薄荷McZFP1基因克隆及表達分析

鄭曉薇, 柏 楊, 亓希武, 于 盱, 房海靈, 李 莉, 劉冬梅, 梁呈元

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室, 江蘇 南京 210014〕

薄荷(MenthacanadensisLinn.)隸屬于唇形科(Lamiaceae)薄荷屬(MenthaLinn.),為常見的藥用草本植物,其地上部分干燥后可入藥,主要歸肺經和肝經,具有疏風散熱、清利頭目和疏肝行氣等功效,主治風熱感冒和風溫初起等癥狀[1]。薄荷的莖和葉均密布腺毛,是產生、分泌及貯存薄荷精油的重要部位[2-3]。薄荷精油是其主要藥用成分[4],具有抑菌、抗菌和保鮮等作用,也可作為重要香料在食品和日用化工等領域廣泛應用[5]。

土壤鹽堿化、干旱、高溫、冷害以及洪澇等非生物脅迫會限制植物生長,降低作物產量。薄荷屬植物在生長過程中易受到鹽、干旱和高溫等脅迫的影響,這不僅危害其正常的生長發育,還會導致精油產量的嚴重下降,甚至明顯改變精油成分[6-8]。薄荷對鹽漬化土壤有一定的適應性,但過量的鹽分不利于其正常生長,甚至導致植株死亡[9]。在鹽脅迫下,辣薄荷(Mentha×piperitaLinn.)精油合成代謝反應中的基因表達和酶活性等均受到抑制,導致精油產量顯著下降[10]。干旱脅迫會嚴重抑制辣薄荷的生長發育,降低精油產量,并影響精油成分的豐富程度[11]。嚴重的滲透脅迫會抑制辣薄荷葉片氣體交換,改變植物細胞結構特征,造成細胞水平上的損害,并降低辣薄荷精油的含量和質量[12]。此外,在一定溫度范圍內,薄荷屬植物精油產量隨著溫度的升高而降低,其主要成分薄荷醇含量顯著降低,但胡薄荷酮含量升高[8]。為了應對非生物脅迫,植物進化出復雜的調控機制,主要通過激活或抑制一系列轉錄因子的表達來調節[13-15]。目前已發現一些轉錄因子參與了植物對非生物脅迫的生理反應,主要包括脫水應答元件結合因子(dehydration-responsive element binding factor,DREB)、乙烯應答元件結合因子(ethylene-responsive element binding factor,ERF)、V-Myb禽成髓細胞瘤病毒癌基因同源物(V-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)、堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)和鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)等[14-19]。

鋅指蛋白是一類在植物基因轉錄中發揮重要調控作用的DNA結合蛋白,其結構域中的半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)殘基與Zn2+配位形成穩定的“手指”狀結構,該結構通過與DNA特異性結合,直接調節靶基因的表達[20-21]。根據鋅指蛋白中Cys和His殘基數目和順序的不同,可將鋅指蛋白轉錄因子家族分為C2H2、C8、C6、C3HC4、C2HC、C2HC5、C4、C4HC3和CCCH 9大類[22]。C2H2型鋅指蛋白轉錄因子家族是目前研究最為深入的家族之一,其含有植物特有的QALGGH保守序列,可與其他轉錄因子家族結合,或協同各類植物信號激素共同發揮作用,調控植物的多個生物學過程,包括營養生長、生殖發育、光調節形態建成、逆境響應和激素信號轉導等[20-24]。目前已有許多研究報道了ZFP參與調控植物的非生物脅迫反應。例如:擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕C2H2型鋅指蛋白轉錄因子基因AtZFP3的過表達誘導了脅迫相關基因KIN1、RD22、RD29B和AtP5CS1的表達,增強了植物對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性,而擬南芥zfp3突變體對鹽脅迫的耐受性則顯著降低[25]。在煙草(NicotianatabacumLinn.)和水稻(OryzasativaLinn.)中,過表達水稻基因OsZFP182可增強植株的抗鹽性;過表達OsZFP252的轉基因水稻植株中游離脯氨酸和可溶性糖含量升高,脅迫防御基因的表達量增加,比野生型有更高的鹽和干旱脅迫耐受能力[26-27],[28]65-70。

