紅霉素高產菌株選育及其發酵條件的優化

李春玲,牛莎莎, 牛 春,石彥鵬,張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司, 銀川 750101)

紅霉素(Erythromycin)是一種大環內酯類抗生素,其分子式為C37H67NO13,由放線菌屬(Actinomycetes)紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)通過次級代謝途徑生成[1-3]。紅霉素及其半合成衍生物阿奇霉素(Azithronmycin)、甲紅霉素(Clarithromycin)、地紅霉素(Dirithromycin)、羅紅霉素(Roxithromycin)、氟紅霉素(Flurithromycin)等,對革蘭氏陽性菌具有較好抗性作用,常用于對青霉素耐藥的革蘭氏細菌感染及對青霉素過敏的患者,是軍團菌肺炎、支原體肺炎、沙眼衣原體所致的嬰兒肺炎及結腸炎,皮膚軟組織感染的首選藥,應用較為廣泛,生產前景廣闊[4-7]。

紅霉素主要通過工業發酵進行生產,但目前國內發酵效價一般為4000～5000 mg/mL,與國外水平8000～12000 mg/mL相比,還存在較大差距,究其原因主要在于缺少優良的發酵菌株和適宜發酵條件。因此,優良菌株選育以及配套發酵條件優化是解決這一問題的有效途徑。劉峰等[8]通過UV(紫外誘變)誘變,選育出一株發酵效價增加10%的菌株F1-57,并通過添加前體物等措施優化了發酵條件,大幅提高了發酵水平。楊雪清[9]利用紅霉素堿作為誘變劑篩選出紅霉素耐受性突變株 LJ-12-2,其發酵效價增加10.8%。孟祥學等[10]運用UV(紫外誘變)誘變選育出一株效價增加20%的菌株。趙宏圖[11]綜合運用離子注入技術、UV誘變、鹽酸輕胺誘變開展紅霉素發酵生產菌株的選育,并對發酵條件系統優化,使發酵效價達到8500 mg/mL。另外,卞晨光等[12]、劉曉宏等[13]、Zou等[14]開展了發酵條件優化研究,大幅提高了紅霉素發酵效價。但是,整體而言當前國內紅霉素發酵生產還處于較低水平,亟待提升。鑒于此,本研究以引進保存的產紅霉素的紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)SE-2207菌株作為原始菌株,利用EMS(甲基磺酸乙酯)、UV以及ARTP(常壓室溫等離子體誘變)誘變的方法,對菌株進行誘變處理,選育出優良發酵菌株,并從發酵培養基組成方面優化發酵條件,以期提高發酵水平,推動紅霉素規?；l酵生產。

1 材料與方法

1.1 菌種 原始菌株為產紅霉素(Erythromycin)的紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)SE-2207菌株,由本實驗室低溫保藏。

1.2 儀器及耗材 恒溫振蕩搖床(武漢科學儀器廠,編號:HQL150C)、恒溫恒濕培養箱(江蘇杰瑞爾電器有限公司,LHP160)、ARTP等離子體生物育種機(北京思清源生物科技有限公司,ARTP-Ⅱ型),紫外分光光度計(德國耶拿,SPECORD S600)、高效液相色譜儀(Watesr公司,E2695)、顯微鏡(Leica DM500)。Erythromycin對照品購自 Sigma 公司,其他化學試劑為國產分析純。

1.3 培養基及培養條件 斜面和分離培養基(g/L):淀粉 1,玉米漿 1,氯化鈉 0.3,硫酸銨0.3,碳酸鈣0.5,瓊脂 20, pH 7.0,32 ℃,培養7 d。種瓶培養基(g/L):蔗糖6,硝酸鉀 1.0,硫酸銨 0.2,磷酸二氫鉀0.3,七水硫酸鎂 0.1,pH 7.0。斜面培養基挖塊約1 cm3,接種于種子培養基中(250 mL容積的錐形瓶裝量40 mL),置于32 ℃搖床,220 rpm,培養32 h。發酵瓶培養基(M/V):黃豆餅粉3%,玉米漿3%,葡萄糖6%,硫酸銨 0.1%,磷酸氫二鉀 0.1%,碳酸鈣 0.4%,pH自然,接種量8%(500 mL容積的錐形瓶裝量80 mL),32 ℃,220 rpm振蕩培養,培養7 d。中試(500 L)培養基(g/L):淀粉20,蔗糖53,玉米漿98,酵母粉10,硫酸銨4,磷酸二氫鉀 1,氯化鈣 2,碳酸鈣 0.5,pH自然,溫度32 ℃,時間7 d。

