煙草未授粉子房離體培養誘導胚狀體的影響因素研究

曹景林，王 欣，程君奇，李亞培，吳成林，張俊杰，蔡長春

煙草未授粉子房離體培養誘導胚狀體的影響因素研究

曹景林，王 欣，程君奇*，李亞培，吳成林，張俊杰，蔡長春

（湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

源于未授粉子房的雌性單倍體在煙草育種利用價值上優于源于花藥或小孢子的雄性單倍體，開展煙草未授粉子房的離體培養對煙草單倍體育種具有重要意義。為了建立未授粉子房離體培養技術體系，分別以不同的雜種F1代為試材，采用HW培養基探討了消毒方法、接種方式、接種密度、無機鹽濃度、外源激素配比和瓊脂濃度6個關鍵因素對胚狀體誘導的影響。結果表明：花蕾不需剝開花瓣而直接放入0.1%升汞中浸泡8 min，剝開子房壁并橫切子房后接種，每個125 mL三角瓶中接種2塊子房，培養基中無機鹽濃度額外增加60%、附加IAA 0.5 mg/L和6-BA 2 mg/L或者附加KT 2.0 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L、瓊脂濃度9 g/L有助于對胚狀體的誘導。據此進一步完善了煙草未授粉子房離體培養過程中的技術參數。

煙草；未授粉子房；離體培養；胚狀體；影響因素

通過誘導單倍體再加倍能夠快速縮短育種時間，是目前作物快速、高效的育種途徑之一[1]。單倍體植株通?？梢杂苫ㄋ幓蛐℃咦芋w外培養誘導產生，稱作雄性單倍體；也可以由子房或胚珠離體培養誘導產生，稱作雌性單倍體[1-2]。與花藥或小孢子培養相比，經未授粉子房或未受精胚珠離體培養誘導的煙草雌性單倍體植株至少有3個獨特的優點：（1）煙草雄性單倍體經染色體加倍后往往產量和品質性狀劣變嚴重，而雌性雙單倍體不會造成產量和品質的劣變，若采用雜交種未受精的卵細胞培養，則獲得的雙二倍體品系與常規自交相似，因而比雄性單倍體更具有育種利用價值[3-5]；（2）由于未授粉子房或未受精胚珠離體培養不牽涉花粉，因而能夠適用于雄性不育植物[6]，即使單倍體植株經染色體加倍后得不到種子，也可利用組培技術繁殖種苗；（3）培養F1代的未授粉子房或未受精胚珠，可迅速獲得高純度種質資源，對提高種質資源利用率和育種效率具有理論研究和實際應用價值[7]?；诖?，國內外學者越來越重視煙草未授粉子房或未受精胚珠的離體培養，并在此方面做了許多探索性工作。

Burk等[8]于1979年開始煙草未授粉子房培養研究，并成功獲得了單倍體植株。祝仲純等[9-10]采用H培養基（附加生長素IAA 0.5 mg/L和細胞分裂素KT 2 mg/L）對普通煙草品種Copusyeusuheku No.4、NC2326和革新五號的未授粉子房進行了離體培養，采用N6培養基（附加生長素IAA 0.5 mg/L、細胞分裂素KT 6 mg/L、肌醇100 mg/L和蔗糖8 g/L）對大葉黃煙的未授粉子房進行了離體培養[11]，均獲得了單倍體植株。吳伯驥等[12]采用改良的H培養基（附加生長素IAA 0.5 mg/L和細胞分裂素KT 2 mg/L）對普通煙草品種柳葉煙、金星煙、黃苗榆和黃花煙草品種甘肅黃花煙的未授粉子房進行離體培養，也獲得了單倍體植株。潘莉等[13-14]曾以H培養基為基礎，探討了基因型、外源激素、蔗糖、活性炭、椰胚乳、光照強度等因子對單倍體誘導率的影響。本研究組也以H培養基為基礎，探討了未受精胚珠離體培養適宜的子房發育時期和培養基類型[3]。為了建立穩定的煙草未授粉子房離體培養技術體系，提高胚狀體誘導頻率，本研究對前人研究[3, 9-14]中尚未涉及的消毒方法、接種方式、接種密度、無機鹽濃度、其他外源激素配比、瓊脂濃度等技術因子對胚狀體誘導率的影響進行了探討，以期進一步完善煙草未授粉子房離體培養過程中的技術因素參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用云煙87×吉煙9號，K346×6388和Coker371Gold×龍江911這3個雜種F1代的未授粉子房為材料。為了保證整個試驗期間均能得到子房，將3個雜交組合F1代分三期于溫室內播種和盆栽，間隔60 d，采用的栽煙盆內徑為30 cm，每次盆栽100株。