目前,有關薄荷鋅指蛋白轉錄因子基因的研究尚未見報道。通過分析作者所在課題組茉莉酸甲酯處理的薄荷轉錄組數據,克隆獲得1個鋅指蛋白轉錄因子基因Unigene0033253,根據其蛋白質序列分析了結構特征、理化性質及系統進化關系,并分析了該基因編碼蛋白的亞細胞定位和轉錄自激活活性,繼而檢測該基因在薄荷不同組織以及NaCl、甘露醇、脫落酸和茉莉酸甲酯處理后的表達變化,以期為進一步研究該薄荷基因的生物學功能提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試薄荷生長于江蘇省中國科學院植物研究所資源圃(東經118°49′50″、北緯32°03′33″)。于2022年8月上旬,從長勢基本一致的3株野生型薄荷(約5個月株齡)上分別采集不定根、莖、根狀莖、幼葉、成熟葉和花(盛花期),即為3個生物學重復。所采集的樣品迅速用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱,待用[29]。另取長勢基本一致的薄荷莖尖于透明玻璃瓶中水培生根,約2～3 d換1次水,置于溫度25 ℃、光照度30 000 lx、光照時間16 h·d-1的植物培養室中培養14 d,然后分別進行高鹽(150 mmol·L-1NaCl)[10]、干旱(300 mmol·L-1甘露醇)[30]、200 μmol·L-1脫落酸[30]和200 μmol·L-1茉莉酸甲酯[31]水培處理。每處理3株,即為3個生物學重復。分別于處理0、2、4、8、12和24 h對其幼葉和不定根取樣,液氮速凍后,提取RNA。

供試本氏煙草(NicotianabenthamianaDomin)和擬南芥〔哥倫比亞生態型(Col-0)〕種子均由作者所在實驗室保存。將本氏煙草種子播撒于泥炭土-蛭石(體積比1∶1)混合基質(南京壽德生物科技有限公司)中,生長1個月后用于瞬時表達實驗;擬南芥種子在MS培養基上生長1周后移栽至泥炭土-蛭石(體積比1∶1)混合基質中,生長2個月后用于侵染實驗。

1.2 主要試劑

Eastep?Super總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產品有限公司);兩步法RT-qPCR(去基因組)試劑盒、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase和平末端/TA兼容性入門克隆試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);2×GS AntiQ qPCR SYBR Green Fast Mix(北京金沙生物科技有限公司);NaCl、甘露醇、MES monohydrate、SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit、SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit、乙酰丁香酮、卡那霉素和大觀霉素〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕;限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ(美國New England Biolabs公司);大腸桿菌感受態DH5α、根癌農桿菌感受態GV3101、酵母感受態Y2H Gold(北京擎科生物科技股份有限公司);酵母基礎培養基Minimal SD Base(上海諾寧生物科技有限公司);氨基酸缺失混合物DO Supplement -Trp和DO Supplement -Ade/-Trp/-His(上海懋康生物科技有限公司);脫落酸(上海如吉生物科技發展有限公司);茉莉酸甲酯(上海麥克林生化科技股份有限公司);Murashige & Skoog (MS) Basal Medium with Vitamins(美國Phyto Technology Laboratorise公司);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液、X-α-gal和表面活性劑L-77(北京酷來搏科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆及載體構建 薄荷幼葉總RNA提取按照RNA提取試劑盒說明書操作,檢測質量后根據反轉錄試劑盒說明書合成第1鏈cDNA。根據作者所在課題組已有的茉莉酸甲酯處理的薄荷轉錄組數據(NCBI登錄號SRP132644)中檢索到的cDNA序列,設計特異性引物Unigene0033253-SF和Unigene0033253-SR(表1)。以得到的薄荷幼葉cDNA為模板,PCR擴增Unigene0033253全長基因。PCR反應體系總體積50 μL,包含Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、2×Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix 1 μL、上游和下游引物各2 μL、cDNA 1 μL以及ddH2O 18 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s,35個循環;72 ℃復性7 min。4 ℃保存。PCR產物經質量體積分數1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用DNA膠回收試劑盒將目的片段回收,連接到作者所在實驗室通用載體pCE2 TA/Blunt-Zero上,37 ℃金屬浴反應5 min,加入大腸桿菌感受態DH5α并混勻,冰浴30 min,42 ℃水浴熱激45 s,加入LB液體培養基,于160 r·min-1搖床中培養1 h后均勻涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的固體培養基上,然后置于37 ℃培養箱過夜培養;挑選單菌落,PCR驗證后得到陽性克隆,交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 用于薄荷McZFP1基因克隆和功能研究的引物及其序列

