環孢素A和他克莫司的高效液相色譜-串聯質譜檢測及其室內質控評價

鐘里科,米秀芳,舒琦,許高奇,何超能,朱俊峰

(浙江省腫瘤醫院藥劑科,中國科學院杭州醫學研究所,杭州 310022)

治療藥物監測(therapeutic drug monitoring,TDM)是個體化醫療的重要組成部分,可以幫助患者在正確的時間接受最佳劑量的藥物,提高藥物的有效性和安全性,改善患者的預后。環孢素A和他克莫司是臨床上應用最廣泛的2種免疫抑制劑,常用于治療移植排斥反應和自身免疫性疾病[1-2]。然而,這2種藥物的治療窗狹窄,藥動學個體差異大,因此用藥期間需要進行TDM[3-4]。

高效液相色譜-串聯質譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectormetry,HPLC-MS/MS)法是一種強大的分析技術,已被廣泛用于生物樣品等復雜基質中藥物的定量測定。HPLC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度和高精確度的特點,已成為環孢素A和他克莫司TDM的理想方法[5],其準確性和精確度受到幾個因素的影響,包括基質效應、離子抑制和校準曲線擬合等。因此,有必要建立和評估室內質量控制系統以確保方法的可靠性和重復性。

本研究旨在利用HPLC-MS/MS建立一種快速、可靠的環孢素A和他克莫司TDM方法,并應用Westgard 多規則質控體系對2022年第3季度環孢素A和他克莫司TDM過程中的隨行質控樣品測定值進行Levery-Jennings和Z分數質控圖分析,以期完善環孢素A和他克莫司治療藥物監測的室內質量控制體系,提高血藥濃度監測的準確性,為臨床提供參考。

1 儀器與試劑

1.1儀器 AB SCIEX Triple Quad 4500MD液相色譜串聯質譜檢測系統(美國AB SCIEX公司);HERAEUS MULTIFUGE 3SR+低溫離心機(美國Thermo Scientific公司);BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司,感量:0.1 mg);DMT-2500多管漩渦混合儀(杭州米歐儀器有限公司);CASCADA I超純水制備儀(美國 PALL 公司)。

1.2試劑 環孢素A對照品(批號:GC113281,含量>98%),他克莫司對照品(批號:GC162331,含量>98%),環孢素D(作為環孢素A的內標)對照品(批號:GC118661,含量>98%),子囊霉素(作為他克莫司的內標)對照品(批號:GC132151,含量>98%),均購自美國GlpBio公司。甲酸和乙酸銨均為色譜純,購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇和乙腈均為色譜純,購自德國Merck公司。

2 方法與結果

2.1溶液的配制

2.1.1儲備液的配制 分別精密稱取環孢素A 10.4 mg和他克莫司9.9 mg于不同10 mL量瓶,用甲醇溶解并定容,制得1.04 mg·mL-1的環孢素A標準儲備液和0.99 mg·mL-1的他克莫司標準儲備液各1份;同法分別制備1.10 mg·mL-1的環孢素A質控儲備液和0.99 mg·mL-1的他克莫司質控儲備液各1份;同法分別制備1.00 mg·mL-1的環孢素D內標儲備液和0.95 mg·mL-1的子囊霉素內標儲備液各1份。儲備液于-30 ℃保存。

2.1.2工作液的配制 精密吸取環孢素A標準儲備液100 μL和他克莫司標準儲備液5 μL于同一個10 mL量瓶,用50%甲醇稀釋至刻度,制得環孢素A和他克莫司濃度分別為10 400.00和495.00 ng·mL-1的混標工作液;同法用質控儲備液制得環孢素A和他克莫司濃度分別為8 800.00和396.00 ng·mL-1的質控工作液;同法用內標儲備液制得環孢素D和子囊霉素濃度分別為500.00和49.50 ng·mL-1的內標工作液。

2.1.3校正樣品及質控樣品的制備 將人空白全血與混標工作液按9：1混合,制得環孢素A和他克莫司濃度分別為1 040.00和49.50 ng·mL-1的定量上限樣品,之后用空白全血逐級稀釋,制得一系列濃度梯度的校正樣品,其中環孢素A的濃度梯度為:10.40、20.80、52.00、104.00、08.00、20.00、1 040.00 ng·mL-1,他克莫司的濃度梯度為:0.50、0.99、2.48、4.95、9.90、24.75、49.50 ng·mL-1。同法用質控工作液制得3個濃度水平的質控樣品,其中環孢素A的濃度為17.60、88.00、880.00 ng·mL-1,他克莫司的濃度為0.79、3.96、39.60 ng·mL-1。

