基于網絡藥理學和分子對接探索腦栓通膠囊治療腦梗死的潛在機制研究

周 紅 雷 杰 程 歡

武漢市第一醫院 湖北武漢 430000

腦梗死是一種常見的腦血管疾病,是僅次于心血管疾病的人類第二大死亡原因,也是導致殘疾的主要原因[1]。據統計,每年新發的腦梗死患者多達1 500萬左右[2],這給社會經濟帶來了沉重的負擔[3]。對個體而言,腦梗死常見的致殘性后遺癥,如運動功能損傷可能會導致患者的神經心理功能障礙,嚴重影響個體的生活質量[4]。目前,除了重組組織型纖溶酶原激活劑治療和血管內血栓切除術外,臨床尚無其他有效治療手段[5]。而已有治療手段又存在治療窗口短、療效低、出血風險大等局限性,僅有限的患者可以接受有效治療。

腦栓通膠囊是據劉河間“心火獨亢”理論組方,由蒲黃、赤芍、郁金、天麻和漏蘆5味中藥組合而成,具有活血通絡、祛風化痰之效,臨床常被用于治療風痰瘀血痹阻脈絡引起的中風一病。循證醫學證據證實[6],腦栓通膠囊可以增加血脂聯素,減少動脈粥樣硬化斑塊面積,減輕神經功能缺損,改善神經功能,在腦梗死治療方面具有一定療效。盡管臨床應用較為廣泛,腦栓通膠囊發揮療效的深層次機制尚待明確。因此,本研究擬借助網絡藥理學手段進一步探討腦栓通膠囊在腦梗死治療過程中的潛在機制,以期為其未來研究及臨床應用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 腦栓通膠囊活性成分及靶點的獲取與篩選

在TCMSP數據庫[7]中分別以蒲黃、赤芍、郁金和漏蘆為關鍵詞檢索候選化學成分及對應的蛋白靶標。由于TCMSP數據庫缺少天麻相關數據,故聯合ETCM數據庫[8]補充檢索天麻的化學成分及靶點?？诜锢枚?oral bioavailability, OB)≥30%且類藥性(Drug Like index, DL)≥0.18的化合物可被視作可經人體吸收而對機體產生活性的潛在藥物[9]。根據OB≥30%且DL≥0.18的原則篩選獲取的化學成分及所對應的靶點,并將所有藥物靶點進行合并整理,剔除重復的藥物靶點,得到總藥物靶點。將蛋白種屬設置為“homo sapiens(Human)”,利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)標準化處理藥物活性成分的蛋白靶標,獲取靶標對應的標準基因名。

1.2 腦梗死相關靶點的獲取

以“ischemic stroke”和“cerebral infarction”為關鍵詞,分別檢索以下5個數據庫:GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)和DrugBank(https://www.drugbank.ca/),從而獲取與腦梗死相關的疾病靶點基因。其次,利用InteractiVenn工具[10]將各個數據檢索到的靶點進行去重、合并,獲取腦梗死相關靶點合集。

1.3 構建“活性成分-疾病靶點”網絡圖

將所有藥物靶點和所有疾病靶點分別導入InteractiVenn平臺,獲得藥物和疾病的交集靶點,即為腦栓通膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點。下一步,將藥物關鍵活性成分、交集靶點等數據導入Cytoscape 3.8.0軟件,構建“活性成分-疾病靶點”網絡。網絡中,以不同顏色和形狀的節點表示藥物成分或靶點信息,節點間的連線表明兩者間可能存在相互作用關系。

1.4 蛋白質相互作用網絡分析

將交集靶點導入STRING數據庫[11],物種選擇為“Homo sapiens”,設定相互作用閾值置信度>0.9,并隱藏無互作關系的靶點,獲取蛋白與蛋白相互作用信息,并將其導入Cytoscape 3.8.0 軟件構建蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。接著,利用CytoNCA插件[12]對PPI網絡進行拓撲分析。拓撲分析內容包括介度中心性(betweenness centrality, BC)、接近中心性(closeness centrality, CC)、度中心性(degree dentrality, DC)、特征向量中心性(Eigenvector Centrality, EC)、局部連通中心性(Local Average Connectivity Centrality, LAC)和網絡中心性(network centrality, NC)共6個指標。篩選標準:首先,計算出所有節點BC值的中位數,再篩選出BC值大于該中位數的“核心”節點。同理依次篩選出其余5個指標大于所有節點中位數的節點,最后得到的節點即為關鍵節點。最后,將所得關鍵節點再次導入Cytoscape軟件進行子網絡分析,得到核心靶點間新的PPI網絡。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析

利用R語言clusterProfiler包[13]和pathview包[14]等工具對腦栓通膠囊與腦梗死的交集靶點進行基因本體論(Gene Ontology, GO)[15-16]和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析,并以氣泡圖形式可視化前30條GO條目和KEGG信號通路。