1.3.2 生物信息學分析 利用NCBI的Open Reading Frame Finder在線程序(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析McZFP1cDNA序列的開放閱讀框;利用Protparam在線工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析McZFP1的理化性質,包括理論相對分子質量、氨基酸組成、蛋白質穩定性以及理論等電點等相關參數;利用DNAMAN軟件比對分析McZFP1及其同源蛋白的氨基酸序列;利用MEGA11.0軟件,采用最大似然(maximum likelihood)法構建McZFP1及其同源蛋白的系統進化樹。利用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析McZFP1的二級結構;通過ProtScale網站(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸的親水性和疏水性;通過SMART網站(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)分析McZFP1的功能結構域;利用TMHMM在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析McZFP1是否具有跨膜性;通過NetPhos-3.1網站(https:∥services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)預測McZFP1的磷酸化位點[32]。

1.3.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析 根據McZFP1cDNA序列設計qRT-PCR引物McZFP1-qF和McZFP1-qR,內參基因McActin的引物為McActin-qF和McActin-qR(表1)。按照實時熒光定量PCR試劑盒的說明書對薄荷不同組織以及不同處理下幼葉和不定根中McZFP1的表達量進行分析。PCR反應體系總體積20 μL,包含上游和下游引物各1 μL、2×GS AntiQ qPCR SYBR Green Fast Mix 10 μL、cDNA 1 μL及ddH2O 7 μL。使用BIO-RAD CFX-Opus 96熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)進行PCR反應,反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s、60 ℃退火及延伸共30 s,40個循環;72 ℃采集熒光信號。每個樣品3個技術重復。采用2-ΔΔCT法[33]計算相對表達量。

1.3.4 載體構建 構建35S:McZFP1-GFP和pGBKT7-McZFP1(BD-McZFP1)2種表達載體,分別用于分析McZFP1的亞細胞定位和轉錄自激活活性。pHellsgate-GFP載體經限制性內切酶XhoⅠ酶切后,回收獲得其線性化載體,使用引物McZFP1-GFP-F和McZFP1-GFP-R(表1)擴增目的片段,利用同源重組技術構建35S:McZFP1-GFP表達載體。pGBKT7載體經限制性內切酶EcoRⅠ酶切后,獲得其線性化載體,使用引物BD-McZFP1-F和BD-McZFP1-R擴增片段,利用同源重組方法構建pGBKT7-McZFP1(BD-McZFP1)表達載體。目的片段的擴增、回收、連接目的載體、轉化大腸桿菌以及單菌落驗證等步驟同“1.3.1”。

1.3.5 亞細胞定位 利用在線工具CELLO2GO(http:∥cello.life.nctu.edu.tw/cello2go/)預測McZFP1的亞細胞定位[32]。通過根癌農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達技術[34]確定McZFP1蛋白在細胞中的分布情況。轉化測序正確的35S:McZFP1-GFP質粒至根癌農桿菌感受態GV3101,經抗性篩選及菌落PCR驗證后,將陽性單菌落接種于含50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1大觀霉素的LB液體培養基中,28 ℃恒溫搖床培養至菌液OD600值為1.0,于4 ℃、5 000 r·min-1離心5 min,收集菌體,用配制好的侵染液〔包含10 mmol·L-12-(N-嗎啉代)乙烷磺酸一水、10 mmol·L-1MgCl2和200 μmol·L-1乙酰丁香酮,pH 5.6〕重懸至OD600值約1.0。使用注射器將菌液注射到生長狀態好的本氏煙草葉片背面,暗培養3 d后,取適當大小的葉片組織,用稀釋50～100倍的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液染色1～2 h后,使用Zeiss激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)分別在波長488和405 nm激發光及明場下觀察并拍照。

1.3.6 轉錄自激活活性驗證 按照產品說明書分別轉化pGBKT7-McZFP1(BD-McZFP1)、pGBKT7空質粒(BD-plasmid)及pGBKT7-AtSIZ1(BD-AtSIZ1)質粒至酵母感受態Y2H Gold中。將轉化產物分別涂布于SD/-Trp固體培養基中,28 ℃培養3～4 d后,挑選單菌落,PCR驗證后得到陽性單克隆BD-McZFP1、BD-plasmid和BD-AtSIZ1,分別用SD/-Trp液體培養基搖菌至OD600值約1.0,將不同酵母菌液梯度稀釋10、100和1 000倍后,分別在SD/-Trp和SD/-Ade/-Trp/-His固體培養基上進行點斑驗證,BD-AtSIZ1作為陽性對照,BD-plasmid作為空質粒對照。培養基置于28 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d,觀察并拍照。

