基于環境DNA宏條形碼的漢江上游黃金峽段魚類多樣性研究

丁洋 李艷艷 趙進勇,? 彭文啟 張晶 任錦豪

北京大學學報(自然科學版) 第60卷 第1期 2024年1月

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 60, No. 1 (Jan. 2024)

10.13209/j.0479-8023.2023.080

中國水科院“城鄉水系生態景觀構建理論和技術研究創新團隊”項目(WE0145B042021)和水利部重大科技項目(SKR-2022052)資助

2022–12–07;

2023–06–19

基于環境DNA宏條形碼的漢江上游黃金峽段魚類多樣性研究

丁洋1,2李艷艷3趙進勇1,2,?彭文啟1,2張晶1,2任錦豪1

1.中國水利水電科學研究院, 北京 100038; 2.水利部京津冀水安全保障重點實驗室, 北京 100038; 3.北京大學地球與空間科學學院, 北京 100871; ?通信作者, E-mail: zhaojy@iwhr.com

2020 年, 采用環境 DNA 宏條形碼對漢江上游黃金峽魚類多樣性進行研究, 并對比歷史調查數據, 構建漢江上游黃金峽段魚類名錄。從 9 個采樣點中共檢測出 20 種魚類, 占名錄的 45.45%; 鯉魚()、鯽魚()、圓吻鲴()和銀鮈()為優勢種; 黃金峽上、下游 Shannon 指數存在顯著性差異(<0.01,=9), 上游魚類 Shannon 指數明顯大于下游, 黃金峽水利樞紐是造成魚類多樣性空間差異的主要原因。環境 DNA 檢測出的魚類組成與過去傳統方法監測的結果相近。環境 DNA 宏條形碼技術是一種新興的生物監測手段, 可以輔助傳統魚類監測方法, 快速檢測漢江上游魚類多樣性及其空間分布。

環境 DNA 宏條形碼; 魚類多樣性; 漢江上游黃金峽段

河流、湖泊和濕地是地球上生物多樣性最豐富的地方之一, 它們以僅占地球表面 1%的面積, 貢獻了全球 50%的魚類多樣性[1]。魚類多樣性是生物多樣性的重要組成部分, 保護魚類多樣性有利于維持水生態系統的穩定與健康。但是, 目前針對魚類多樣性的研究缺乏足夠的調查工作[2]。2021 年, 世界自然基金會(WWF)和世界自然保護聯盟(IUCN)等 16 個組織聯合發布的報告指出, 已知有 80 種淡水魚類滅絕, 其中僅 2020 年就滅絕 16 種, 1970 年以來, 淡水洄游魚類的數量下降 76%, 大型淡水魚類的數量下降 94%[3]。取水、引水以及農業擴張和集約化等人類活動是對淡水供應量和質量的主要威脅因素, 而生境破碎化和流量變化通過改變河流和洪泛區湖泊等, 成為對淡水生物多樣性的主要威 脅[4–5]。在淡水魚類多樣性喪失日益嚴重的背景下, 掌握魚類多樣性現狀變得尤為重要[6]。