2.2樣品前處理 精密吸取全血100 μL于1.5 mL EP管,加入內標工作液10 μL混勻,然后加入濃度為100 mmol·L-1的硫酸鋅溶液100 μL,2 500 r·min-1渦旋3 min,靜置5 min。之后加入乙腈300 μL沉淀蛋白,2 500 r·min-1渦旋3 min后以15 000 r·min-1離心10 min。離心后取上清液進樣分析。

2.3色譜條件 色譜柱為WatersXbridge C18(2.1 mm×50 mm,3.5 μm);流動相為2 mmol·L-1乙酸銨-0.1%甲酸溶液(A):2 mmol·L-1乙酸銨-0.1%甲酸甲醇溶液(B),梯度洗脫:0—0.2min,10% B;0.2—0.7min,10%→100% B;0.7—2.0min,100% B;2.0—2.25min,100%→10% B;2.25—3.5 min,10% B;分析時間3.5 min;流速0.5 mL·min-1;柱溫60 ℃;進樣量10 μL。

2.4質譜條件 采用電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)離子源,正離子模式,多反應監測模式(multiple reaction monitoring mode,MRM)掃描。優化后的離子源參數:氣簾氣為35 psi,離子化電壓為5 500 V,溫度(temperature,TEM)為450 ℃,噴霧氣為40 psi,輔助加熱氣為40 psi,碰撞氣為7 psi。各化合物的子離子掃描圖見圖1,優化后的MRM參數見表1。

圖1 環孢素A(A)、環孢素D(B)、他克莫司(C)及子囊霉素(D)的離子掃描圖

表1 優化后的化合物MRM參數

2.5方法學評價

2.5.1專屬性 在上述條件下,環孢素A及其內標環孢素D的保留時間分別為1.49和1.50 min,他克莫司及其內標子囊霉素的保留時間均為1.44 min。同時,定量下限樣品中待測物的響應值為空白全血的10倍以上,全血中的內源性成分對待測物及內標無干擾,表明本方法專屬性良好,見圖2。

圖2 環孢素A、他克莫司、環孢素D和子囊霉素在空白全血(A)、零點樣品(B)及定量下限樣品(C)中的色譜圖

2.5.2線性及定量下限 環孢素A在10.40～1 040.00 ng·mL-1范圍內線性關系良好,線性方程為Y=0.019 63X+0.029 62(r=0.999 3);他克莫司在0.50～49.50 ng·mL-1范圍內線性關系良好,線性方程為Y=0.190 64X+0.066 03(r=0.999 5)。環孢素A及他克莫司的定量下限分別為10.40和0.50 ng·mL-1,其定量下限的準確度及精密度見表2。偏差(Bias,%)及變異系數(CV,%)均<20.0%,滿足生物樣品定量分析要求。

表2 環孢素A及他克莫司的日內、日間準確度和精密度

2.5.3準確度和精密度 不同濃度環孢素A及他克莫司的日內和日間準確度Bias均在±15.0%以內,精密度CV≤15.0%,滿足生物樣品定量分析要求,見表2。

2.5.4提取回收率 不同濃度環孢素A的提取回收率為108.61%～113.24%,他克莫司的提取回收率為101.99%～109.37%,見表3。

表3 環孢素A及他克莫司的提取回收率和基質效應

2.5.5基質效應 不同濃度環孢素A的基質因子(matrix factors,MF)為70.46%～71.86%,其內標歸一化的基質因子為106.68%～111.27%;他克莫司的基質因子為99.80%～106.55%,其內標歸一化的基質因子為95.70%～97.81%,均符合生物樣本定量分析要求,見表3。

2.5.6穩定性實驗 不同濃度環孢素A及他克莫司在室溫不避光放置6 h、在4 ℃放置3 d、在處理后放置于自動進樣器24 h的Bias為-1.62%～14.40%,CV為1.41%～9.05%,表明環孢素A及他克莫司在相應條件下基本穩定。

2.5.7進樣殘留 在連續進樣2針定量上限樣品后的空白樣品中未檢測到待測物和內標的殘留。

2.5.8稀釋倍數 為了應對臨床上可能遇到的極高濃度樣品,本研究將10倍定量上限樣品用空白全血稀釋10倍后分析,環孢素A的準確度Bias為-1.30%,精密度CV為3.30%;他克莫司的準確度Bias為7.85%,精密度CV為2.53%,表明在相關范圍內可采用空白全血稀釋高濃度樣品后進行測定。