1.2 試驗方法

根據本研究組先前的研究結果，選取花冠即將露出花萼時期的子房作為外植體[3]，以由吳伯驥等[12]改良的H培養基（用HW表示）為基本培養基，附加IAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L、瓊脂8 g/L 和蔗糖20 g/L。在未授粉子房的離體培養過程中，設置外植體不同消毒方法、接種方式和接種密度，以及培養基不同無機鹽濃度、外源激素配比和瓊脂濃度對胚狀體誘導影響的試驗。培養基中所有激素和氨基酸在滅菌前加入，并用40 g/L NaOH調節pH至5.5，高溫高壓滅菌15 min。采用125 mL三角瓶進行子房培養，每個三角瓶中倒入約30 mL培養基。胚狀體誘導培養在光照培養室中進行，培養溫度為（28±2）℃，光照強度為1500 lx，光照時間為12 h/d。培養過程中時常觀察子房發育狀況，培養25 d左右統計試驗結果。各試驗過程均在無菌條件下進行。

1.2.1 外植體不同消毒方法對胚狀體誘導的影響 以Coker371Gold×龍江911為材料，將所采集的花蕾分別采用以下4種方式進行消毒：（X1）不剝開花瓣，將花放入70%酒精浸泡30 s，0.1%升汞滅菌8 min；（X2）不剝開花瓣，將花放入0.1%升汞浸泡8 min；（X3）剝開花瓣，將子房放入70%酒精浸泡30 s，0.1%升汞滅菌8 min；（X4）剝開花瓣，將子房放入0.1%升汞浸泡8 min。接著用無菌水沖洗 3 次，對于采用方式X1和X2進行消毒的花蕾，在墊有濾紙的無菌培養皿上將花蕾基部橫切，用鑷子將子房從底部擠出，輕輕剝開子房壁，橫切子房后接種至HW培養基；對于采用方式X3和X4進行消毒的子房，用鑷子輕輕剝開子房壁，橫切子房后接種至HW培養基。每個三角瓶中接種2塊子房，每個處理接種5瓶。

1.2.2 外植體不同接種方式對胚狀體誘導的影響 以K346×6388為材料，將所采集的花蕾首先按X1消毒方式進行消毒處理，然后，在墊有濾紙的無菌培養皿上將消毒后的花蕾基部橫切，用鑷子把子房從底部擠出，分別按以下5種方式接種至HW培養基上進行培養：（S1）不剝開子房壁，直接接種至培養基；（S2）不剝開子房壁，橫切子房再接種至培養基；（S3）剝開子房壁，直接接種至培養基；（S4）剝開子房壁，橫切子房再接種至培養基；（S5）剝開子房壁，切碎子房后接種至培養基。每個三角瓶中接種2塊子房，每個處理接種5瓶。

1.2.3 外植體不同接種密度對胚狀體誘導的影響 以云煙87×吉煙9號為材料，將所采集的花蕾先按X1消毒方式進行消毒處理，然后采用S4接種方式將子房按以下5個不同密度分別接種至HW培養基上進行培養：（D1）1塊子房/瓶；（D2）2塊子房/瓶；（D3）3塊子房/瓶；（D4）4塊子房/瓶；（D5）5塊子房/瓶。每個處理接種20塊子房。

1.2.4 培養基不同無機鹽濃度對胚狀體誘導的影響 以云煙87×吉煙9號、K346×6388、Coker371Gold×龍江911為材料，將所采集的花蕾先按X1消毒方式進行消毒處理，然后采用S4接種方式將子房分別接種至如表1所示的3種培養基上進行培養。每個三角瓶中接種2塊子房，每個培養基接種20瓶。

1.2.5 培養基不同外源激素配比對胚狀體誘導的影響 以云煙87×吉煙9號為材料，將所采集的花蕾先按X1消毒方式進行消毒處理，然后采用S4接種方式將子房分別接種于附加有不同外源激素配比的HW培養基上。共設置如表2所示的16種外源激素配比。每個三角瓶中接種2塊子房，每個處理接種10瓶。

表1 培養基不同濃度無機鹽配方

1.2.6 培養基不同瓊脂濃度對胚狀體誘導的影響 以云煙87×吉煙9號為材料，將所采集的花蕾先按X1消毒方式進行消毒處理，然后采用S4接種方式將子房分別接種于瓊脂濃度不同的HW培養基上進行培養。瓊脂濃度設置4個不同的梯度：（A1）7 g/L；（A2）8 g/L；（A3）9 g/L；（A4）10 g/L。每個三角瓶中接種2塊子房，每個處理接種10瓶。