1.3.7 擬南芥的遺傳轉化及篩選鑒定 擬南芥遺傳轉化采用蘸花法[35]。將“1.3.5”中的陽性農桿菌接種于含50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1大觀霉素的50 mL LB液體培養基中,在28 ℃恒溫搖床過夜培養至菌液OD600值約1.8;于4 ℃、5 000 r·min-1離心5 min,收集菌體后用50 mL重懸液(含2.5 g蔗糖和20 μL表面活性劑L-77,ddH2O定容至50 mL)重懸。將植株的花序在侵染液中浸泡1～2 min后拿出,除去多余菌液,放入溫度23 ℃、光照度30 000 lx、光照時間14 h·d-1的光照培養箱中生長7 d后再次侵染,待果莢成熟后收集成熟種子。將氯氣滅菌后的種子播撒在卡那霉素抗性的1/2 MS固體培養基上進行生長篩選,挑選具有抗性的擬南芥幼苗,初步鑒定為陽性苗。將陽性擬南芥幼苗栽植于營養土中生長,采用CTAB法[36]提取其蓮座葉的DNA,利用RNA提取試劑盒提取其蓮座葉的RNA并反轉錄為cDNA,將二者分別作為模板,引物為McZFP1-GFP-F和McZFP1-GFP-R,進行PCR檢測,內參引物為AtActin2-qF和AtActin2-qR,反應體系與運行程序同“1.3.1”。PCR產物使用質量體積分數1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。以McZFP1-qF和McZFP1-qR為鑒定引物,McActin-qF和McActin-qR為內參引物(表1),對野生型擬南芥以及轉基因陽性苗中McZFP1的表達水平進行實時熒光定量PCR分析。PCR反應體系、運行程序及計算方法同“1.3.3”。

1.4 數據處理和統計分析

利用IBM SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析,數據為3次重復的具有標準差的平均值。通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯檢驗進行顯著性分析。

2 結果和分析

2.1 薄荷McZFP1基因克隆及系統進化樹構建

以薄荷幼葉cDNA為擴增模板擴增目的基因Unigene0033253,其PCR擴增產物的電泳結果見圖1,該基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列見圖2。結果顯示:PCR擴增獲得1條長度約550 bp的條帶,該基因開放閱讀框長度為558 bp,編碼185個氨基酸。與擬南芥C2H2型鋅指蛋白轉錄因子的進化關系分析結果(圖3)表明:該蛋白與擬南芥AtZFP1的相似性最高,故將Unigene0033253命名為McZFP1。

M: DL2000 DNA marker; 1: McZFP1.

*: 終止密碼子Termination codon.

分支上的數值為進化分支長度(僅標出大于或等于0.1的數值),代表遺傳變異度The values on the branches are evolutionary branch lengths (only values greater than or equal to 0.1 are showed) and represent the genetic variability. 括號中編號為Tair登錄號Nos. in the brackets are accession numbers in Tair.

2.2 薄荷McZFP1結構分析

對薄荷McZFP1進行生物信息學分析,結果顯示:McZFP1的分子式為C920H1452N292O266S9,理論相對分子質量為21 147.99,不穩定指數為64.89,屬于不穩定蛋白,脂肪指數為61.73,理論等電點為pI 9.77;該蛋白的總平均親水指數(GRAVY)為-0.878,且大多數肽鏈處于0.0以下的區域(親水區)(圖4-A),預測其為親水性蛋白。功能結構域分析結果(圖4-B)顯示:McZFP1具有典型的ZFP家族保守結構域。二級結構預測結果(圖4-C)顯示:McZFP1的二級結構包括24.32%的α螺旋、3.24%的β轉角、17.30%的延伸鏈和55.14%的無規卷曲?？缒そY構域分析結果(圖4-D)顯示:McZFP1不具有跨膜性。磷酸化位點預測結果(圖4-E)顯示:在閾值大于0.5的條件下,McZFP1有19個磷酸化位點,包括13個絲氨酸、3個酪氨酸和3個蘇氨酸的磷酸化位點。

A: McZFP1的親水性和疏水性Hydrophilicity and hydrophobicity of McZFP1; B: McZFP1的功能結構域Functional domain of McZFP1; C: McZFP1的二級結構Secondary structure of McZFP1; D: McZFP1的跨膜結構域Transmembrane domain of McZFP1; E: McZFP1的磷酸化位點Phosphorylation site of McZFP1.

