HS-GC-IMS結合ROAV分析烤煙煙葉“糯米香”特征成分

李舒暢，李 軍，高憲輝，劉文霖，常詩瑜，歐澤潔，龐雪莉*，孔凡玉*

HS-GC-IMS結合ROAV分析烤煙煙葉“糯米香”特征成分

李舒暢1,2，李 軍3，高憲輝4，劉文霖5，常詩瑜1,2，歐澤潔1，龐雪莉1*，孔凡玉1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081；3.山東中煙工業有限責任公司，濟南 250014；4.云南省煙草煙葉公司，昆明 650218；5.貴州省煙草科學研究所，貴陽 550003）

為準確鑒定烤煙中“糯米香”特征風味化合物，以云南典型“糯米香”（NM）和非“糯米香”（CK）的云煙87煙葉為材料，采用頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）技術分析其揮發物的組成及相對含量；基于揮發物的相對氣味活度值（ROAV）和偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）等統計學方法，鑒定了“糯米香”特征關鍵標志風味化合物。結果表明，從供試煙葉共鑒定出57種揮發物（包括單體和二聚體），其中2-乙?；?1-吡咯啉（糯米香），苯乙醛（果香），壬醛（柑橘香）以及2,3-丁二酮（奶甜香）被鑒定為“糯米香”與非“糯米香”烤煙煙葉間的差異性特征風味化合物，其中2-乙?；?1-吡咯啉是“糯米香”特征的關鍵貢獻化合物，其余3種化合物對烤煙“糯米香”特征香韻具有重要的修飾作用。本研究可能為烤煙“糯米香”特征風味精準調控及評價方法開發提供數據基礎。

烤煙；糯米香；揮發性關鍵風味化合物；頂空-氣相色譜-離子遷移譜；相對氣味活度值；2-乙?；?1-吡咯啉

香氣是煙草品質評價的核心內容，香韻是煙氣所表現出的某種香氣韻調。煙草中常見的香韻有干草香、焦甜香、焦香、正甜香、木香、堅果香、辛香、清甜香、青滋香等[1]。近年來，煙草研究工作者以香氣品質為育種目標，培育出多種具有特色香韻的烤煙新品種。其中，具有獨特“糯米香”香韻的烤煙受到卷煙工業企業廣泛關注，該香韻特征被描述為濃烈的糯米香味。前人圍繞“糯米香”特征烤煙的化學成分和香氣組分開展了初步探究[2-4]，試圖解析烤煙“糯米香”特征的關鍵物質基礎?，F有大部分研究多采用GC-MS、LC-MS等常規手段分析化學成分的差異，均未明確鑒別出烤煙中“糯米香”特征風味的關鍵貢獻化合物。本研究組前期利用現代分子感官科學技術，基于氣相色譜嗅覺檢測/稀釋嗅聞技術（GC-O/AEDA）以及多維氣相色譜-高分辨質譜聯用技術（GC*GC-QTOF/MS），將烤煙煙葉“糯米香”特征成分初步鑒定為2-乙?；?1-吡咯啉[5]。但是，前期僅鑒定出一種特征風味化合物，“糯米香”烤煙煙葉中是否還存在其他特征風味化合物，需采用更高靈敏度和精確度的儀器分析手段結合統計學方法進行深入研究。

頂空-氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）是一種用于分離和鑒定復雜基質中痕量揮發性有機化合物的新型分析方法，可基于不同離子在電場中氣相遷移速度的差異來表征化學離子物質[6]。該方法以操作便捷的頂空方式進樣，無需復雜的樣品前處理，同時結合了氣相色譜（GC）的高分離能力和離子遷移光譜（IMS）的快速響應性能，具有響應速度快、靈敏度高、分析效率高、成本低廉等多重優勢[7-8]，該技術在煙草揮發物的鑒定[9]和揮發物差異分析[10]方面得到了較為廣泛地應用。為準確鑒定烤煙煙葉中“糯米香”特征風味化合物，對前期研究結果[5]進行補充驗證，本研究采用了更高靈敏度和精確度的HS-GC-IMS，引入相對氣味活性值的概念（ROAV），借助主成分分析、偏最小二乘法判別分析、聚類分析等統計學手段，對典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中差異性揮發物進行精確篩選和鑒定，以期明確烤煙“糯米香”特征風味的關鍵物質基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取云南曲靖地區大田長勢相同、成熟度一致的云煙87烤后煙葉，參照GB 2635—1992挑選中部橘黃1級（C1F）煙葉作為試驗樣品；經專業卷煙感官質量評吸委員會10位專家評吸鑒定，確定具有典型“糯米香”特征樣品（NM1、NM2）和非“糯米香”特征對照組（CK）樣品做為本研究試驗樣品。