傳統的魚類調查方法(拖網、圍網、電捕魚、釣魚、水聲和視覺等)耗時費力, 價格昂貴, 可能對魚體造成傷害, 并對調查人員具有較高的分類學知識要求[7]。目前, 基于環境 DNA 宏條形碼(environ-mental DNA metabarcoding, eDNA metabarcoding)技術的物種檢測徹底改變了生物多樣性調查的方式, 被證明是一種高效、經濟和非侵入性的生物監測方法[8]。環境 DNA 宏條形碼技術通過直接從環境樣本(例如沉積物、糞便、水、土壤或空氣)中提取DNA, 利用識別魚類種群的通用引物進行 PCR 擴增和高通量測序, 確定魚類的種類和相對豐度, 并計算不同區域的魚類多樣性[9–10]。監測過程無需采集目標生物, 極大地簡化了魚類檢測步驟, 彌補了傳統形態學監測的不足[11]。環境 DNA 宏條形碼在魚類物種多樣性分析、外來入侵魚類物種足跡追蹤和瀕危珍稀魚類資源調查中表現出明顯的優勢和巨大的潛能。Sales 等[7]利用環境 DNA 宏條形碼, 監測和分析巴西熱基蒂尼奧尼亞河流域魚類群落的時空動態。Robson 等[12]利用環境 DNA 宏條形碼檢測熱帶入侵魚類物種。Song 等[13]利用環境 DNA 宏條形碼, 定量地計算水流特征對亞洲鯉魚入侵檢測概率的影響。國內利用環境 DNA 宏條形碼開展魚類多樣性調查的研究目前較少, 但也針對魚類資源、物種多樣性及瀕危珍稀魚類資源調查開展了一些研究。Wang 等[14]利用環境 DNA 宏條形碼評價我國東海大黃魚資源。舒璐等[15]基于環境 DNA 宏條形碼研究洱海魚類多樣性。吳昀晟等[16]對比環境 DNA宏條形碼與傳統調查法對長江江豚的檢測結果, 證明環境 DNA 宏條形碼在長江江豚監測中不僅具有較高的準確性, 還具有更高的靈敏性。

漢江是長江最大的支流, 上游緊依中國南北分界線(秦嶺–淮河線)的南界, 是重要的水源涵養生態功能保護區, 也是中國南水北調中線工程和引漢濟渭工程的水源地[17–20]。典型的山地生態系統決定了漢江上游生態環境的敏感性和脆弱性, 極易受到人為干擾和氣候變化的影響[21]。目前針對漢江魚類的調查研究多集中在中下游地區[22–24], 對漢江上游魚類多樣性的調查研究鮮有報道。隨著長江流域重點水域“十年禁漁”措施的全面啟動[25], 漢江作為禁捕水域之一, 傳統的魚類調查方法不再適用于該區域。

基于上述背景, 本研究首次利用環境 DNA 宏條形碼, 對漢江上游黃金峽段魚類多樣性的空間分布特征進行調查分析, 旨在探討環境 DNA 宏條形碼技術在檢測漢江上游魚類多樣性可行性, 為漢江上游魚類多樣性監測及生物資源估算提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 生物監測點位選擇

漢江發源于陜西省寧強縣, 自西向東流經陜西省內漢中、安康兩市, 并于安康市白河縣流出陜西省。漢江上游流域位于亞熱帶季風氣候區, 年均氣溫為 13.2℃, 多年平均降雨量為 895mm[26]。本次調查區域位于引漢濟渭水源地——黃金峽水利樞紐上游及下游, 涉及漢中市洋縣和西鄉縣。于 2020 年11 月 13 日至 16 日進行采樣, 分別選取 9 個采樣點, 樣點編號及位置見圖 1。其中, 在黃金峽水利樞紐壩上布設 5 個采樣點(S1～S5), 壩下布設 4 個采樣點(S6～S9); 漢江干流全長約 100km, 設置 6 個樣點, 漢江支流黨水河、金水河及子午河各設一個樣點。

1.2 環境DNA樣品采集及環境DNA測定

使用 2.5L 的采水器, 在每個樣點采集表層水和底層水各 1L, 混合后保存至已消毒的 2L 廣口瓶中。所有樣品均在 24 小時內使用 0.45μm 的混合纖維素濾膜(MCE; Whatman公司)進行真空抽濾, 玻璃抽濾漏斗在每次抽濾前用 10%的次氯酸鈉消毒液浸泡30 分鐘, 并用純凈水沖洗干凈, 防止樣品間的交叉污染。為評估是否存在外源 DNA 污染, 每次過濾設置一個陰性對照。樣品過濾后, 富集環境DNA 的濾膜分別裝入 5mL 的離心管中, 于?20℃保存, 并盡快送往實驗室進行 DNA 提取。濾膜送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行環境 DNA測定、PCR 擴增及高通量測序。