2.3 薄荷McZFP1的氨基酸序列同源性分析及系統進化樹構建

薄荷McZFP1與其他10種植物同源蛋白的氨基酸序列比對和系統進化樹見圖5。結果顯示:薄荷McZFP1及其他10種植物同源蛋白的氨基酸序列均具有一段QALGGH保守序列,是典型的鋅指蛋白轉錄因子。薄荷McZFP1與一串紅(SalviasplendensKer-Gawler)同源蛋白SsZFP7(NCBI登錄號XP_042063591.1)最先聚在一起,說明二者的親緣關系最近。

括號中編號為NCBI登錄號Nos. in the brackets are accession numbers in NCBI.

2.4 薄荷McZFP1的表達模式分析

薄荷McZFP1在不同組織以及不同非生物脅迫下幼葉和不定根中的表達水平見圖6。結果顯示:薄荷McZFP1在其不定根、莖、根狀莖、幼葉、成熟葉和花中均有表達,其中,在根狀莖中的相對表達量最高,顯著高于其他組織;在不定根和幼葉中的相對表達量也較高;在莖、成熟葉和花中的相對表達量較低。

AR: 不定根Adventitious root; S: 莖Stem; R: 根狀莖Rhizome; YL: 幼葉Young leaf; ML: 成熟葉Mature leaf; F: 花Flower. M: 甘露醇Mannitol; ABA: 脫落酸Abscisic acid; MeJA: 茉莉酸甲酯Methyl jasmonate. 同一圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same graph indicate the significant (P<0.05) differences.

在150 mmol·L-1NaCl處理下,薄荷幼葉中McZFP1的相對表達量隨著處理時間的延長總體呈“升高—降低—升高”的變化趨勢,其中,處理2和12 hMcZFP1的相對表達量與處理0 h差異不顯著;處理4和8 h的McZFP1相對表達量分別顯著高于和低于處理0 h;處理24 hMcZFP1的相對表達量升至最高,為處理0 h的2.7倍。薄荷不定根中McZFP1的相對表達量在處理0、2、4、8、12 h差異不顯著,在處理24 h急劇升高,其相對表達量為處理0 h的125.3倍。

在300 mmol·L-1甘露醇處理下,薄荷幼葉中McZFP1的相對表達量隨著處理時間的延長總體呈“升高—降低—升高—降低”的變化趨勢,其中,處理2和8 hMcZFP1的相對表達量與處理0 h差異不顯著;處理4 hMcZFP1的相對表達量達到峰值,為處理0 h的6.7倍;處理12和24 hMcZFP1的相對表達量顯著高于處理0 h。薄荷不定根中McZFP1的相對表達量隨著處理時間的延長總體呈先升高后降低的變化趨勢,其中,處理2、4和12 hMcZFP1的相對表達量高于處理0 h,但差異不顯著;處理8和24 hMcZFP1的相對表達量顯著高于處理0 h,且在處理8 h達到峰值,為處理0 h的14.9倍。

在200 μmol·L-1脫落酸處理下,薄荷幼葉中McZFP1的相對表達量隨著處理時間的延長總體呈先升高后降低的變化趨勢,處理2～24 hMcZFP1的相對表達量均顯著高于處理0 h,其中,處理8 h達到峰值,為處理0 h的6.4倍。薄荷不定根中McZFP1的相對表達量隨著處理時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢,其中,處理2和4 hMcZFP1的相對表達量與處理0 h差異不顯著,處理8、12和24 hMcZFP1的相對表達量顯著高于處理0 h,且在處理12 h達到峰值,為處理0 h的10.2倍。

在200 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理下,處理2～24 h薄荷幼葉中McZFP1的相對表達量均顯著高于處理0 h。薄荷不定根中McZFP1的相對表達量隨著處理時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢,其中,處理2、4和8 hMcZFP1的相對表達量顯著高于處理0 h,且在處理8 h達到峰值,為處理0 h的29.2倍;處理12和24 hMcZFP1的相對表達量與處理0 h差異不顯著。