1.2 儀器與試劑

2-乙?；?1-吡咯啉標準品（98%），加拿大TRC公司；其他香氣標準品均購自北京百靈威科技有限公司；C4～C9正構烷酮標準品（99%），美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇（色譜純），美國AVANTOR公司；FlavourSpec?風味分析儀（配有CTC自動頂空進樣器），德國G.A.S公司；電子天平（感量0.000?1 g），瑞士梅特勒托利多公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 煙葉樣品去脈、切絲后于30 ℃下干燥處理并研磨過篩（60目）。分別稱取0.5 g煙末樣品于頂空瓶中，80 ℃、500 r/min孵育15 min后，用氣密樣針（85 ℃）抽取頂空氣（500 μL）進行GC-IMS分析，每個樣品平行處理3次。

1.3.2 GC-IMS分析 不分流模式；MXT-5型色譜柱（15 m×0.53 mm×1.0 μm）；柱溫60 ℃；載氣/漂移氣為高純N2（純度≥99.99%）；載氣初始流速為2 mL/min，保持2 min，在20 min內線性上升至100 mL/min；漂移氣流速為150 mL/min，IMS柱溫45 ℃。

1.3.3 相對氣味活度值（Relative odor activity value, ROAV）計算 參照劉登勇等[11]方法，將對樣品總體風味貢獻最大的揮發性組分的ROAV定義為100，其他組分的ROAV值由下列公式計算得出：

式中，CT分別為各揮發物的相對含量（%）和對應的空氣中覺察閾值；stanstan分別為對整體風味貢獻最大揮發物的相對含量（%）和空氣中覺察閾值。通常認為，ROAV≥1的揮發物為待測樣品總體風味的主要貢獻者[12]。

1.3.4 供試煙葉揮發性組分定性、定量分析 通過正構烷酮校準保留時間，比對GC-IMS中內置NIST氣相保留指數數據庫和IMS遷移時間數據庫對典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉揮發性組分進行定性，并利用峰面積歸一法計算定性化合物的相對含量。

1.3.5 香味物質添加試驗 參照YCT 138—1998[13]，將一定濃度梯度的2-乙?；?1-吡咯啉乙醇溶液分別注入4組（10支/組）標準煙支中，以10支注入相同量無水乙醇的標準煙支作為空白對照，由10名專家級感官評價員采取9分制（強，7～9；中等，4～6；弱，1～3；無，0）對卷煙“糯米香”香氣強度進行量化評價。

1.4 數據處理

利用GC-IMS配套軟件VOCal查看譜圖，通過Library Search軟件進行定性分析，利用Reporter和Gallery Plot插件對指紋圖譜進行對比分析，采用SIMCA 14.1軟件進行PCA和OPLS-DA分析，采用IBM SPSS 27.0和Excel軟件進行數據分析及作圖。

2 結 果

2.1 典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中揮發性風味組分構成

由煙葉揮發性組分的GC-IMS二維譜圖（圖1）可知，典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉樣品揮發物的GC分離效果較好，且3組不同樣品中揮發物的種類大致相同，但不同樣品中揮發物的含量存在一定差異。如在保留時間為300 s、400 s和500 s時，均可觀察到斑點的顏色在不同樣品間出現了較為明顯的變化（圖1黃框所示），表明煙葉揮發物含量差異是形成烤煙“糯米香”特征風味的因素之一。