2.6Westgard多規則質量控制評價

A:低濃度環孢素A;B:中濃度環孢素A;C:高濃度環孢素A;D:低濃度他克莫司;E:中濃度他克莫司;F:他克莫司高濃度。

A:環孢素A;B:他克莫司。

2.7方法應用 采用建立的血藥濃度檢測方法測定臨床樣本中的環孢素A和他克莫司濃度。2022年第三季度共有33個環孢素A血樣送檢,測定值為(206.18±189.28) ng·mL-1;8個他克莫司血樣送檢,測定值為(6.12±5.67) ng·mL-1。結果表明,患者體內的環孢素A和他克莫司谷濃度個體間差異很大,見圖5。結合隨行質控與Westgard 多規則理論評價,本時間段環孢素A和他克莫司血藥濃度檢測結果穩定可靠,可以有效幫助醫生調整臨床給藥劑量。

圖5 環孢素A和他克莫司的谷濃度

3 討論

環孢素A和他克莫司均為鈣調神經磷酸酶抑制劑,能夠通過抑制細胞因子的產生,減少淋巴細胞增殖,發揮免疫抑制作用。其在血液中的分布較為復雜,大部分分布于紅細胞,因此往往以全血藥物濃度作為反映其藥效或毒性的藥動學指標[6]。環孢素A和他克莫司的治療窗分別為150～350和5～20 ng·mL-1,因此在全血中所需的檢測限度要求分別為20和1 ng·mL-1[7]。目前,國內多采用免疫法檢測人全血中的環孢素A和他克莫司濃度,但免疫法的選擇性不佳,可能存在代謝物干擾,且所需的試劑盒價格昂貴,并無法同時檢測多種免疫抑制劑。LC-MS/MS法作為治療藥物監測的金標準,專屬性好,靈敏度高,能夠同時檢測多種藥物[8]?；诖?本文通過HPLC-MS/MS技術建立了一種快速、可靠的環孢素A和他克莫司全血藥物濃度檢測方法。方法學驗證按照FDA制定的生物分析方法驗證指南進行[9-11],將簡單的細胞裂解+蛋白沉淀作為樣品前處理方法,分析時間僅為3.5 min,環孢素A及他克莫司的定量下限分別為10.40和0.50 ng·mL-1,能夠很好地滿足臨床治療藥物監測需求。

在TDM中,質量控制有助于檢測結果的標準化和可靠性,促進患者用藥安全,因此,室內質量控制評估對TDM具有重要意義[12]。目前,在同時檢測環孢素A和他克莫司血藥濃度的TDM方法中,大部分是基于免疫分析法的室內質控研究[13],尚無LC-MS/MS檢測方法的室內質控研究報道。本研究中,筆者聯合Levery-Jennings質控圖和Z分數質控圖,應用Westgard 多規則理論進行質控評價,對LC-MS/MS 測定環孢素A和他克莫司血藥濃度的室內質量控制進行深入的探索。Levery-Jennings質控圖通過將1倍、2倍和3倍標準差作為控制線、警戒線和失控線,可以提高實驗的精度和準確性,但只適用于同一水平的質量控制,不適用于不同階段或不同體積的樣品質量控制[14]。Z分數質控圖可以將不同水平的質控樣品測定值轉換成同一標準,使其可以在同一張圖上直觀地顯示比較結果[15]。該2種方法雖然操作簡便,但僅對隨機誤差敏感,無法十分準確地發現系統誤差。置換Westgard多規則是第2代質量控制方法,通過設定12S/13S/22S/R4S/41S/10X 規則,結合Levey-Jennings質控圖來判斷測定結果是否可控,不僅可敏銳地發現隨機誤差,還能夠準確地判斷系統誤差,顯著提高誤差檢出能力[16-17]。與僅僅依靠隨行質控判斷是否處于控制狀態的“即刻法”不同,使用Westgard多規則理論進行血藥濃度質量控制更加精確和有效,該方法不僅可以幫助檢測出異常的數據,還可以通過指定多個規則來維護穩定的分析表現,已被廣泛應用于藥物治療監測領域,并取得了不錯的效果,因此受到越來越多的關注和認可[15-17]。筆者在本研究中利用該方法對2022年第三季度期間環孢素A和他克莫司的血藥濃度監測進行質量評估,發現警告4次(違反12s規則),其余樣品均在控,提示建立的LC-MS/MS在環孢素A和他克莫司血藥濃度的長期檢測中具有較好的穩定性。

綜上所述,本研究利用LC-MS/MS 技術建立一種靈敏、快速、可靠的環孢素A和他克莫司血藥濃度檢測方法。通過完善室內質控評估體系,可以從根本上提高環孢素A和他克莫司血藥濃度檢測的精準度和綜合質量,確?；颊叩闹委熜Ч团R床安全。同時,該質控評估體系也可以為臨床實踐提供科學可靠的指導,為醫療工作者的臨床決策提供支持。