1.6 分子對接驗證

為了驗證篩選出的腦栓通膠囊治療腦梗死潛在靶點的準確性,將“活性成分-疾病靶點”網絡中所有的活性成分與PPI網絡拓撲分析度值排名靠前的核心靶點進行分子對接。第一步,在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索藥物活性成分,下載其2D分子結構,而后將其導入ChemBio3D軟件轉化為3D分子結構,并進行能量最小化優化,獲得最穩定的分子構象,保存為mol2格式文件。第二步,從PDB數據庫[17]下載靶點蛋白的晶體復合物,使用PyMOL軟件[18]準備蛋白,刪除靶蛋白的水分子和配體,輸出為pdb格式文件。第三步,利用AutoDockTools軟件給蛋白靶點添加非極性氫,輸出為pdbqt文件,并生成對接位點空腔。最后,分別利用AutoDock Vina軟件[19]和PyMOL軟件進行分子對接及可視化。對接完成后,根據低能量和構象合理的原則選擇最佳對接構象。

2 結果

2.1 腦栓通膠囊活性成分及靶點

以OB≥30%且DL≥0.18為條件篩選,最終得到腦栓通膠囊活性成分如下:赤芍14種、漏蘆5種、蒲黃6種、郁金3種和天麻1種。去重后剩余活性成分23種(見表1)。根據活性成分的篩選結果預測作用靶點數目如下:赤芍102種、漏蘆50種、蒲黃218種、郁金69種和天麻3種,去重后共注釋得264個腦栓通膠囊的潛在作用靶點。

2.2 腦梗死疾病靶點

通過數據庫檢索獲取的腦梗死相關靶點數量:Genecard數據庫1 855個,OMIM數據庫45個,PharmGkb數據庫105個,TTD數據庫82個,DrugBank數據庫105個。合并去重后共得到腦梗死相關靶點2043個(圖1)。

圖1 各數據庫腦梗死相關靶點數量

2.3 “活性成分-疾病靶點”網絡

比較腦栓通膠囊潛在作用靶點與腦梗死相關靶點的異同,最終發現兩者存在149種共同靶點。使用Cytoscape 3.8.0軟件構建腦栓通膠囊治療腦梗死的“活性成分-疾病靶點”網絡(圖2)。圖2包括162個節點,349條邊。淺藍色圓角矩形代表潛在靶點,圓形代表化合物。其中,紅色節點代表赤芍,黃色節點代表漏蘆,綠色節點代表蒲黃,紫色節點代表郁金,藍色節點代表天麻。

圖2 活性成分-疾病靶點網絡

2.4 PPI網絡

將149個交集靶點信息導入STRING數據庫進行分析,獲取蛋白與蛋白相互作用信息,并將生成的數據導入Cytoscape軟件生成PPI圖。通過拓撲學分析篩選出關鍵核心靶點,將初次篩選出的41個靶點再次作拓撲學分析,最終篩選出核心靶點13個:JUN、MAPK8、TNF、IL6、TP53、RB1、MAPK3、IL1B、FOS、MAPK14、MAPK1、AKT1、NFKBIA(圖3)。

圖3 PPI網絡節點拓撲篩選過程

2.5 GO功能分析

為了探討腦栓通膠囊靶點的基因功能,利用R語言進行GO功能富集分析。結果共得到2744個GO條目。分別選取生物過程(BP)、細胞組分(CC)和分子功能(MF)前10的GO功能條目繪制氣泡圖(圖4)。其中生物過程(BP)2473條,主要包括脂多糖反應(response to lipopolysaccharide)、氧化應激反應(response to oxidative stress)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)等方面;細胞組分(CC)84條,主要包括神經元胞體(neuronal cell body)、膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)和膜區(membrane region)等;分子功能(MF)187條,主要包括細胞因子活性(cytokine activity)、磷酸酶結合(phosphatase binding)、血紅素結合(heme binding)、腎上腺素能受體活性(adrenergic receptor activity)等方面。

2.6 KEGG通路富集分析

為了探討腦栓通膠囊治療腦梗死作用靶點可能涉及的通路,利用R語言進行KEGG通路富集分析。分析結果顯示腦栓通膠囊可能通過以下信號通路發揮治療作用:血流剪切應力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、細胞凋亡(Apoptosis)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)和NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等。選取KEGG富集結果前30條信號通路繪制氣泡圖(圖5)。