1.4 孢子液的制備 參考李春玲等[15]的方法,取成熟斜面孢子,用4.5 mL無菌水沖洗,將沖洗的孢子液用研磨器研磨,然后將菌液用濾紙過濾,離心管收集濾液,稀釋至1×10-6濃度備用。

1.5 甲基磺酸乙酯 (EMS)誘變 取一定量的孢子液于無菌三角瓶中,加入EMS(終濃度為0.2%),放在搖床上振蕩培養,誘變處理時間分別為1、2、3、4、5 h,然后將孢子液均勻涂布于分離培養基上,以未經EMS處理的孢子液作為對照,于32 ℃培養箱培養 7 d。

1.6 紫外線(UV)誘變 取2 mL制備好的孢子液放入置有圓形磁片的培養皿中(直徑為9 cm),打開預熱15 W紫外燈(波長253.7 nm)30 min,將離紫外燈管置于培養皿垂直高度35 cm處,然后打開皿蓋,分別采用照射20、40、60、80 s進行處理,蓋上皿蓋,誘變處理過程在黑暗條件下進行。誘變結束后,再將培養皿在黑暗處條件下放置2 h,然后吸取孢子液,均勻涂布于分離培養基上,于32 ℃培養箱中培養7 d,統計致死率。

1.7 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變 ARTP的工作氣體為純度為99.99%的氦氣,處理功率為80 W,等離子體發生器待處理樣品與出口之間的距離為4 mm,氣體的流量9.0 L/min。將準備好的50 μL孢子液均勻涂布于載片上,然后進行照射,照射的時間分別為0(對照)、20、40、60、80 s,用50 μL 無菌水沖洗,將照射后的菌液洗脫倒入平皿中,反復洗脫4次,均勻涂布在平皿中,在32 ℃培養箱中培養7 d,統計致死率。

1.8 致死率和正突變率 每個誘變處理36培養皿,重復3次,以未經誘變處理的孢子液為對照,致死率等于(對照處理平皿菌落-誘變處理平皿菌落)/對照處理平皿菌落×100%;正突變率等于誘變處理效價高于對照3%的菌株數/誘變處理的菌株總數×100%。

1.9 菌株遺傳穩定性測定 將選育出的高產菌株以斜面形式保存,產生孢子后取少許孢子轉入另一斜面,此為一代,連續傳代 3次,使用搖瓶檢測法測定每一代菌株的紅霉素效價,分析其遺傳的穩定性。

1.10 紅霉素堿耐受性的檢測 將孢子液稀釋后,分別均勻涂布在含有500、1000、1500 mg/L紅霉素堿的培養基上,于32 ℃培養箱培養7 d,觀察菌株的紅霉素堿耐受性。

1.11 紅霉素含量測定 參考張立軍等[16]的方法測定。

1.12 ?；o酶A合成酶活力測定 參考卞晨光等[12]的方法測定。

1.13 正丙醇對發酵的影響 分別向發酵培養基中添加0.5%、1%、1.5%濃度的正丙醇,分析不同濃度正丙醇對發酵效價的影響。

1.14 豆油對發酵的影響 分別向發酵培養基中添加0.05%、0.1%、0.15%濃度的豆油,分析不同濃度豆油對發酵效價的影響。

1.15 中試發酵培養基優化 在中試發酵培養基中分別添加1%正丙醇、0.1%豆油,以及同時加入1%正丙醇和0.1%豆油,分析不同添加物對發酵效價的影響。

1.16 數據分析 所有處理數據采用SPSS 26.0軟件進行分析,以t-檢驗檢測差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 原始菌株的復壯篩選 將引進保存的7株產紅霉素的紅色糖多孢菌菌株進行復壯,經過傳代3次,結果發現編號SE-2207菌株發酵效價較高,為6668 mg/L,且該菌株遺傳穩定性較好,作為后續誘變處理的原始菌株(表1)。

