小清蛋白陽性抑制性中間神經元與視覺發育可塑性的研究進展△

楊詩巧 郝 瑞 張 偉

目前研究發現,大腦皮層主要存在谷氨酸能興奮性投射神經元和γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性中間神經元(INs)[1]。GABA-INs在大腦皮層中的占比相對較少,在人腦皮層中僅占30%～45%,在獼猴腦皮層中占20%～25%[2],在小鼠和大鼠腦皮層中占20%～30%[3-5], 但由于其短樹突的形態特點,主要產生局部神經回路,故對大腦皮層中興奮性/抑制性網絡平衡的維持至關重要。

INs根據其表達分子不同分為四種類型:小清蛋白(PV) 陽性、生長抑素(SST)陽性、血管活性腸肽陽性以及卷軸蛋白陽性INs[6]。其中PV+INs和SST+INs同起源于腹側端腦皮質下區內側神經節隆起(MGE)和視下區[3-7]。本文就PV+INs在視皮層發育中的作用進行綜述,以期能夠為視皮層可塑性研究提供一定的指導。

1 PV+中間神經元的發育和分型

人胚胎孕第6周開始出現神經節隆起,此時中間神經元祖細胞向皮層遷移;至孕8周,MGE初步形成;孕14周時,神經節隆起區中間神經元祖細胞大量產生;在孕8～14周時MGE表達轉錄因子LHX6的細胞切線遷移至皮層[8-9],該轉錄因子激活依賴于NKX2-1,而NKX2-1表達受上游音猬因子通路調節,其下游轉錄因子SOX6表達促進PV+INs的成熟及最終定位[8,10];孕16～20周,不同亞型中間神經元在皮層區域大量出現,而不同的轉錄因子表達SST、PV、神經肽Y、鈣網膜蛋白或鈣結合蛋白促進這一過程發生。研究發現,PV+INs和SST+INs的產生并非同時進行,孕22 d小鼠,SST先于PV產生,此過程受核素受體TFs CoupTF2調控,E11.5 d(即胚胎期 11.5 d)和E14.5 d時CoupTF2缺失引起出生后PV+INs增多,而E12.5 d時該受體功能的缺失則導致出生后SST+INs減少,從而表明CoupTF2在小鼠E11.5 d和E14.5 d時抑制MGE的中間前體細胞向PV+INs的分化[11-12],但是否存在其他核素受體調控PV+INs和SST+INs分化和發育尚待進一步研究。此外,神經營養因子、膠質源性神經營養因子等均在PV+中間神經元遷移中起精細調控作用[13-14]。

PV+INs依據細胞形態分為兩種亞型:籃狀細胞和吊燈狀細胞;前者出現較早,后者的功能目前存在爭議。有研究顯示,吊燈狀細胞對靶向的錐體神經元產生興奮效應[15]。INs中特異性PV的表達在出生后開始,目前尚未明確早期PV+INs的特征性標志物[14],因此,控制PV+INs向籃狀細胞和吊燈狀細胞分化的機制亦有待進一步研究。

2 PV+INs與視皮層可塑性及視覺發育關鍵期的關系

PV+INs在控制錐體細胞興奮、維持神經網絡平衡以及生物節律等方面起著重要作用。出生后隨著視覺發育及周圍環境的刺激,以及突觸增多,PV+INs 逐漸成熟,神經網絡穩態也隨之建立。其主要分布在大腦新皮層的L5/6,在L1中幾乎沒有。PV對鈣離子和鎂離子具有高親和性,在動作電位后可使細胞回到靜息電位,從而促進PV+INs的成熟[16]。而PV+INs本身動作電位的激發是連續或延遲的,單個動作電位的激發具有快尖峰動力特征,具有較小或者中等大小的輸入阻抗以及較大的超極化后電位[1,7],這樣的電生理特征使其突觸反應十分迅速,也表示了其代謝高且易受氧化應激損傷的特質。研究表明,PV+INs在快速動眼睡眠時活性增加,且在維持大腦清醒狀態中起重要作用,這主要與成熟的PV+INs形成穩定神經網絡和γ振蕩有關[17-18]。PV+INs主要投射在錐體神經元的胞體和近端樹突,相比其他INs,其與錐體神經元距離最近,具有更強的抑制性支配。PV+INs對其他INs幾乎沒有抑制作用,但被SST+為主的其他INs抑制性支配[19]。PV+INs參與視皮層可塑性調控的相關機制見圖1。

