血凝試驗和反向間接血凝試驗定量檢測PCV2 Cap抗原的研究

李晶梅,謝紅玲,薛 霜,李文靜,黃 濤,王煥君,劉項羽,張飛雁,朱 薇,李婷婷,石寶蘭

(國藥集團動物保健股份有限公司,武漢 430075)

豬圓環病毒2型(PCV2)屬于圓環病毒科圓環病毒屬。病毒粒子直徑15-20 nm,呈20面體對稱結構,無囊膜。PCV2病毒主要包括2個開放的閱讀框架(ORF1和ORF2),其中ORF2編碼的病毒衣殼蛋白(Capsid protein,Cap)是PCV2的主要的結構蛋白、免疫原性蛋白。表達PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒接種昆蟲細胞,培養數日后可獲得含有PCV2病毒樣顆粒的細胞培養液,即PCV2 Cap抗原,此抗原可制備PCV2疫苗。疫苗生產中需要定量檢測PCV2 Cap抗原,常用方法有SDS-PAGE、ELISA和BCA定量,其中SDS-PAGE和ELISA方法耗時較長,BCA只能檢測純化后樣品。

很多病毒具有凝集紅細胞的特性,如新城疫病毒可凝集雞、小鼠和豚鼠等的紅細胞[1],豬細小病毒可凝集豚鼠、雞和大鼠等的紅細胞[2],犬細小病毒可凝集豬紅細胞[3],乙腦病毒可凝集鵝紅細胞[4]等。反向間接血凝試驗(RIHA)是用已知抗體致敏紅細胞,然后與樣品在適宜條件下反應,如樣品中含有目的抗原,則抗原抗體發生特異性結合,紅細胞出現肉眼可見的凝集現象[5]。本實驗對重組桿狀病毒表達的PCV2 Cap抗原凝集豬、雞、綿羊紅細胞的特性進行了初步研究,并嘗試用反向間接血凝方法定量檢測PCV2 Cap抗原,以期建立簡單、快速、經濟的PCV2 Cap抗原定量檢測方法。

1 材料和方法

1.1 抗原、病毒、單抗 昆蟲細胞重組桿狀病毒表達系統表達的PCV2 Cap抗原,昆蟲細胞擴繁的空桿狀病毒,豬圓環病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(PEDV)、豬流行性腹瀉病毒(TGEV),PCV2 Cap單抗,均由國藥集團動物保健股份有限公司保存。

1.2 主要試劑耗材 1%豬紅細胞、1%醛化豬紅細胞、1%雞紅細胞、1%醛化雞紅細胞,1%醛化綿羊紅細胞,1%鞣化綿羊紅細胞,PBS(0.1 mol/L,pH 7.2)、含1%兔血清的PBS、醋酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 5.0)均為常規方法配制。

1.3 PCV2 Cap抗原的血凝特性研究 按《中國獸藥典》[6]中的血凝試驗操作方法,用PBS和含1%兔血清的PBS分別作為稀釋液,用1%豬紅細胞、1%醛化豬紅細胞、1%雞紅細胞、1%醛化雞紅細胞、1%醛化綿羊紅細胞、1%鞣化綿羊紅細胞分別測定PCV2 Cap抗原和空桿狀病毒的血凝效價。

1.4 反向間接血凝試驗最優單抗致敏稀釋度的確定

1.4.1 1%致敏紅細胞的制備 用醋酸鹽緩沖液稀釋PCV2 Cap單抗,使稀釋倍數分別為1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000。再分別與1%鞣化綿羊紅細胞等體積混合,37 ℃水浴30 min致敏。用含1%兔血清的PBS洗紅細胞并重懸,獲得不同稀釋度單抗致敏的1%致敏紅細胞。

