具3個隔膜，中間1～2個細胞膨大，大小為（16.6～27.7）μm×（8.3～13.8）μm，中部顏色略深，兩邊顏色逐漸變淺（圖3-C）。

菌株Ck-8菌絲灰白色，邊緣整齊、菌絲致密，后期變為淡黃色（圖3-D、E）。菌株Ck-8的分生孢子無色、單孢、長橢圓形至卵圓形。附著胞卵圓形或姜瓣型，產生黑色素。分生孢子大小為（11.1～27.7）μm×（5.5～9.7）μm（圖2-F），附著胞大小為（8.3～11.1）μm×（5.5～8.3）μm（圖3-G）。

注：A-B，菌株Ct-4在PDA培養基上培養6 d后的菌落形態正面和背面；C，Ct-4的分生孢子；D-E，菌株Ck-8在PDA培養基上培養6 d后的菌落形態正面和背面；F，Ck-8的分生孢子；G，附著胞。標尺，C、F、G為100 μm。

Note: A-B, the upper and reverse of colony morphology of strain Ct-4 cultured on PDA medium for 6 days; C, conidia of Ct-4; D-E, the upper and reverse of colony morphology of strain Ck-8 cultured on PDA medium for 6 days; F, conidia of Ck-8; G, appressorium. Bars: C, F, G=100 μm.

圖3 車軸草彎孢菌和喀斯特炭疽菌在PDA平板上的菌落形態

Fig. 3 Morphological characteristics ofandcultured on PDA

2.4 分離病原菌的分子鑒定

以分離菌株Ct-4和Ck-8的基因組DNA為模板，用通用引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，擴增出約500～750 bp的PCR產物。序列測定顯示Ct-4的ITS序列長度為574 bp。用BLASTn在GenBank中進行同源性比較，結果（表2）表明Ct-4（登錄號為OM269041）與菌株KUC5010（登錄號為GQ241277.1）具有100%的相似性。通過構建ITS基因的系統發育樹（圖4）發現Ct-4與車軸草彎孢菌聚集在一起，形成一個獨立的分支。結合形態學特征與分子鑒定，確定菌株Ct-4為車軸草彎孢菌。

序列測定顯示Ck-8的ITS序列長度為566 bp。Ck-8的ITS序列（登錄號為OM269042）與屬菌株具有99.10%～100%的相似性。為了進一步明確菌株的分類地位，對菌株Ck-8的、、和序列進行擴增，獲得大小分別為242、733、229和299 bp的目的片段。將序列測序后提交到NCBI/GenBank（OM275478，OM275479，OM275480，OM275481）。同源性比對發現Ck-8的各個基因與具有99.13%～100%的相似性。利用ITS、、、和序列進行多基因聯合系統進化分析（序列登錄號信息如表2所示），結果顯示，菌株Ck-8與喀斯特炭疽菌位于同一分支（圖5）。結合形態學特征與分子鑒定，確定Ck-8為喀斯特炭疽菌。

2.5 病原菌的生物學特性

2.5.1 碳、氮源對病原菌生長的影響 菌株Ct-4和Ck-8在不同的碳、氮源培養基上的生長情況如表3、表4所示。菌株Ct-4在8種碳源和8種氮源培養基上均能生長，但在水溶性淀粉為碳源和牛肉膏為氮源的培養基上菌絲生長最快，培養5 d后菌落直徑分別為45.43和47.03 cm，顯著高于其他碳、氮源處理，說明菌株對其利用效果最好，而對葡萄糖為碳源以及纈氨酸為氮源的利用效果最差，菌落直徑分別為19.37和32.43 cm。菌株Ck-8對葡萄糖為碳源和牛肉膏為氮源利用效果最好，培養5 d菌落直徑分別為52.40和53.63 cm，而對半乳糖為碳源和硝酸鈉為氮源的利用效果最差，菌落直徑僅為32.67和35.73 cm。

圖5 基于ITS、ACT、TUB、GAPDH和CHS-1基因序列構建的菌株Ck-8 的系統發育樹

注：表中數據為平均數±標準差。不同字母表示經檢驗在<0.05水平差異顯著。下同。

Note: Data are mean±SD. Different lowercase letters on the bars indicate significant difference at<0.05 level by t test，respectively. Same below.