PNNs:周圍神經網;BDNF:腦源性神經營養因子;ErbB:受體蛋白酪氨酸激酶;TrkB:酪氨酸激酶;P75NRT:神經生長因子受體;Eph:蛋白酪氨酸激酶亞家族;Sema:信號素。圖1 PV+INs參與視皮層可塑性調控機制圖

2.1 PV+INs-未成熟的周圍神經網穩固狀態的破壞

正常小鼠出生后第2周,視皮質中開始表達PV,PV+INs也在此時出現較為穩定的固有膜特性(膜電阻、膜電容和靜息電位),同時,未成熟的周圍神經網(PNNs),即視皮層內主要包裹PV+INs的細胞外基質成分被首次觀察到[20];出生后第3周時,其數量及增長速度漸趨穩定[21](圖2)。貓視皮層的研究進一步表明,PV+INs數量在關鍵期后仍繼續增長,而PNNs比PV+INs發育晚兩周,但成年后二者數量基本穩定,PV+INs數量占皮層神經細胞數量的10%～20%,占全部INs總數的40%左右[22-23]。研究表明,部分PV+INs的成熟觸發了關鍵期的開啟,至關鍵期結束,70%PV+INs周圍包裹著PNNs,85%的PNNs包裹著PV+INs[24],此時PV+INs的抑制作用也達到最大[25-26]。Xia等[27]認為這種變化是由于成熟的PNNs抑制了PV的表達導致的。視皮層可塑性也隨著關鍵期的結束維持在低水平。Carstens等[26]認為,成熟的PNNs抑制神經元軸突生長以及作為屏障阻斷某些神經遞質而發揮限制可塑性的功能,通過消除PNNs能夠重新恢復成人視皮層可塑性,同時觀察到PV+INs動作電位發生變化。

圖2 PV+INs和PNNs發育趨勢圖

PV+INs的幼稚化能夠觸發關鍵期開啟[26],其特征性改變為PNNs結構完整性破壞和皮質中γ振蕩降低或消失[28],PNNs使其包裹的PV+INs軸突生長受限。其中發揮作用的因子是同源蛋白Otx2,一種能夠促進PV+INs成熟的蛋白,從而加速關鍵期關閉。而Otx2-AA型小鼠(Otx2結合位點突變)幼年關鍵期出現延遲,表明Otx2對可塑性的調控是雙向的, Otx2產生于視網膜,而視皮層中的PV+INs能夠優先募集Otx2離不開PNNs上的特異性復合糖,短暫的PNNs消除實驗中無法觀察到PV+INs電生理的改變,只有當Otx2濃度下降時,PV+INs電生理特性才隨之改變,此時可塑性發生改變[27]。因而,成年期PV+INs-PNNs的互相穩固離不開Otx2的介導[29],目前具體的結合位點仍在研究。同時敲除四種組成PNNs的硫酸軟骨素蛋白多糖可以引起僅限于V1的PV+INs數量減少,但Otx2仍能被PV+INs內化,可能是由于殘余的PNNs中存在Otx2的結合位點[30]。