2.5 薄荷McZFP1的亞細胞定位分析

利用在線工具CELLO2GO預測薄荷McZFP1的亞細胞定位,該蛋白定位于細胞核的數值(2.773)遠大于定位于細胞內其他部位的數值(0.005～1.471),預測McZFP1可能定位于細胞核。進一步構建McZFP1與綠色熒光蛋白(GFP)的融合表達載體,并利用農桿菌介導的本氏煙草葉片瞬時表達分析其亞細胞定位。熒光信號檢測結果(圖7)顯示:McZFP1-GFP融合蛋白與細胞核指示染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的定位標記基本一致,說明了McZFP1是定位于細胞核的蛋白質。

McZFP1-GFP: McZFP1與綠色熒光蛋白的融合蛋白Merged protein of McZFP1 with green fluorescent protein; DAPI: 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚4′,6-diamidino-2-phenylindole; M: 疊加視野Merged field.

2.6 薄荷McZFP1的轉錄自激活活性分析

轉錄自激活驗證實驗結果(圖8)表明:轉pGBKT7空質粒(BD-plasmid)、pGBKT7-McZFP1(BD-McZFP1)及pGBKT7-AtSIZ1(BD-AtSIZ1)的酵母均可以在SD/-Trp固體培養基上正常生長;轉BD-plasmid和BD-McZFP1的酵母均不能在SD/-Ade/-Trp/-His固體培養基上生長,而轉BD-AtSIZ1的酵母則能正常生長,表明McZFP1不具有轉錄自激活活性。

1,1/10,1/100,1/1 000: 分別表示酵母菌液不稀釋以及稀釋10、100和1 000倍Indicating that the yeast solution is not diluted and diluted 10, 100, and 1 000 times, respectively. BD-plasmid: 轉pGBKT7空質粒的酵母Yeast transformed with pGBKT7 empty plasmid; BD-McZFP1: 轉pGBKT7-McZFP1的酵母Yeast transformed with pGBKT7-McZFP1; BD-AtSIZ1: 轉pGBKT7-AtSIZ1的酵母Yeast transformed with pGBKT7-AtSIZ1.

2.7 過表達McZFP1轉基因擬南芥的獲得及鑒定

35S:McZFP1-GFP轉基因擬南芥陽性苗的鑒定結果見圖9。結果顯示:初步鑒定葉片綠色健康、根系生長良好的擬南芥幼苗為轉基因陽性苗,命名為OE1和OE2。以擬南芥植株DNA為模板,從DNA水平對轉基因擬南芥陽性苗進行PCR鑒定,同時以擬南芥植株RNA反轉錄產物為模板,利用RT-PCR技術鑒定轉基因陽性苗,鑒定結果顯示:得到的2個轉基因苗確定為陽性苗。利用實時熒光定量PCR技術檢測轉基因植株中McZFP1的相對表達量,結果表明所獲得的OE1和OE2是McZFP1轉基因陽性苗。

M: DL2000 DNA marker; 1: 35S:McZFP1-GFP-OE1; 2: 35S:McZFP1-GFP-OE2; 3: 野生型Wild type; At: 擬南芥 Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh. 圖D中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the graph D indicate the significant (P<0.05) differences.

3 討論和結論

鹽和干旱等非生物脅迫因子會使植物代謝水平降低,生長發育受到抑制,甚至可能對植物造成不可逆的損害,嚴重時可能導致植物死亡[37]。薄荷受到高鹽和干旱脅迫后,其精油的產量會受到抑制,精油成分也會受到影響,從而影響生產加工。逆境脅迫下,轉錄因子通過調控一系列抗逆基因的表達,提高植物的抗逆性[38]。C2H2型鋅指蛋白類轉錄因子是植物體內分布最廣泛且在許多生理生化反應中具有關鍵調控作用的一類轉錄因子,其成員在植物的生長發育以及應對環境脅迫中發揮著重要作用[39]。

本研究從薄荷中克隆了1個C2H2型鋅指蛋白轉錄因子基因McZFP1。McZFP1具有C2H2保守結構域,與許多鋅指蛋白轉錄因子具有較高的同源性,該蛋白定位于細胞核,表明McZFP1是典型的鋅指蛋白轉錄因子,其功能可能類似于已報道的C2H2型鋅指蛋白類轉錄因子,在植物的生長發育以及應對環境脅迫中具有潛在的作用,如營養生長、生殖發育、光調節形態建成、逆境響應和激素信號轉導等[20-27],[28]18-25。此外,McZFP1在薄荷的不定根、莖、根狀莖、幼葉、成熟葉和花中均有表達,在根狀莖中相對表達量最高,在不定根和幼葉中相對表達量也較高,在莖、花和成熟葉中相對表達量較低,暗示該基因可能主要在根狀莖和不定根的發育或者行使相關功能中發揮作用。