表4 不同氮源對Ct-4和Ck-8生長的影響

2.5.2 溫度對病原菌生長的影響 如圖6所示，菌株Ct-4和Ck-8的生長溫度范圍較廣，在10～30 ℃范圍內均能生長，菌株的最適生長溫度為20～30 ℃。在溫度為5 ℃時菌絲幾乎停止生長。在25 ℃時Ct-4和Ck-8都生長最快，培養5 d菌落直徑分別為44.30和58.63 cm，其中菌株Ct-4氣生菌絲發達，培養基顏色最深。

2.5.3 pH對病原菌生長的影響 如圖7所示，在pH 4～10時，菌株Ct-4和Ck-8均能生長，說明其對酸堿環境的適應范圍較寬，當pH為7時最適宜菌株Ct-4的生長，培養5 d菌落直徑為44.77 cm。當pH為7時，Ck-8的菌絲生長最快，培養5 d菌落直徑為55.10 cm。

3 討 論

本研究從疑似彎孢菌葉斑病和炭疽病的煙草植株上分離了2種病原真菌，經形態學特征觀察、分子鑒定和致病性試驗，確定了引起2種煙草葉部病害的病原分別為車軸草彎孢菌和喀斯特炭疽菌。

兩種病害都侵染煙草葉片，其中車軸草彎孢菌引起的煙草彎孢菌葉斑病病斑不規則，病斑外圍暈圈不明顯，且無黑色小粒點，這可以與另一種由引起的煙草葉斑病進行區分[25]。目前車軸草彎孢菌引起煙草葉斑病僅在貴州有報道[16]，我國其他地區還未見車軸草彎孢菌引起煙草病害的報道?？λ固靥烤揖Ｒ鸶黝愔参锾烤也?，如引起巴西的蘋果葉上炭疽病和墨西哥的鱷梨炭疽病[26-27]。在煙草上喀斯特炭疽菌只被報道在海南引起雪茄煙炭疽病[19]，目前還沒有在烤煙上引起病害的報道?？λ固靥烤揖鸬臒煵萏烤也“Y狀與近期本課題組在湖南報道的由蘭炭疽菌孢引起的煙草炭疽病[18]類似，因而本研究也將為明確煙草炭疽病病原種類及其科學防治提供重要參考依據。

注：A，菌株Ct-4；B，Ck-8。下同。

Note: A, strain Ct-4; B, strain Ct-4. Same below.

圖6 不同溫度對Ct-4和Ck-8生長的影響

Fig. 6 Effects of different temperatures on the mycelial growth of Ct-4 and Ck-8

圖7 不同pH對Ct-4和Ck-8生長的影響

本研究對車軸草彎孢菌菌株Ct-4和喀斯特炭疽菌Ck-8進行了最適碳源、氮源，溫度和pH等生物學性狀研究。研究表明，車軸草彎孢菌和喀斯特炭疽菌均能利用多種碳源和氮源。車軸草彎孢菌最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為牛肉浸粉，與何世芳等[28]研究結果一致?？λ固靥烤揖鷮ζ咸烟菫樘荚春团Ｈ飧酁榈蠢眯Ч詈?，研究結果與引起其他植物病害的同種病原存在差異[29]，可能是寄主、地理位置不同導致的。本研究發現車軸草彎孢菌和喀斯特炭疽菌最適生長溫度范圍都為20～30 ℃。何世芳等[28]報道引起煙草葉斑病的棒狀彎孢最適宜生長溫度為28 ℃，冉飛等[29]報道的引起百香果炭疽病的喀斯特炭疽最適生長溫度為25 ℃，與本研究結果基本一致。此外本研究中高溫有利于車軸草彎孢菌產生更多色素，使得培養基顏色更深，這也與何世芳等[28]、劉飛等[30]結果一致。菌株生長的適宜溫度范圍也與該病害在湖南春夏之交為高發期的規律相吻合。兩種病原菌均對酸堿環境適應范圍較廣，在pH 4～10內均能生長，在pH=7時最適宜菌絲生長，表明中性條件有利于菌絲生長。雖然本研究發現和報道了湖南煙草上的兩種葉部病害，但對于該類病害的發生規律、侵染機制、防控技術等仍需進一步研究。