基于HS-GC-IMS分析，在3組供試樣品中共檢測到91種共有揮發物，其中57種得以準確定性（包括單體和二聚體）（表1），物質種類構成豐富，包括20種醛類、11種酮類、11 種含氮雜環類、8種酯類、2種酸類、2種醇類、2種醚類和1種含氧雜環類。由不同煙葉揮發物的含量分布指紋圖譜（圖2）可以直觀看出：典型“糯米香”與非“糯米香”烤煙煙葉中揮發物組成及含量分布呈現較大差異。具體來看，5-甲基-2(3H)-呋喃酮、2,6-二甲基吡啶、3-庚醇、2-甲基四氫呋喃-3-酮、壬醛、苯乙醛、E,E-2,4-庚二烯醛、2-乙基-5-甲基吡嗪、環己酮、丙烯酸丁酯、2-己烯醛、辛醛、E-2-辛烯醛、E,Z-2,6-壬二烯醛、異戊烯醛、醋酸甲酯、癸醛、糠醛、2,3-丁二酮、2-乙?；?1-吡咯啉等組分在試驗組中相對含量明顯高于對照組（圖2紅框所示，＜0.05）；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、丙酮、2-甲基丙烯醛、2-丁酮、1,4-二氧六環、苯甲醛、3-羥基丁酸乙酯、E-2-甲基-2-丁烯醛、異丁醇、γ-丁內酯、E-2-辛烯醛、3,5-二甲基-1,2-環戊二酮、5-甲基-2-庚烯-4-酮、苯甲酸乙酯、葫蘆巴內酯、二丙基硫醚、4-甲基-3-戊烯-2-酮、2-乙酰呋喃等組分的相對含量在對照組明顯高于試驗組（圖2黃框所示，＜0.05）。

圖1 典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中揮發性組分的GC-IMS二維譜圖

表1 基于HS-GC-IMS分析的典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中揮發性風味組分構成

表1 （續）

注：揮發性風味組分中的M為單體，D為二聚體，同行不同字母表示具有顯著差異（＜0.05），下同。

Note: “M”represents monomer and “D” represents dimer in volatile flavor compounds. Different letters indicate significant differences (< 0.05). The same as below.

圖2 典型“糯米香”與非“糯米香”烤煙煙葉中揮發性風味組分的指紋圖譜

2.2 基于相對氣味活性值（ROAV）的揮發性風味化合物的香氣貢獻評價

典型“糯米香”與非“糯米香”烤煙煙葉中相對氣味活性值（ROAV）≥1的香氣組分共14種（表2），其中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪在試驗組和對照組樣品中均呈現最高的氣味貢獻值（ROAV=100），其他較重要的共有香氣物質還包括壬醛、苯乙醛、2-乙?；?1-吡咯啉（ROAV＞10）?！芭疵紫恪笨緹煹年P鍵特征風味化合物的鑒定還需進一步綜合氣味屬性，對典型“糯米香”與非“糯米香”烤煙煙葉的差異風味化合物進行多維度篩選判別[14]。

表2 典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中揮發性組分的相對氣味貢獻值（ROAV）

注：覺察閾值數據參考GEMERT[15]，為空氣中的閾值。

Note: The sensory threshold data of aroma compounds refer to GEMERT[15], which is the threshold in the air.

2.3 基于OPLS-DA篩選典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉的標志性差異物

對三組樣品中揮發性組分的ROAV值進行偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），利用變量重要性投影值（Variable importance projection, VIP）篩選試驗組與對照組中的關鍵差異性風味化合物，將同時滿足VIP＞1且＜0.05的組分定義為不同“糯米香”香氣強度烤煙煙葉樣品的差異性標志物[16]。由圖3A和圖3B可以看出，對照組和試驗組中關鍵風味物質構成差異較大，其中2-乙?；?1-吡咯啉（VIP=3.000?32，糯米香，單體），苯乙醛（VIP=2.424?76，果香，單體），壬醛（VIP=1.774?07，柑橘香，單體），2,3-丁二酮（VIP=1.583?19，奶甜香），乙酸（VIP=1.509?22，酸味，單體）是關鍵差異風味組分（圖3B紅框所示）。模型置換驗證結果（圖3C）顯示，2(cum)=0.986，2(cum)=0.994，2(cum)=0.978，右側的2和2均高于左側，且2與軸交于負半軸，表明模型未出現過擬合現象，有較高的可信度和較好的預測能力。