2 結 果

2.1 外植體不同消毒方法對胚狀體誘導的影響

外植體的不同消毒方法對胚狀體的誘導效果有所差異。從表3可以看出，4種消毒方法在子房污染率上差異不大，在2種不剝開花瓣處理X1和X2以及2種剝開花瓣處理X3和X4中，升汞滅菌前是否先用酒精浸泡對胚狀體誘導率也無太大影響。但是否剝開花瓣對胚狀體誘導率則有明顯影響，2種不剝開花瓣滅菌處理的胚狀體誘導率接近或達到90%；而2種剝開花瓣滅菌處理的胚狀體誘導率則明顯下降，分別為55.56%和77.78%。綜合來看，在4種消毒方法中，不剝開花瓣，也不用酒精浸泡，而將花蕾直接放入0.1%升汞中浸泡8 min為最優。

2.2 外植體不同接種方式對胚狀體誘導的影響

外植體接種方式不同，其對胚狀體誘導的影響也不同（表4）。不剝開子房壁而直接接種至培養基的方式未觀察到胚狀體產生，雖然接種5 d后子房有明顯膨大，但同時子房壁增厚，逐漸呈現翠綠色的玻璃化狀態，胚珠發育受到抑制，最后褐化死亡。不剝開子房壁，但橫切子房接種至培養基，5 d后子房膨脹，在切口處有胚狀體產生，但子房壁仍然變綠增厚、玻璃化嚴重，抑制胚珠發育。剝開子房壁，將整個子房接種至培養基，5 d后子房緩慢膨脹，胚珠雖有發育但比較緩慢，10 d后子房底部褐化嚴重。剝開子房壁，并將子房切碎成小塊接種至培養基，5 d后大部分外植體褐化死亡，胚狀體誘導率僅為30%。相比較而言，剝開子房壁，并橫切子房的誘導效果最好，接種5 d后，子房膨脹，胚珠也有明顯發育。接種10 d后，大部分子房能產生胚狀體，誘導率達到90%。

2.3 外植體不同接種密度對胚狀體誘導的影響

外植體的接種密度對胚狀體的誘導也有影響，統計結果（表5）表明，子房接種密度由1塊/瓶增加到2塊/瓶時，胚狀體誘導率由82.35%增加到90.00%。而后，隨著接種密度的增大，胚狀體誘導率開始逐漸下降，當接種密度增加到5塊/瓶時，胚狀體誘導率下降到52.94%?？梢?，采用2塊子房/瓶的接種密度最優。

表4 子房不同接種方式對胚狀體誘導的影響

表5 子房不同接種密度對胚狀體誘導的影響

2.4 培養基不同無機鹽濃度對胚狀體誘導的影響

培養基中的無機鹽濃度對胚狀體的誘導影響很大。從表6可知，3個雜種F1代的未授粉子房在3種培養基上培養的表現趨勢是一致的。當培養基中不另加無機鹽（即M1）時，3個雜種F1代的未授粉子房接種后很快白化，約20 d后大部分褐化死亡，胚狀體誘導率都較低，平均僅有7.88%。當培養基中的無機鹽濃度額外增加60%（即M2）時，3個雜種F1代未授粉子房離體培養的情況均有明顯好轉。子房接種5 d后就開始膨脹，15 d后能膨脹到直徑15 mm左右。胚狀體誘導率平均達到90.28%。當培養基中的無機鹽濃度加倍（即M3）時，3個雜種F1代未授粉子房接種5 d后均表現為膨脹，但10 d后部分子房褐化死亡，胚狀體誘導率較培養基M2均有所下降，平均為65.82%。綜上可見，HW培養基中的無機鹽濃度額外增加60%有助于對胚狀體的誘導。

此外，3個雜種F1代的未授粉子房在3種無機鹽濃度不同的培養基上進行培養，胚狀體誘導效果因未授粉子房供體材料不同而有所差異，K346× 6388 F1未授粉子房在不同培養基上的胚狀體誘導率除M1培養基外均最高，平均誘導率也最高，達58.89%，而Coker371Gold×龍江911 F1未授粉子房在不同培養基上的胚狀體誘導率均最低，平均為51.32%。