1.3 歷史數據調查

通過對照洋縣水利局魚類資源數據, 整理得到漢江上游黃金峽段魚類名錄。

2 結果與分析

2.1 物種組成

通過環境 DNA 宏條形碼檢測, 從 9 個采樣點的樣品中共得到有效拼接序列 542400 條, 注釋出魚類20 種, 隸屬 3 目 7 科 18 屬(表 1)。各采樣點魚類物種及其相對序列豐度見圖 2, 采樣點與魚類物種關系如圖 3 所示。各采樣點的魚類物種組成存在明顯的差異, 其中鯉科(如鯽魚、鯉魚和花魚骨)在各采樣點均顯示出相對較高的序列豐度。

2.2 歷史調查數據

通過收集洋縣水利局魚類資源數據, 統計得到魚類 37 種, 屬于 4 目 7 科 30 屬。其中, 鯉形目物種數最多, 有 30 種, 占比為 81.08%; 其次是鱸形目, 有 5 種, 占比為 13.51%; 鲇形目有兩種, 占比為5.41%; 鯰形目有一種, 占比為 2.70%。結合環境DNA 宏條碼的檢測結果, 最終統計得到魚類 44 種, 屬于 4 目 8 科, 整理得到漢江上游黃金峽段魚類名錄, 見附錄(訪問 http://xbna.pku.edu.cn 查看附錄)。

從圖 4 可以看出, 由歷史調查數據和環境 DNA宏條形碼共同檢測出的魚類共 13 種, 占總種數的29.55%; 僅由歷史調查數據統計得到的魚類共 24種, 占總種數的 54.54%; 僅由環境 DNA 宏條形碼檢測出的魚類共 7 種, 占總種數的 15.91%。

僅由環境 DNA 宏條形碼檢測出的魚類為激流馬口鱲(_sp._ZF-11309)、福建小鰾鮈(_)、紅尾副鰍(_)、圓尾擬鲿(_)、大鰭鳠(_)、神農吻蝦虎魚(-)和真吻鰕虎魚(_)。

2.3 物種空間分布

根據研究區位置, 將采樣點分為黃金峽水利樞紐上游區域和下游區域(簡稱黃金峽上游、黃金峽下游)。t 檢驗方法顯示(圖 5), 黃金峽上下游 Shannon指數存在顯著性差異(<0.01,=9), 黃金峽上游魚類 Shannon 指數明顯大于下游?；诓蓸狱c中魚類物種序列豐度數據, 利用 Wilcoxon 秩和檢驗方法, 檢驗黃金峽水利樞紐上下游魚類物種差異的顯著性。由圖 6 可以看出, 黃金峽上游及下游魚類物種差異明顯。黃金峽下游魚類監測物種均為鯉科, 以圓吻鲴(41.56%)、鯉魚(32.65%)和銀鮈(25%)為主; 黃金峽上游魚類監測物種以鯽魚(34.32%)、鯉魚(13.92%)和波氏吻鰕虎魚(11.09%)為主, 且鲇魚、斷線麥穗魚、激流馬口鱲、馬口魚、花魚骨、細紋頜須鮈和紅尾副鰍等魚類物種均有涉及。