目前提出一種PNNs成分蛋白聚糖可能為其作用位點[25]。除了Otx2,關鍵期長達10 d的暗飼養能夠降低蛋白聚糖濃度,從而減少視皮層PNNs含量,包裹PNNs的PV+INs體積縮減了19%,但數量幾乎不受影響,而未包裹PNNs的PV+INs體積縮減了17%,二者沒有顯著差異[22]。體積變小可能是由于細胞膜蛋白聚糖的缺失, PV+INs體積的改變在可塑性變化中發揮的作用有待進一步研究,但可以肯定的是,PNNs本身完整性的破壞不會直接引起可塑性的改變,其上一些復合糖才是關鍵期的開關,例如蛋白聚糖的裂解促進皮質發生可塑性變化,PNNs的降解聯合感覺剝奪才能引起可塑性的改變證實這一點[23]。研究發現,內源性蛋白酶對蛋白聚糖有直接靶向作用,PV+INs作為體內絲氨酸類組織型纖溶酶原激活物(tPA)的主要來源之一,通過細胞自主纖溶酶原依賴途徑降解包裹在周圍的PNNs,條件性敲除PV+INs的tPA后,PNNs密度增加[31],病理狀態下tPA-纖溶酶系統參與皮質可塑性[32],目前激發PV+INs釋放tPA的因子尚待探索,而其他的內源性蛋白酶可作為未來研究方向。簡言之,PV+INs在特定條件下釋放內源性蛋白酶tPA,激活纖溶酶原系統作用于PNNs的蛋白聚糖,繼而降解PNNs?？紤]到蛋白聚糖也是Otx-2的作用位點,tPA降解PNNs可能減少Otx-2的募集從而恢復皮質可塑性。

除了Otx-2和tPA,神經營養因子參與關鍵期可塑性也被認為和蛋白聚糖有關[33]。神經營養因子是一類神經元生長發育所必需的蛋白質,主要包括腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-4、膠質細胞源性神經營養因子等。其中BDNF及其受體蛋白酪氨酸激酶(ErbB)、酪氨酸激酶2(Ntrk2,TrkB)在誘導PV+INs成熟方面的作用已被證實,依賴于經典Nrg1/ErbB(TrkB)信號通路,該信號通路表達下調可以觀察到成年小鼠中視皮層具有幼年可塑性[34],而蛋白聚糖促進這一通路表達,意味著限制視皮層可塑性。

PV+INs表觀遺傳學修飾也能影響可塑性。Rett綜合征為一種甲基-cpg結合蛋白2(Mecp2)突變的X連鎖基因遺傳病,主要表現為嚴重的神經發育障礙,在PV+INs中條件性敲除Mecp2的小鼠(PV-Mecp2-/y)不會產生Rett綜合征的大多行為,但在出生后26～30 d眼優勢可塑性完全消失[35],表明PV+INs的去甲基化導致小鼠原本的關鍵期可塑性消失。Patrizi等[36]研究顯示,PV+INs Mecp2條件性敲除的小鼠在出生后15 d開始顯現出PV+INs的增多,伴隨著成熟型PNNs、更大的自發抑制電流的出現,這有利于抑制性網絡形成,過早出現眼優勢轉移。因而,推論出在PV+INs特異性敲除Mecp2小鼠關鍵期提前使其在出生后26～30 d期間而單眼剝奪無法誘導出眼優勢轉移。

總之,PV、PV+INs和PNNs的數量與關鍵期的可塑性變化趨勢呈負相關,從而表明:(1)PV+INs的成熟是經驗依賴性的;(2) PV+INs控制著視覺發育關鍵期的開始和關閉。至此,抑制性回路形成,突觸結構穩定,視皮層神經網絡中興奮-抑制達到平衡,關鍵期結束,視皮層可塑性被限制;反之,其中任何一個因素受到干擾發生改變,都會導致關鍵期開啟。

2.2 PV+INs通過錐體神經元影響突觸可塑性

大腦皮層中PV+INs與錐體神經元通過突觸形成前饋抑制和反饋抑制。局部興奮性突觸機制的研究表明,PV+INs與錐體神經元之間興奮性回路的形成依賴于經典的Nrg1/ErbB4信號通路,其活性變化受Nrg1濃度影響,而該信號通路的高表達是視覺發育關鍵期的“剎車”[13,37],但亦有研究發現其高表達只是限制了成人可塑性,將皮質可塑性維持在極低水平,Nrg1抑制劑可誘導眼優勢轉移,改善弱視成年期大鼠視力[37-38],但PV+INs中的Nrg1來源尚不明確。