ZFP亞家族在植物發育與抗逆中發揮著重要的調控作用[40]。擬南芥AtZFP1正調控表皮毛發育[41],并在植株頂端包括頂端分生組織以及發育中的葉和維管系統中高表達,可能參與莖頂端發育[42]。近年來,在一些藥用植物中也報道了ZFP參與植物抵抗逆境脅迫。沙蒿(ArtemisiadesertorumSpreng.)鋅指蛋白轉錄因子基因AdZFP1的轉錄本在一定程度上受外源脫落酸以及鹽、低溫、高溫、干旱脅迫的誘導,在煙草中過表達AdZFP1可顯著提高植株的耐旱性[43]。人參(PanaxginsengC. A. Meyer)PgZFP基因家族中PgZFP31、PgZFP78-01、PgZFP38和PgZFP39-01在受到鹽脅迫時表達量顯著升高,推測其可能在人參對鹽脅迫的響應中發揮著重要作用[44]。本研究中,薄荷幼葉和不定根中McZFP1的相對表達量在150 mmol·L-1NaCl和300 mmol·L-1甘露醇處理24 h內存在顯著變化,說明其響應高鹽和干旱脅迫。脫落酸作為一種重要的脅迫激素,參與植物對鹽和干旱等非生物脅迫的響應[45]。擬南芥AtZFP3及其同源基因AtZFP1、AtZFP4、AtZFP6和AtZFP7均是脫落酸響應的負調控因子,擬南芥中過表達AtZFP3導致種子對脫落酸的敏感性降低,而zfp3/zfp4雙突變體對脫落酸的敏感性增強[46]。擬南芥AtZFP3通過調控脫落酸信號途徑中的RESPONSIVETOABSCISICACID18(RAB18)和ABSCISICACID-INSENSITIVE4(ABI4)等基因的表達來負調控脫落酸信號途徑,進而調控擬南芥種子萌發,影響其營養和生殖生長。馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)StZFP1受脫落酸誘導表達,在擬南芥rd29A啟動子的驅動下,StZFP1在轉基因煙草中的異位表達提高了煙草對鹽和干旱脅迫的耐受性,表明StZFP1可能通過脫落酸依賴性途徑參與調控馬鈴薯對鹽和干旱脅迫的反應[19]。茉莉酸甲酯作為一種新型的植物生長調節劑,與植物的抗逆性密切相關,可以通過保護植物的光合系統、提高抗氧化酶活性和提高滲透調節物質含量等方式緩解植物受到的逆境傷害[47-51]。水稻OsWRKY76和OsbHLH148直接與OsDREB1E啟動子結合,激活OsDREB1E的表達以響應干旱脅迫,OsHLH148介導的茉莉酸信號途徑正調控水稻的耐旱性[52]。蘋果(MalusdomesticaMill.)中C2H2型鋅指蛋白轉錄因子基因MdZAT10受茉莉酸甲酯誘導表達,調控蘋果葉片對干旱脅迫的響應,同時加速茉莉酸誘導的葉片衰老過程[53-54]。本研究中,200 μmol·L-1脫落酸和200 μmol·L-1茉莉酸甲酯處理可誘導薄荷幼葉和不定根中McZFP1的表達,推測McZFP1可能通過介導脫落酸信號和茉莉酸信號調控薄荷對鹽和干旱等非生物脅迫的應答。

綜上所述,本研究成功克隆了薄荷McZFP1,并對其進行了生物信息學分析。McZFP1定位于細胞核但不具備轉錄自激活活性,該基因在薄荷植物體內的組織中廣泛表達,在根狀莖和不定根中的表達水平較高,受鹽和干旱脅迫誘導表達顯著,并響應脫落酸信號和茉莉酸信號。此外,篩選并獲得了McZFP1轉基因擬南芥T0代陽性苗及其種子,這將有助于進一步深入研究McZFP1的功能。本研究結果為薄荷McZFP1的后續功能驗證以及培育優質的耐鹽、耐旱薄荷品種提供了基礎。