圖2 各采樣點魚類物種相對序列豐度

圖3 各采樣點與魚類物種關系Circos圖

表1 漢江上游黃金峽段9個采樣點環境DNA宏條形碼注釋魚類物種

灰色區域代表本研究環境 DNA 宏條碼所檢測物種, 白色區域代表歷史調查數據

圖5 黃金峽上下游 Shannon 指數組間差異

圖6 各采樣點魚類物種空間差異

3 討論

3.1 基于環境DNA宏條形碼的漢江上游黃金峽段魚類多樣性檢測

本研究運用環境 DNA 宏條形碼技術分析漢江上游黃金峽段魚類多樣性, 共檢測出 20 種魚類, 魚類物種以鯉科居多, 共 12 種, 占魚類物種總數的 60%, 其中鯉魚、鯽魚、圓吻鲴和銀鮈為優勢種。對比漢江上游黃金峽段魚類名錄, 在 9 個采樣點位利用環境 DNA 宏條碼檢測出 20 種魚類, 占名錄的 45.45%, 表明環境 DNA 宏條碼具有較高的準確率。此外, 有 7 種魚類未出現在歷史統計數據中, 如激流馬口鱲(spZF-11309)、福建小鰾鮈()和紅尾副鰍()等小型魚類?？赡苁怯捎跐h江上游黃金峽段魚類調查數據十分稀少, 導致本研究魚類目錄收集不完整, 因此部分檢測物種未出現在歷史調查數據中。環境 DNA 宏條形碼技術能克服傳統調查方法的一些局限性, 對傳統捕撈方法進行補充觀測, 從而減少傳統調查方法觀測不到位導致的生物多樣性下降情況。

1980—1982 年, 陜西省動物研究所等機構的研究人員在石泉大壩以上干支流共采集到 61 種魚類, 種類組成同樣以鯉科魚類為主, 占物種總數的63.93%[27]。王曉臣[28]在 2010—2012 年開展整個漢江陜西段的魚類調查, 在石泉大壩以上干支流共采集 63 種魚類, 種類組成以鯉科魚類為主, 占物種總數的 64.52%, 以棒花魚、麥穗魚、寬鰭眠、馬口魚及鲇魚為優勢物種。采樣點涉及的河段為歷史調查河段的一部分, 可能是本研究檢測出的魚類種數不如傳統漁獲物方法監測的魚類種數多的主要原因, 但檢測出的魚類組成與過去傳統方法監測的結果相近, 并均顯示魚類以鯉科為主, 占物種總數的 60%左右。盡管低豐度魚類物種的 DNA 難以采集, 但可以通過增加采樣點和采樣次數等方式, 提高檢測率[29]。

3.2 漢江上游黃金峽段魚類空間分布分析

黃金峽下游檢測的魚類物種僅有鯉科, 其中圓吻鲴、鯉魚和銀鮈等靜水性魚類為優勢物種?，F場調研發現, 黃金峽下游取樣點為石門水庫庫區回水區, 屬靜水區域, 水面寬, 流速小且穩定, 水位較高, 水流對河岸坡棲息地的沖蝕能力較弱。受水庫回水的影響, 原有的河道失去急流、淺灘和較大的蜿蜒度[30], 破壞了喜急流性魚類的棲息環境, 因而黃金峽下游中急流性魚類數目減少, 靜水性魚類數目相應地增加, 以圓吻鲴、鯉魚和銀鮈為主的靜水魚類在黃金峽下游區域占主導地位, 魚類多樣性較低。黃金峽上游檢測魚類物種包括鯉科、鰍科、鲿科、鲇科、鱧科和鰕虎魚科, 涵蓋所有檢測出的魚類科目, 魚類多樣性高。其中, S1 和 S5 采樣點分別位于漢江支流黨水河和金水河, 為山區溪流河道, 受地勢起伏及河流蜿蜒等因素影響, 水流流態多樣, 生境復雜多樣, 底質條件顯著差異, 地貌單元復雜多樣[31], 因而這兩處采樣點檢測出的魚類多樣性高, 且種類也包括急流性魚類及靜水性魚類。黃金峽水利樞紐的建設及截流, 在很大程度上阻斷了上下游的魚類活動, 影響魚類壩上與壩下的遷移交流, 同時大壩極大地影響魚類的生存環境(改變棲息地的物理和生態特征, 如改變水流、營養動態、水質和溫度)[32–34]。水利工程的建設是造成魚類多樣性及物種的差異的主要原因。

3.3 漢江上游環境下段環境DNA宏條形碼技術對比原始調查方法的優劣性探討

與傳統的魚類監測方法相比, 環境 DNA 宏條形碼技術在魚類物種鑒定及多樣性評估等方面具有明顯的優勢。1)非破壞性采樣: 少量的水樣采集不會危害當地瀕危魚類, 也不會破壞當地生態環境; 2)無采樣限制: 不受禁漁期和禁漁區的限制, 可以根據研究需求設置監測點位; 3)高效便捷, 節約成本。環境 DNA 宏條形碼技術使用 2 L 左右的水樣便可實現多個分類單元的快速鑒定, 可減少船只租賃或購買漁獲物的費用, 無需依賴形態學和分類學的專業知識[35–36]。