不同于興奮性突觸,ErbB4介導的錐體神經元抑制性突觸形成不依賴于酪氨酸激酶依賴的經典通路,其作為細胞黏附分子與抑制性突觸后膜特異性標志物slitrk3相互作用,阻斷該過程可導致抑制性突觸減少,從而使得抑制回路形成缺陷[39]。Winkel等[40]提出酪氨酸激酶TrkB的光激活降低了PV+INs興奮性,引起抑制性突觸標志物突觸結合蛋白2Syt2的表達減少,降低了前饋抑制作用,從而激活可塑性。相較于局部錐體神經元,Kloc等[41]提出來自丘腦外側膝狀體的長程投射神經元更強烈地激活 PV+INs,而Ribic等[42]則提出一種細胞黏附分子SynCAM1介導該興奮性突觸形成,阻斷該分子作用同樣可以再激活成年視皮層可塑性。

以上均是在視皮層L4中觀察到的結果,而單眼剝奪能夠使L2/3的錐體神經元與PV+INs間興奮性突觸短暫失活,這種失活表現為全或無[43],但不同于L4中Nrg1的作用,其失活是由神經中樞蛋白2介導。單眼剝奪引起的PV+INs短暫的突觸失活導致的抑制作用下降被認為是后期皮質發生可塑性變化的基礎[44]。

此外,細胞骨架動力學說表明,p75NTR上調激活Rho/ROCK信號通路,誘導細胞骨架重組、細胞遷移和應力纖維形成,抑制PV+INs軸突生長和突觸形成,發揮類似作用的還有促紅細胞生產素和腦信號蛋白信號素[45]。

2.3 PV+INs本身與視皮層可塑性的聯系

一定濃度的PV和PV+INs的成熟是啟動關鍵期的重要因素,主要原因可能是PV+INs本身膜電阻以及靜息膜電位的改變,也就是內在可塑性發生變化[45],關鍵期前成熟PV+INs數量減少必然會影響關鍵期開啟。 EHMT1基因敲除的小鼠,其睜眼時間推遲且V1中PV+INs成熟延遲,從而引起關鍵期開始延遲,并且可持續到出生后100 d[46]。上述提到BDNF等通過TrkB激活下游PI3激酶信號通路。此信號可能由Rho GTPase家族介導作用于肌動蛋白,從而強烈刺激MGE起源的中間神經元的切向遷移,早期發育時BDNF的濃度降低會導致包括PV+在內的中間神經元數量減少[34]。另一種觀點認為,ErbB4在中間神經元向皮層發育遷移的過程中發揮十分重要的作用,其敲除導致成年小鼠中INs的數量顯著下降,但不依賴于ErbB4活性[46],此外是否存在其他機制尚不明確。

PNNs對PV+INs有保護作用,PV作為一種鈣結合蛋白對細胞內Ca2+有親和作用,作為鈣離子緩沖劑介導細胞恢復靜息電位,其缺失導致細胞內Ca2+病理性堆積,從而引起PNNs降解以及PV濃度降低,機體對氧化應激損害敏感[16]。在敲除生物鐘基因CLOCK和(或)BMAL1的大鼠中觀察到CLOCK/ BMAL1復合體的缺失,抑制了上游基因表達和細胞內cAMP/蛋白激酶A信號通路,導致氧化物堆積,誘導PV+INs的損傷[47]。上述PV+INs的缺失多在認知功能障礙疾病中被證實,其誘導的認知功能減退和皮層幼稚化不僅和神經網絡興奮/抑制失衡息息相關,其與視覺系統可塑性的關聯性值得我們探究。

3 探索PV與其他類型神經元對視皮層可塑性的影響

SST+INs與PV+INs同起源于MGE,且數量達GABA-INs的20%～30%,許多免疫組織化學染色結果顯示,SST+INs分泌的GABA能神經遞質和SST蛋白少數直接作用于PV+INs的胞體和近端樹突,而大部分以膜接觸的形式傳遞信號,減少PV+INs上的興奮性突觸來降低抑制性,提高V1錐體神經元興奮性,改變視皮層神經元活動以及神經網絡穩定性[48]。