表1 原始菌株的效價及遺傳穩定性Tab 1 Potency and inheritance stability of the rejuvenation strains

2.2 EMS誘變處理 SE-2207菌株經EMS誘變處理,結果發現隨著處理時間的增加,菌體致死率呈現升高的趨勢,處理時間為3 h時,致死率為72.5%,正突變率為16.6%;處理時間為5 h時,致死率最高,達到95.2%,正突變率為11.2%,見表2。綜合考慮,確定誘變處理適宜時間為3 h。采用EMS誘變處理3 h,初篩出18株正突變菌株,經搖瓶效價檢測復篩,得到3株效價升高的菌株(編號為SEM-1、SEM-2、SEM-3),其效價分別為7422、7192、7127 mg/L。

表2 不同誘變方法誘變效果的比較Tab 2 Comparison of mutagenic effects of different mutagenic methods

2.3 UV誘變處理 SE-2207菌株經UV誘變處理,結果發現隨著處理時間增加,菌體致死率呈現升高的趨勢,處理時間60 s時,致死率為69.3%,正突變率為22.7%;處理時間為80 s時,致死率最高,達到82.1%,正突變率為10.3%。綜合考慮,確定誘變處理適宜時間為60 s,見表2。采用UV誘變處理60 s,初篩出21株正突變菌株,經搖瓶效價檢測復篩,得到3株效價升高的菌株(編號為SEM-4、SEM-5、SEM-6),其效價分別為7376、7356、7287 mg/L。

2.4 ARTP誘變處理 SE-2207菌株經ARTP誘變處理,結果發現隨著處理時間增加,菌體致死率呈現升高的趨勢,處理時間60 s時,致死率為71.5%,正突變率為19.5%;處理時間為80 s時,致死率最高,達到82.1%,正突變率為10.3%。綜合考慮,確定誘變處理適宜時間為60 s,見表2。采用ARTP誘變處理60 s,初篩出16株正突變菌株,經搖瓶效價檢測復篩,得到2株效價升高的菌株(編號為SEM-7、SEM-8),其效價分別為7656 mg/L、7731 mg/L。

2.5 優良菌株遺傳穩定性的檢測 對獲得的效價升高菌株的遺傳穩定性進行檢測,結果發現菌株SEM-1、SEM-3、SEM-4、SEM-7的遺傳穩定性較好,其中,SEM-7效價最高,達到8368 mg/L,較原始菌株SE-2207提高了25.5%(表3)。

表3 優良菌種遺傳穩定性分析Tab 3 Inheritance stability analysis of the excellent strains

2.6 優良菌株紅霉素耐受性檢測 對菌株SEM-1、SEM-3、SEM-4、SEM-7的紅霉素耐受性進行檢測,結果發現,與原始菌株相比,SEM-7在含500、1000、1500 mg/L紅霉素堿的培養基上均能較好生長,表明SEM-7菌株具有較好的紅霉素耐受性(表4)。

表4 優良菌種紅霉素耐受性檢測Tab 4 Erythromycin tolerance test of excellent strain

2.7 SEM-7菌株?；o酶A合成酶活力檢測 以原始菌株SE-2207為對照,對菌株SEM-7的?；o酶A合成酶活力進行檢測,結果發現菌株SEM-7?；o酶A合成酶活力為31.6 U/mg,較原始菌株提高了19.6%(表5)。

表5 SEM-7菌株?；o酶A合成酶活力檢測Tab 5 Activity of acyl-CoA synthetase in excellent strain

2.8 正丙醇對SEM-7菌株發酵效價的影響 測定添加不同濃度正丙醇發酵液的效價,結果發現,添加1%正丙醇的效價最高,為8757 mg/L,添加0.5%、1.5%正丙醇的效價分別為8421、8322 mg/L,而未添加正丙醇(無正丙醇)的效價為8298 mg/L,添加1%正丙醇的效價顯著高于其他三者(P<0.05),且其他三者之間無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 添加不同濃度正丙醇SEM-7發酵效價(不同小寫字母表示效價存在顯著差異(P<0.05),下同)Fig 1 Fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of n-propanol