圖3 典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中揮發性組分的OPLS-DA得分圖（A）、VIP值圖（B）、模型置換驗證圖（C）

2.4 典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉中差異性風味標志物的含量分布特征

由“糯米香”與非“糯米香”煙葉中差異性風味標志物的聚類熱圖（圖4）可知，除乙酸外，其余4種差異性風味標志物，包括2-乙?；?1-吡咯啉（糯米香）、苯乙醛（果香）、壬醛（柑橘香）以及2,3-丁二酮（奶甜香）在試驗組中的含量均顯著高于對照組。其中2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline, 2AP）擁有最高的ROAV值和最高的VIP值，且具有典型糯米香味特征，極有可能為烤煙“糯米香”特征的直接關鍵風味貢獻化合物，需進一步結合香味物質添加試驗對其香氣貢獻進行驗證。

2.5 2AP對“糯米香”風味貢獻的添加驗證

如表3所示，與對照相比，添加4個濃度梯度2AP的卷煙均產生了足以被實驗員感知到的糯米香味特征，且10名實驗員給出的香氣強度賦分值的相對標準偏差（RSD）僅為7%，表明數據的離散程度相對較小，結果具有較高的可信度，由此驗證了2AP對烤煙“糯米香”特征風味的直接貢獻作用，即2AP為烤煙“糯米香”的直接關鍵風味貢獻化合物。

圖4 典型“糯米香”與非“糯米香”煙葉標志性差異物的聚類熱圖

表3 卷煙香味物質添加試驗評吸結果

3 討 論

煙草的風味是由其香氣組分的含量及覺察閾值共同決定[17]，在分析關鍵風味化合物時不應局限于“以量定效”的原則[18]。相對氣味活度值法（ROAV）是一種基于覺察閾值和相對含量來客觀描述香氣組分對樣品香氣風格貢獻值的一種常用方法，可用來考察對樣品風格有決定性影響和修飾作用的香氣組分[19]，而將ROAV法與統計學分析方法結合，可實現復雜基質中特征香韻關鍵風味化合物的精確鑒定[20]。

本研究通過ROAV法結合PCA和OPLS-DA等統計學分析發現，2-乙?；?1-吡咯啉具有濃烈的糯米香味特征和極低的覺察閾值（0.02 μg/kg）[21]，是烤煙“糯米香”風味的關鍵化合物；苯乙醛、壬醛、2,3-丁二酮也是“糯米香”與非“糯米香”的關鍵差異風味組分。2-乙?；?1-吡咯啉為含氮雜環類堿性物質，驗證了李振杰等[4]研究中相比于普通烤煙，典型“糯米香”烤煙含有更多的堿類物質的結果。李勇等[2]、張志明等[3]和焦天雷等[22]在烤煙“糯米香”特征香韻解析研究中都曾提出，苯乙醛、壬醛等醛類化合物在典型“糯米香”烤煙中占比較高，這一結論也與本研究的結果相吻合。

烤煙“糯米香”香韻的香氣構成十分豐富，除了類似糯米的香氣特征最為突出，還包括了甜香、花香等香氣特征[23]。壬醛、苯乙醛、2,3-丁二酮均為前人報道的煙草重要香氣成分，呈現果香、花香和奶甜香等香氣特征，有助于掩蓋雜氣、削弱刺激、改善吃味、增強回甘[24-25]，可協助彰顯烤煙典型“糯米香”香韻風格特征，對烤煙“糯米香”特征香韻具有重要的修飾作用。由于煙草整體香韻風格的產生并非各香氣組分的簡單加和，而是通過復雜的協同作用形成。因此，3種不具有直接“糯米香”貢獻的差異醛酮類香氣化合物（壬醛，苯乙醛，2,3-丁二酮）是否可以和2AP協同作用，進一步彰顯烤煙“糯米香”風味特征，還需通過閾值法、S型曲線法、OAV法等香氣協同作用研究方法進行深入研究。另外，前人均證實高含量的生物堿類物質是“糯米香”烤煙的主要化學特征，因此，今后還可圍繞生物堿類前體與2AP轉化的關聯性開展深入剖析。