除了中間神經元,大腦皮質中另一類神經細胞——膠質細胞也參與視皮層可塑性的變化。其中,在重復麻醉劑量氯胺酮恢復小鼠視皮層可塑性的研究中,證實了反應性小膠質細胞和PV+INs相互作用,用藥后短時間內可觀察到反應性小膠質細胞吞噬PNNs片段,這個過程可能通過MMP-9分解PNNs[28],三者之間的具體作用機制仍待研究。

4 基于PV+INs與視皮層可塑性的弱視治療方法

弱視是一種由于雙眼信息輸入不平衡導致的疾病,通常伴有大腦視皮層結構和功能改變,關鍵期視皮層可塑性的存在有利于糾正這種輸入錯誤,因而在關鍵期治療弱視具有重要意義,重現關鍵期的可塑性一直以來是眼視覺科學研究的重點。

經顱直流電刺激被認為是治療弱視有效的無創措施[49],在大鼠實驗中發現該治療方法能夠增加PV+INs的數量且有效改善弱視眼視力。多次麻醉劑量氯胺酮在小鼠實驗中被證實能夠在不產生精神分裂等嚴重副作用下恢復視皮層可塑性,且停藥后不影響PNNs再形成;給予視皮層60 Hz光刺激也能達到上述效果,這為無創干預弱視治療提供了新思路[28]。PV+INs中條件性ErbB4敲除提示在成年期應用ErbB4抑制劑減少興奮性突觸,降低PV+INs興奮性,可用以治療成年弱視[39]。但有學者認為,抑制劑的應用僅僅只是提高可塑性,而移植胚胎MGE的中間神經元才能重新激活關鍵期,并在出生后 192 d 的小鼠中實現了視皮層關鍵期的激活,該過程與受體PV+INs上的ErbB4有關[50-51]。此外,體育活動也能提高視皮層可塑性,促進弱視大鼠視力的恢復,盡管PV+INs在該過程中活性沒有變化,但生長因子的表達增強[52],表明外環境可塑性可能發生改變。

此外,Galuske等[53]認為,視覺皮層的可塑性是由神經元振蕩局部控制的;而神經元振蕩是由PV中間神經元的活動調節的,氯胺酮的應用和TrkB激活使包含gamma(γ)、theta (θ)、 alpha (α)和 beta (β)在內的神經振蕩都有不同程度增強[41],成人視皮層關鍵期可塑性重啟,但目前PV+INs產生的γ神經振蕩與可塑性缺乏直接的聯系。

5 結束語

PV+INs在皮層和海馬區發揮重要作用,前人的研究普遍集中在海馬區的認知障礙性疾病如阿爾茨海默病,近年來越來越多的文獻肯定了其在視覺皮層發育中關鍵期可塑性的價值。鑒于特異性標志物PV與PV+INs膜固有特性密切相關,其在發育過程中參與視皮層關鍵期的機制鮮有研究;目前多是關注PV+INs外周環境如PNNs的改變。關于去除PNNs是否提高PV+INs的興奮性仍存在爭議,Balmer等[54]認為,PNNs提高了PV+INs的興奮性;而在用硫酸軟骨素去除PNNs的實驗中觀察到PV+INs興奮性增強,明確了硫酸軟骨素介導的可塑性不完全與突觸可塑性相同。此外,皮層中仍有15%未包裹PNNs的PV+INs[22],它們在關鍵期可塑性調控中的作用仍待探索。盡管目前有關PV+INs治療極少應用于臨床,但我們仍要思考激活視覺皮層可塑性帶來的問題:長期未關閉的關鍵期不利于雙眼的圖像整合[55],從而影響高級視覺功能如立體視覺,因此,激活關鍵期可塑性的最長時限是作為干預手段投入臨床治療弱視的一大挑戰。