在實際分析中, 需要考慮采樣點上游環境 DNA輸移的影響。受環境 DNA 輸移的影響, 某個采樣點的魚類檢測結果不一定意味著在采集時魚類個體就在此處, 可能導致對采樣點魚類豐富度的高估。因此, 本研究位于河口的采樣點(S1 和 S5)檢測出的高魚類多樣性需要進一步驗證。河口處受到支流上游來水和干流頂托來水的雙重影響, 流速減緩, 泥沙沉積明顯, 導致環境 DNA 可能存在于水體中, 也可能與表層沉積物結合, 同時受環境 DNA 的輸移和積累影響, 較高濃度的環境 DNA 可能有助于沉積物中 DNA 分子的再懸浮, 從而影響在空間和時間尺度上魚類物種及多樣性的推斷。然而, 由于在漢江上游水環境中還沒有進行過有關環境 DNA 輸移和擴散的研究, 很難就這一問題得出可靠的結論。因此, 開展環境 DNA 的時空動力學研究有助于更精確地使用環境 DNA 宏條形碼技術來檢測魚類多樣性。

4 結論

本研究首次使用環境 DNA 宏條形碼技術評估漢江上游黃金峽段魚類多樣性, 證明了該技術監測漢江上游魚類物種組成和魚類空間分布情況的可行性。環境 DNA 方法可作為評估研究區魚類多樣性可靠的補充方法, 為漁業資源的調查和保護提供新的視角。本文結論如下: 1)通過環境 DNA 宏條形碼技術和歷史調查數據構建漢江上游黃金峽段魚類名錄, 環境 DNA 宏條形碼技術檢測出 20 種魚類, 占名錄的 45.45%, 魚類物種以鯉科居多, 占魚類物種總數的 60%, 其中鯉魚、鯽魚、圓吻鲴和銀鮈為優勢種; 2)與黃金峽下游相比, 黃金峽上游魚類多樣性較高, 黃金峽水利樞紐是造成魚類多樣性空間差異的主要原因; 3)在今后魚類監測過程中, 應開展環境 DNA 的時空動力學研究, 可減少環境 DNA 宏條形碼技術檢測的不確定性。

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Investigating Fish Diversity in Huangjinxia Section of the Upper Hanjiang River Based on Environmental DNA Metabarcoding

DING Yang1,2, LI Yanyan3, ZHAO Jinyong1,2,?, PENG Wenqi1,2, ZHANG Jing1,2, REN Jinhao1

1. China Institute of Water Resources and Hydropower Research, Beijing 100038; 2. Key Laboratory of Water Safety for Beijing-Tianjin-Hebei Region of Ministry of Water Resources, Beijing 100038; 3. School of Earth and Space Sciences, Peking University, Beijing 100871; ? Corresponding author, E-mail: zhaojy@iwhr.com

In 2020, Environmental DNA Metabarcoding was used to study the fish diversity in the Huangjinxia section of the upper Hanjiang River, and the historical survey data were compared to construct a fish list in the Huangjinxia section of the upper Hanjiang River. A total of 20 fish species were detected from 9 sampling sites, accounting for 45.45% of the list;,,andare the dominant species. The Shannon index of fish in the upper and lower reaches of the Huangjinxia was significantly different (< 0.01,=9), and the Shannon index of fish in the upper reaches was significantly larger than that in the lower reaches. The main reason for the spatial differences in fish diversity is the Huangjinxia hydraulic hub. The fish composition detected by environmental DNA was similar to that obtained by traditional methods. As an emerging biomonitoring tool, environmental DNA macrobarcoding technology can complement traditional fish monitoring methods to rapidly detect fish diversity and its spatial distribution in the upper reaches of the Hanjiang River.

environmental DNA metabarcoding; fish diversity; Huangjinxia section of the upper Hanjiang River