圖5 腦栓通膠囊對腦梗死作用靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接

通過PPI網絡拓撲分析得到核心靶點13個,對應的“活性成分-疾病靶點”網絡包括關鍵核心活性成分9個:β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、芍藥甙(paeoniflorin)、黃芩素(baicalein)、柚皮素(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)、花生四烯酸(arachidonic acid)和鞣花酸(ellagic acid),與核心靶點進行分子對接。一般認為結合能小于-4.25 kcal/mol提示配體與受體有一定的結合活性,小于-5.0 kcal/mol有較好的結合活性,小于-7.0 kcal/mol有強烈的結合活性[20]。分子對接結果顯示,網絡中關鍵活性成分與核心靶點結合能均小于-5.0 kcal/mol,說明活性成分與靶蛋白能形成穩定的結合(表2)。其中與槲皮素結合較好的靶點達到9個,用Pymol軟件將槲皮素與靶點蛋白對接結果可視化(圖6)。

圖6 槲皮素與靶點蛋白的分子對接(a: JUN;b: TNF;c: IL6;d: TP53;e: RB1;f: IL1B;g: MAPK1;h: AKT1;i: NFKBIA)

表2 活性成分與靶點蛋白結合能

3 討論

腦梗死是指因局部供血障礙而引發腦組織缺氧、缺血性壞死的危重疾病,臨床可見肢體麻木無力、言語障礙、頭暈、黑朦、意識障礙等癥,表現出發病急、病勢重、治療窗窄和致殘率高等特點,嚴重時可危及生命[21]。大量流行病學證據表明,腦梗死的發生可歸因于環境和生活方式等多種因素,包括高齡、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病以及遺傳等因素[22-24]。腦梗死發病機制較為復雜,可通過一系列復雜的機制導致神經細胞死亡和大腦功。

本研究共鑒定槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、芍藥甙、黃芩素、柚皮素、異鼠李素、花生四烯酸和鞣花酸等關鍵活性成分與腦梗死高度相關。分子對接發現,上述成分與“活性成分-疾病靶點”網絡中對應的靶點蛋白具有較好的結合活性。槲皮素是天然藥物成分中最常見、分布最廣泛的黃酮醇類化合物之一,具有抑制氧化應激和抗神經炎癥等作用[30]。實驗研究表明,槲皮素對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有神經保護、抗氧化、抗炎和抗細胞凋亡作用,這些作用與其通過降低蛋白酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性而保護ERK和Akt磷酸化有關[31]。研究表明,山奈酚治療可減輕腦缺血大鼠的神經行為缺損,減少腦梗塞體積、神經元和軸突損傷以及膠質細胞的神經病理學反應,其機制可能是通過抑制STAT3和NF-κB的激活來減輕腦缺血再灌注損傷和神經炎癥[32]。黃芩素可顯著改善腦梗死伴隨的神經功能缺損和腦水腫,其對腦缺血/再灌注的神經保護作用可能與其抑制LOX-1、COX-2、PGE2和NF-κB等炎癥介質而發揮抗炎和抗氧化作用有關[33]。

本研究發現腦栓通膠囊可能通過施加抗炎、抗氧化應激和抗細胞凋亡等作用來治療腦梗死,主要涉及的信號通路包括血流剪切應力和動脈粥樣硬化、TNF信號通路、IL-17信號通路、細胞凋亡和NF-κB信號通路等?；蚣患治霰砻鱗34],腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素17信號通路以及血流剪切應力和動脈粥樣硬化與腦缺血再灌注損傷相關。相關研究顯示,腦梗死患者的血管內皮細胞功能嚴重紊亂,形成大量內皮素,導致鈣離子內流,出現氧自由基,影響星形膠質細胞、腦血流調節以及神經元功能調節,促進TNF-α、CRP等炎性因子的釋放[35]。而腦栓通膠囊可能通過靶向抑制TNF-α的表達,緩解患者的神經炎癥水平。眾所周知,細胞凋亡對腦梗死患者神經元的功能非常重要[36]。Bcl-2家族在調節細胞凋亡中起著至關重要的作用,例如Bcl-2和Bax[37]。Bcl-2/Bax比值對調節細胞存活和死亡很重要[38]。腦栓通膠囊可能通過提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達,降低促凋亡蛋白Bax表達,從而抑制神經元凋亡,保護受損腦組織。

綜上,腦栓通膠囊中的槲皮素、山奈酚和黃芩素等多種成分協同作用于TNF、NFKBIA和JUN等關鍵靶點,調節TNF信號通路、IL-17信號通路、細胞凋亡和NF-κB信號通路等通路,發揮抗炎、抗氧化應激和抗細胞凋亡等作用,從而達到治療腦梗死的目的。雖然本研究由于條件所限未能進一步開展實驗驗證,但是,既往研究已經表明,繼發于腦缺血后的神經炎癥反應會抑制神經組織再生,是影響腦康復的重要因素。將來我們將進一步圍繞腦栓通的抗炎作用機制展開實驗研究,從實驗層面驗證上述結果的可靠性[39]。本研究結果可為腦栓通膠囊的深入研發和臨床應用提供參考。當然,由于網絡藥理學本身方法學的局限性,本研究結果可能存在一定偏差,今后需進一步開展試驗驗證。