表6 不同無機鹽濃度對胚狀體誘導的影響

2.5 培養基不同外源激素配比對胚狀體誘導的影響

培養基中外源激素種類和配比不同，對胚狀體的誘導效果有很大差異。統計結果（表7）表明，在16種不同外源激素配比中，外源激素配比為IAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L和配比為KT 2.0 mg/L、2,4-D 0.5 mg/L的培養基誘導胚狀體的效果最好，誘導率均幾乎達到90%；其次是外源激素配比為IAA 0.5 mg/L、2,4-D 0.5 mg/L和配比為KT 2.0 mg/L、6-BA 2 mg/L，胚狀體誘導率在85%左右；而外源激素配比為IAA 1.0 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L，配比為IAA 1.0 mg/L、2,4-D 0.5 mg/L和配比為KT 2.0 mg/L、6-BA 1 mg/L的培養基誘導胚狀體的效果最差，誘導率均不超過50%?？梢?，在用HW培養基對煙草未授粉子房進行離體培養時，培養基中以附加IAA 0.5 mg/L和6-BA 2 mg/L或者附加KT 2.0 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L為佳。

表 7 不同外源激素配比胚狀體誘導的影響

2.6 不同瓊脂濃度對胚狀體誘導的影響

培養基中瓊脂濃度不同對胚狀體誘導也有影響。從表8中可知，培養基中瓊脂濃度為7 g/L的情況下，子房玻璃化率達到90.00%，因而胚狀體誘導率較低，僅有50.00%；隨著瓊脂濃度的增加，子房玻璃化現象逐漸減輕，胚狀體誘導率逐漸提高，當瓊脂濃度增加到9 g/L時，胚狀體誘導率最高，達89.47%；但隨著瓊脂濃度增加到10 g/L時，子房玻璃化現象雖然大幅減輕，但有相當部分子房很快褐化死亡，胚狀體誘導率反而下降到72.22%。綜合考慮，培養基中的瓊脂濃度應以9 g/L為宜。

表8 不同瓊脂濃度對子房玻璃化的影響

3 討 論

外植體的消毒影響著子房在培養過程中可能受污染的程度以及胚狀體誘導率的高低。在本研究條件下，各種消毒方法均有較好的滅菌效果，但是剝開花瓣滅菌處理會致使胚狀體誘導率下降，這說明滅菌處理溶液直接浸泡子房，可能會對子房的分化能力有一定的傷害。雖然升汞滅菌前先用酒精浸泡與不用酒精浸泡相比，對胚狀體誘導率無太大影響，但增加了滅菌步驟和成本?？梢?，一種好的消毒方法應該步驟簡單，既能有效滅掉外植體表面的雜菌，又不妨礙外植體的生長。

子房的接種包括接種方式和接種密度2個方面。祝仲純等[9-11]、吳伯驥等[12]和潘莉等[13-14]采用煙草子房直接接種能夠誘導出胚狀體，但本研究采用子房直接接種，很少有胚狀體產生，這主要是由于在培養過程中子房壁增厚，玻璃化嚴重，抑制了胚珠的發育。而去除子房壁后接種，則能觀察到許多胚狀體。這些結果與先前的研究[3]是一致的。本研究結果顯示，去除子房壁并橫切子房后接種，能獲得較好的胚狀體誘導效果，但若將子房切碎接種則胚狀體誘導率下降，這可能是由于外植體受損嚴重，毒性酚類物質或其氧化物醌類物質在培養基中積累并抑制了其他酶的活性[15]，致使外植體褐化死亡而導致的。關于煙草子房培養中的密度效應迄今未見報道。在本研究中，子房接種密度由1塊/瓶增加到2塊/瓶，可能更有助于培養基的條件化，致使子房組織釋放到培養基中的某些物質能夠促進子房多細胞結構的形成，進而誘導胚狀體的產生[16]。而當接種密度增加后，可能由于培養基營養供應不足，同時子房產生的有害次生代謝物增多，而致使子房褐化嚴重，胚狀體誘導率下降[15]。