4 結 論

本研究對湖南省兩種煙草葉部病害病原進行了鑒定。通過形態學和分子生物方法確定病原分別為車軸草彎孢菌和喀斯特炭疽菌。生物學特性研究表明，車軸草彎孢菌菌絲生長最適溫度為25 ℃，最適pH為7，以水溶性淀粉為碳源、牛肉膏為氮源時對菌絲生長最有利；喀斯特炭疽菌菌絲生長最適溫度為25 ℃，最適pH為7，以葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時對菌絲生長最有利。本研究為煙草彎孢菌葉斑病和炭疽病的識別和精準防控提供了參考依據，下一步將深入探究病害發生規律，確定關鍵防治時期，為這兩種病害的高效防治提供參考。

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Identification and Biological Characterization ofLeaf Spot and Anthracnose Diseases on Tobacco in Hunan Province

XIAO Yansong1, LI Sijun2, WU Wenxin2, LIU Tianbo3*, ZHOU Xiangping4, LI Ping5, ZHONG Jie5*

(1. Chenzhou Tobacco Company of Hunan Province, Chenzhou, Hunan 423000, China; 2. Guiyang Tobacco Company of Chenzhou in Hunan Province, Chenzhou, Hunan 424400, China; 3. Hunan Tobacco Science Research Institute, Changsha 410004, China; 4. Yongzhou Tobacco Company of Hunan Province, Yongzhou, Hunan 425000, China; 5. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

From 2020 to 2023, two foliar diseases suspected to beleaf spot and anthracnose were found on tobacco in Chenzhou City, Hunan Province. The objective of this study was to clarify the pathogens and provide theoretical reference for scientific and effective control of the diseases. The fungal pathogens were isolated from symptomatic leaves by tissue isolation and the diseases were identified to be leaf spot and anthracnose by both morphological observation and Koch’s postulates. Combined with the morphological characteristics and ITS based phylogenetic analysis, the pathogen of the tobacco leaf spot was determined to be, while the pathogen of the tobacco anthracnose was identified asusing both the morphological and molecular characteristics by ITS,,,andgene regions. The study of biological characteristics showed that the optimum temperature for mycelium growth ofwas 25 ℃, the optimum pH was 7, and it was most favorable for mycelium growth when soluble starch was used as carbon source and beef powder as nitrogen source. The optimum temperature for mycelium growth ofwas 25 ℃, the optimum pH was 7, and it was most favorable for mycelium growth when glucose was used as carbon source and beef powder as nitrogen source. To our knowledge, this is the first time that these two diseases are reported in Hunan Province of China. Up to now, there is no report ofcausing disease in flue-cured tobacco in China. The results can provide a basis for the scientific and effective prevention and control of these diseases.

;;leaf spot; anthracnose; tobacco pathogens

S435.72

A

1007-5119(2023)06-0044-09

湖南省郴州市煙草公司煙草農業科技創新項目（CZYC2022JS03）；中國煙草總公司湖南省公司科技重點項目（HN2021KJ01）；湖南省郴州市煙草公司煙草農業科技創新項目（CZYC2023JS05）

肖艷松（1981-），女，副研究員，主要從事烤煙栽培及植保技術研究。E-mail：xiaoyansong106@126.com*通信作者。E-mail：劉天波，tianboliu@126.com；鐘 杰，wzzhtx@sina.com

2023-06-07

2023-09-01

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.007