1.4.2 抗原的準備 用PBS按1∶100稀釋PCV2 Cap抗原備用,簡稱Cap抗原。

1.4.3 最優單抗致敏稀釋度的確定 RIHA效價測定的具體操作為:1)在96孔血凝板各孔加入0.025 mL含1%兔血清的PBS;2)各行第1孔加入0.025 mL Cap抗原,倍比稀釋至11孔,棄去0.025 mL;3)各行每孔分別加入0.025 mL 1.4.1項制備的不同稀釋度單抗致敏的1%致敏紅細胞;4)振蕩混勻,靜置90～120 min,當第12孔(陰性對照)孔底紅細胞出現鈕扣狀沉積時判定結果,以使致敏紅細胞50%凝集的樣品的最高稀釋度為該樣品的RIHA效價。如此,用不同稀釋度的單抗致敏的1%致敏紅細胞分別測定Cap抗原RIHA效價,效價最高的1%致敏紅細胞對應的單抗的最高稀釋度為本批次單抗的最適致敏稀釋度。

1.5 反向間接血凝試驗的特異性、敏感性研究

1.5.1 1%致敏紅細胞的制備 以1.4.3確定的最適稀釋度稀釋單抗,稀釋后的單抗與1%鞣化綿羊紅細胞等體積混合,37 ℃水浴30 min致敏,獲得1%致敏紅細胞,備用。

1.5.2 RIHA方法的敏感性、特異性 用1%致敏紅細胞、1%鞣化紅細胞分別測定被檢樣品的血凝效價,被檢樣品包括濃縮純化后的PCV2 Cap抗原、未經純化的PCV2 Cap抗原、空桿狀病毒、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV和TGEV。

1.5.3 RIHA方法的應用 用1%致敏紅細胞測定若干未經純化的和濃縮純化后的PCV2 Cap抗原的RIHA效價,與ELISA測定的含量結果進行比較,研究方法的敏感性、實用性。

2 結果與分析

2.1 PCV2 Cap抗原的血凝特性 HA效價結果詳見表1。純化和未純化的PCV2 Cap抗原均可凝集豬、雞、綿羊紅細胞,空桿狀病毒不凝集紅細胞,說明是PCV2 Cap抗原凝集了紅細胞。含量相近的純化和未純化的PCV2 Cap抗原,分別用不同紅細胞、不同稀釋液檢測,HA效價各有高低,說明有些紅細胞和稀釋液的組合不能準確定量PCV2 Cap抗原。同一PCV2 Cap抗原用醛化紅細胞和新鮮紅細胞測得的HA效價不完全相同,說明醛化導致紅細胞凝集特性發生了變化。使用相同紅細胞檢測相同樣品,而稀釋液不同時,測得的HA效價不完全相同,說明稀釋液對HA效價有顯著影響。豬紅細胞測得的HA效價高于雞紅細胞和綿羊紅細胞測得的HA效價,分析原因可能是因為PCV2是豬的病毒,所以對豬紅細胞較敏感。另外,PCV2 Cap抗原易引起豬紅細胞的超凝集,雞、羊紅細胞無此現象(圖1)。

A、B:純化的PCV2 Cap抗原、未純化的PCV2 Cap抗原A / B: Purified PCV2 Cap antigen/Unpurified PCV2 Cap antigen圖1 不同紅細胞和稀釋液檢測的血凝結果圖Fig 1 HA Tested by different erythrocytes and different dilutions

表1 HA效價(log2)Tab 1 HA titers(log2)

2.2 最適抗體致敏濃度 1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000稀釋的單抗致敏紅細胞,檢測PCV2 Cap抗原,效價分別為7 log2、7 log2、7 log2、6 log2、3 log2、1 log2(表2),由此確定本批次單抗1∶2000稀釋使用最優。

表2 不同稀釋度抗體致敏紅細胞檢測PCV2 Cap抗原Tab 2 PCV2 Cap Antigen Tested by Antibody Sensitized Erythrocytes with Different Dilutions