4 結 論

本研究基于HS-GC-IMS和揮發物閾值信息，明確了典型“糯米香”和非“糯米香”烤煙煙葉中揮發性風味化合物組分構成、分布特征和相對氣味貢獻（ROAV）?；赗OAV值和統計學分析，篩選出4種烤煙“糯米香”特征的標志風味化合物，其中2-乙?；?1-吡咯啉（糯米香）具有最高的相對氣味活度值（ROAV）和最高的變量重要性投影值（VIP），是烤煙“糯米香”特征的直接關鍵貢獻化合物；壬醛（柑橘香）、苯乙醛（果香）以及2,3-丁二酮（奶甜香）有助于掩蓋雜氣、削弱刺激、改善吃味、增強回甘，對烤煙“糯米香”特征香韻具有重要的修飾作用。研究采用更高靈敏度和精確度的儀器分析手段結合統計學方法，對前期研究結果進行了補充驗證，可為烤煙糯米香特征風味精確評價方法創新開發及基于分子育種技術的糯米香特征風味調控研究提供數據支撐和理論基礎。

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Analysis of Characteristic “Glutinous Rice”-like Aroma-active Odorants in Flue-cured Tobacco Leaves Based on HS-GC-IMS Combined with ROAV

LI Shuchang1,2, LI Jun3, GAO Xianhui4, LIU Wenlin5, CHANG Shiyu1,2, OU Zejie1, PANG Xueli1*, KONG Fanyu1*

(1.Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3.China Tobacco Shandong Industry Co., Ltd., Jinan 250014, China; 4.Yunnan Tobacco Leaf Company, Kunming 650218, China; 5.Tobacco Science Institute of Guizhou Province, Guiyang 550003, China)

In order to accurately identify the potent odorants in flue-cured tobacco (FCT) leaves with “glutinous rice”-like characteristic, different Yunyan 87 tobacco leaves with or without typical “glutinous rice”-like characteristic from Yunnan province were used as materials in this study. Firstly, volatile compositions and their relative content was analyzed by headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy (HS-GC-IMS). Then, the differential volatile markers between typical “glutinous rice”-like and non-“glutinous rice”-like tobacco leaves samples and the key chemical contributors to the “glutinous rice”-like characteristic were identified based on the relative odor activity value (ROAV) combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA). A total of 57 common odorants (including monomers and dimers) were identified. 2-Acetyl-1-pyrroline (“glutinous rice”-like), benzene acetaldehyde (fruity), nonanal (citrus-like), and 2,3-butanedione (sweet, buttery) are characterized as differential flavor compounds between typical “glutinous rice”-like and non-“glutinous rice”-like tobacco leaves samples, among which 2-acetyl-1-pyrroline is a key contributor to “glutinous rice”-like aroma, the other three compounds play an important role in modifying “glutinous rice”-like characteristic flavor of FCT. The results herein would provide chemical basis for the accurate regulation and the evaluation method development for “glutinous rice”-like characteristic odorants in FCT.

flue-cured tobacco; “glutinous rice”-like aroma; volatile key odorants; headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy (HS-GC-IMS); relative odor activity value (ROAV); 2-acetyl-1-pyrroline

TS41+1

A

1007-5119(2023)06-0075-09

中國農業科學院科技創新工程（ASTIP-TRIC07）；中國煙草總公司云南省公司科技項目（2021530000241011）；中國煙草總公司貴州省公司科技項目（2021520000240044）

李舒暢（1999-），男，在讀碩士研究生，研究方向：食品質量與安全。E-mail：3242309079@qq.com*通信作者。E-mail：龐雪莉，pangxueli@caas.cn；孔凡玉，kongfanyu123@126.com

2023-08-01

2023-10-23

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.011