培養基是未授粉子房離體培養成敗的關鍵。培養基中無機鹽成分是植物生長發育所必需的。無論前人采用H培養基或HW培養基，無機鹽成分及其濃度基本上沒有變化[9-14]。而本研究采用無機鹽濃度未改變的HW培養基時，很少有胚狀體產生，這可能是無機鹽營養不足所致。當增大培養基中無機鹽濃度時，情況明顯好轉，這說明在HW培養基中，采用更高的無機鹽濃度有利于對胚狀體的誘導。但無機鹽濃度額外增加到2倍時，胚狀體誘導率下降，這主要是由于鹽離子濃度過高而導致了部分子房褐化死亡[15]。培養基中添加外源激素在未授粉子房離體培養過程中也有利于胚狀體誘導[1,7,13,17]。在煙草子房培養中，常用的外源激素包括生長素類激素IAA、2,4-D和細胞分裂素類激素6-BA和KT[9-14]。祝仲純等[9-11]和吳伯驥等[12]采用IAA 0.5mg/L與KT 2 mg/L或KT 6 mg/L配合使用對煙草子房進行了離體培養。潘莉等[13]又探討了2,4-D和6-BA的不同濃度配比對煙草子房培養的作用。為了進一步篩選培養基中附加的有助于提高胚狀體誘導率的外源激素及其濃度，本研究在前人研究[9-14,17]的基礎上，又另外探討了IAA與6-BA，2,4-D與KT，以及IAA與2,4-D，KT與6-BA的不同濃度配比對子房培養的作用，結果顯示，生長素類激素同類配合或者細胞分裂素類激素同類配合使用對胚狀體的誘導效果總體上不如細胞分裂素類與生長素類激素的配合使用，這與前人的研究是一致的[7,9-14]。本研究中，IAA與6-BA以及2,4-D與KT采用適當的濃度配合使用，均有著較好的胚狀體誘導效果。這進一步說明不同種類激素合理的濃度搭配，對胚狀體的誘導是非常重要的[1,13,17]。培養基中的瓊脂作為支持物，利于各種外植體的培養。在本研究中，隨著瓊脂濃度的增加，玻璃化程度逐漸減輕，但瓊脂濃度過高時，胚狀體誘導率反而下降。這可能是由于瓊脂濃度低，使培養基內水勢過高，造成培養器皿內空氣濕度大，導致子房玻璃化，而增加瓊脂濃度，能夠降低培養基的水勢，減少培養基中子房可獲得的水分，因而可明顯減輕子房的玻璃化現象[18]。但瓊脂濃度過高時，會致使培養基太硬而不利于外植體吸收營養[18]，進而導致胚狀體誘導率下降。

4 結 論

以不同的雜種F1代為試材，分別建立了煙草未授粉子房離體培養過程中的消毒方法、接種方式、接種密度、無機鹽濃度、外源激素配比和瓊脂濃度6個因素的最佳技術參數。在進行煙草未授粉子房的離體培養過程中，花蕾不剝開花瓣而直接采用0.1%升汞浸泡8 min進行消毒，再剝開子房壁將子房橫切后接種，每個125 mL三角瓶中接種2塊子房，培養基采用改良的H培養基額外增加60%無機鹽，附加IAA 0.5 mg/L和6-BA 2 mg/L，或者附加KT 2 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L，瓊脂濃度9 g/L，能夠獲得較高的胚狀體誘導率。

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Study on the Factors Influencing the Induction of Embryoids byCulture of Unpollinated Ovary in Tobacco

CAO Jinglin, WANG Xin, CHENG Junqi*, LI Yapei, WU Chenglin, ZHANG Junjie, CAI Changchun

(Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China)

The utilization value of female haploids derived from unpollinated ovaries is superior to male haploids derived from anthers or microspores in tobacco breeding. Therefore,culture of unpollinated ovary is of great significance for tobacco haploid breeding. In order to establish the technique system forculture of unpollinated ovaries, different F1 hybrids were used as test materials to explore the effects of six key factors, including disinfection method, inoculation method, inoculation density, inorganic salt concentration, exogenous hormone ratio, and agar concentration, on embryoid induction in HW media. The results showed that the measures that contributed to the induction of embryoids were as follows: the buds were immersed in 0.1% HG solution for 8 min without peeling the petals, the ovary walls were peeled off and the ovaries were transected before inoculation, 2 ovaries were inoculated in each 125 mL triangular flask, and the inorganic salt concentration in HW media was increased by an additional 60%, with additional IAA 0.5 mg/L and 6-BA 2 mg/L, or KT 2.0 mg/L and 2,4-D 0.5 mg/L, and agar concentration of 9 g/L. Based on this, the technical parameters forculture of unpollinated tobacco ovaries were further improved.

tobacco; unpollinated ovary;culture; embryoid; influencing factor

S572.01

A

1007-5119(2023)06-0084-07

中國煙草總公司湖北省公司科技重點項目（027Y2022-021）

曹景林（1967-），男，博士，副研究員，主要從事煙草育種研究。E-mail：caojinglin670425@sohu.com。*通信作者，E-mail：424653@qq.com

2023-07-06

2023-11-01

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.012