2.3 RIHA方法的敏感性、特異性結果 1%致敏紅細胞檢測純化和未純化的PCV2 Cap抗原效價分別為14 log2、13 log2,高于豬、雞、非致敏綿羊紅細胞檢測的HA效價,說明RIHA方法敏感性良好。檢測PK15細胞擴繁的PCV2病毒液效價小于1 log2,說明PCV2的含量低于RIHA方法檢測下限。檢測空桿狀病毒、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV等病毒,效價均小于1 log2,說明RIHA方法特異性良好。PCV2 Cap抗原對1%鞣化紅細胞也有凝集,但凝集效價遠低于1%致敏紅細胞的效價,說明測得的RIHA效價是特異的。結果詳見表3。

2.4 RIHA方法的應用 樣品1～樣品4、樣品5～樣品8分別為未純化的、濃縮純化的PCV2 Cap抗原,均1∶500稀釋后檢測RIHA效價,結果顯示,RIHA效價與ELISA方法測得的結果有平行關系。詳見表4。

表4 樣品檢測結果Tab 4 Titer of samples

3 討論與結論

3.1 PCV2 Cap抗原對豬、雞、綿羊紅細胞的凝集特性 PCV1不能凝集動物紅細胞[7],也未見PCV2凝集動物紅細胞的報道。本研究發現用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統制備的PCV2 Cap抗原可凝集醛化豬紅細胞、新鮮豬紅細胞、醛化雞紅細胞、新鮮雞紅細胞、醛化綿羊紅細胞、鞣化綿羊紅細胞。上述紅細胞不凝集PK15細胞擴繁的PCV2全病毒,分析原因可能哺乳動物細胞擴繁的PCV2抗原液中PCV2含量少,未達到能夠凝集紅細胞的量;昆蟲細胞桿狀病毒表達體系制備的PCV2 Cap抗原中PCV2 Cap含量高,稀釋后仍可凝集紅細胞。另外發現PCV2 Cap抗原易引起豬紅細胞的超凝集,雞、羊紅細胞無此現象。

3.2 PCV2 Cap抗原凝集紅細胞的條件、效價 ELISA定量檢測為50 μg/mL的純化的PCV2 Cap抗原和47 μg/mL未純化的PCV2 Cap抗原,用不同紅細胞和不同稀釋液測得的凝集效價分別為3 log2～9 log2、2 log2～10 log2。說明紅細胞不同、稀釋液不同,測得的PCV2 Cap抗原凝集效價不同,且差異較大。

3.3 定量檢測PCV2 Cap抗原的RIHA方法 PCV2 Cap單抗致敏鞣化綿羊紅細胞,獲得1%致敏紅細胞,可用于RIHA方法定量檢測PCV2 Cap抗原。1%致敏紅細胞檢測某批次純化和未純化的PCV2 Cap抗原,效價分別為14 log2、13 log2,均高于豬、雞、非致敏綿羊紅細胞檢測的HA效價,說明RIHA方法敏感性良好?？諚U狀病毒、PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV的RIHA效價均小于1 log2,說明該方法特異性好,同時說明哺乳動物細胞擴繁的PCV2含量低未到達RIHA方法的檢測下限。純化后和未純化的PCV2 Cap抗原的RIHA效價均與ELISA定量檢測結果有平行關系,并且RIHA方法使用的設備耗材少、操作簡便、用時短(1.5～2 h),可在抗原的生產環節應用作為SDS-PAGE和ELISA方法的補充。如檢測生物反應器中培養的抗原可判定含量是否達標并結束培養;檢測純化濃縮后的抗原和廢液可判定純化濃縮工藝的抗原損耗率。

綜上,通過研究 PCV2 Cap對豬、雞、綿羊紅細胞的凝集特性,確定了血凝方法定量檢測PCV2 Cap有可行性,該方法的穩定性、與其他定量方法是否有平行關系等尚需進一步研究;本研究通過用PCV2 Cap單抗致敏紅細胞初步建立了定量檢測PCV2 Cap抗原的RIHA方法,確定其敏感性、特異性良好,RIHA效價與ELISA定量檢測結果有平行關系,可用于昆蟲細胞重組桿狀病毒表達系統表達的PCV2 Cap抗原的快速定量檢測。