2.9 豆油對SEM-7發酵效價的影響 測定添加不同濃度豆油發酵液的效價,結果發現,添加0.1%豆油的效價最高,為8893 mg/L,添加0.05%、0.15%豆油的效價分別為8631、7922 mg/L,而未添加正丙醇的效價為8311 mg/L,添加0.05%、0.1%濃度正丙醇的效價顯著高于未添加的(無豆油)(P<0.05),但添加0.15%的效價有所降低(圖2)。

圖2 添加不同濃度豆油SEM-7發酵效價Fig 2 Fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of soybean oil

2.10 SEM-7中試發酵條件優化 綜合上述結果,在中試發酵培養基中分別添加1%正丙醇、0.1%豆油,以及同時加入1%正丙醇和0.1%豆油,結果發現,同時添加正丙醇和豆油的效價最高,為9155 mg/L,只添加正丙醇或豆油的效價分別為8734、8792 mg/L,而未添加正丙醇和豆油(無豆油與正丙醇)的效價為8486 mg/L,同時添加1%正丙醇和0.1%豆油的效價顯著高于其他三者(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同添加物條件下中試發酵效價Fig 3 The pilot fermentation potency of SEM-7 with different concentrations of additives

3 討 論

發酵菌種性能對紅霉素生產起著極其重要的作用,而誘變選育是獲得優良性能菌種的必由途徑,EMS、UV和ARTP等誘變方法是常用且行之有效菌種誘變選育手段[17]。本研究采用EMS、UV、ARTP,選育出了高產紅霉素的紅色糖多孢菌SEM-7。這與劉峰等[8]、趙宏圖[11]所采用的誘變方法相一致。在發酵過程中,紅色糖多孢菌易受發酵產物紅霉素反饋抑制,因此菌株對紅霉素的耐受性高低是評價其性能的重要指標。本研究將紅霉素耐受性作為菌株選育的前置篩選指標,選育出的優良菌株SEM-7具有較強紅霉素耐受性,這與楊雪清等[9]所采用的選育思路及結論類似。紅霉素的生物合成起始于丙酰輔酶A,而丙酰輔酶A受?；o酶A合成酶活力的調控,有學者的研究結論表明菌株?；o酶A合成酶活力可能與紅霉素發酵效價存在一定關聯[12]。本研究發現菌株SEM-7的?；o酶A合成酶活力高于原始菌株,推測這一特性可能對其發酵效價的提高存在一定作用。

劉峰等[8]研究發現,在培養基中補加正丙醇可以大幅提高紅霉素發酵效價;沈兆兵等[18]研究發現,在紅色糖多孢菌發酵過程中補加豆油可顯著提高紅霉素產量。本研究也發現,補加正丙醇、豆油可顯著提高紅霉素產量,且提高作用與補加正丙醇、豆油的濃度相關。本研究還進一步探究了分別補加正丙醇、豆油,以及同時補加正丙醇、豆油對中試發酵的影響,發現同時補加正丙醇、豆油對發酵效價的提高作用更為顯著。劉峰等[8]認為正丙醇是內酯環生物合成前體,而紅霉素來源于內酯環生物合成途徑,在發酵過程中補加正丙醇提高了合成前體物質的濃度,進而提高了紅霉素效價。卞晨光等[12]、沈兆兵等[18]分析推測,豆油對紅色糖多孢菌產紅霉素促進機制是,豆油通過進入菌體的三羧酸循環,生成紅霉素另一前體物質2-甲基丙二酰輔酶A,繼而提高了紅霉素效價。本研究同時補加正丙醇和豆油,對紅霉素效價提高作用更強,推測可能是兩者的疊加作用所致。

本研究選育出產紅霉素的紅色糖多孢菌優良菌株SEM-7,并對菌株中試發酵條件進行了初步優化,后續還需對該菌株的性能、生成應用開展更深入的探索。