耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的耐藥機制及特征分析

王亞平 麥吾麗旦·居來提 張中文 李玉珍 徐令清 溫偉洪

1 廣州醫科大學附屬第六醫院//清遠市人民醫院 廣東清遠 511518; 2 廣東醫科大學 廣東東莞 523000

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是一種重要的革蘭陰性桿菌病原體,經常導致人類嚴重感染。其中,耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)為臨床常見且重要的多重耐藥革蘭陰性桿菌,在世衛組織公布的急需新型抗生素的重點病原體列表中,CRPA被列為優先 I 級(危急),僅在美國每年就有51000例院內感染和400例死亡病例是多重耐藥銅綠假單胞菌的引發的[1]。在中國,對銅綠假單胞菌菌株的監測是近二十年來每年實施的醫院感染控制戰略計劃的一部分。碳青霉烯類抗生素是目前抗菌譜最廣、抗菌活性最強的β內酰胺類抗生素,但隨著其頻繁使用,碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌檢出率日益增加。頭孢他啶/阿維巴坦(ceftazidime-avibactam,CZA)是一種新型β-內酰胺酶抑制劑合劑,在臨床上CZA主要用于治療不產B類金屬β-內酰胺酶的碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌和CRPA引起的感染[2],但近年CZA耐藥CRPA逐漸增加?；诖?本文對本院近年臨床分離的CRPA進行耐藥性分析,重點關注CRPA對CZA耐藥狀況,同時了解本院CRPA對碳青霉烯類耐藥機制,旨在為臨床治療CRPA感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

依據微生物標本采集規范,收集廣州醫科大學附屬第六醫院2020—2022年臨床分離的非重復CRPA共22株,質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853,每批號試劑必須進行質控,確保試劑性能在控。

1.1.2 儀器試劑

BD phoenix M50全自動鑒定藥敏分析儀、革蘭陰性細菌鑒定藥敏復合板等配套耗材、陽離子調節MH(cation adjusted mueller hinton broth,CAMHB)肉湯(美國BD公司),碳青霉烯酶檢測試劑盒(天津一瑞生物公司),頭孢他啶粉劑、阿維巴坦粉劑(北京索萊寶公司),血瓊脂平板、MH平板(鄭州安圖公司)。

1.2 方法

1.2.1 CRPA菌株鑒定與藥敏檢測

采用BD Phoenix M50全自動藥敏分析儀進行PA菌株鑒定與藥敏分析,實驗操作嚴格按照儀器操作規程進行,藥敏判讀標準參考2022 CLSI抗微生物藥物敏感性試驗標準,CRPA判斷標準:PA對亞胺培南MIC8 μg/mL或美羅培南MIC8 μg/mL判讀為CRPA。

1.2.2 CRPA菌株CZA最低抑菌濃度檢測

1.2.2.1 菌液配備 用無菌棉拭子蘸取培養16～18 h新鮮CRPA菌落,使用無菌生理鹽水調配成0.5麥氏濃度菌懸液(菌落數約1.5×108CFU/mL),然后用CAMHB肉湯稀釋50倍(菌落數約3×106CFU/mL)。

1.2.2.2 抗菌藥物溶液配備 配備頭孢他啶及阿維巴坦貯存液,頭孢他啶溶劑為碳酸鈉,稀釋液為水,貯存液藥物濃度為32 768 μg/mL;阿維巴坦溶劑、稀釋液均為水,配置的貯存液藥物濃度為16 μg/mL。

1.2.2.3 微量肉湯稀釋法檢測CZA的MIC 用相應稀釋液將頭孢他啶抗菌藥貯存液稀釋至相應濃度,頭孢他啶共12個稀釋濃度,每孔分別加相應濃度頭孢他啶50 μL及阿維巴坦溶液25 μL,每孔加稀釋后菌液25 μL菌液,最終菌液濃度為7.5×105CFU/mL,阿維巴坦濃度為4 μg/mL,總體積為100 μL,置35℃培養箱培養16～18 h后觀察結果,判讀CZA的MIC。

1.2.3 CRPA菌株碳青霉烯酶檢測

1.2.3.1 采用改良碳青霉烯類滅活試驗(mCIM)試驗篩查CRPA菌株碳青霉烯酶,結果判斷操作嚴格按照2022 CLSI抗微生物藥物敏感試驗執行標準進行。實驗步驟:①取10 μL接種環滿環的銅綠假單胞菌于血瓊脂平板上過夜培養純菌落。②取過純菌落于TSB肉湯中混勻,每管放入含10 μg美羅培南的無菌紙片完全浸入菌懸液。③孵育結束后用生理鹽水制備0.5麥氏濁度大腸埃希菌ATCC25922懸液。④將美羅培南紙片從肉湯中擠去多余水分,貼于已涂布ATCC25922的MH平板上,然后倒置平板孵育18～24 h,量取抑菌圈直徑。美羅培南抑菌圈直徑≤15 mm或者直徑為16～18 mm但抑菌圈內有散在菌落判斷為碳青霉烯酶陽性,抑菌圈直徑≥19 mm則判斷為陰性。

1.2.3.2 采用膠體金免疫層析法篩查CRPA菌株5種碳青霉烯酶酶型,包括IMP、VIM、NDM、KPC、OXA-48,酶免疫層析法篩查CRPA菌株5種碳青霉烯酶,包括IMP、VIM、NDM、KPC、OXA-48,操作方法:于試管中滴加5滴細菌裂解液,挑取一接種環新鮮純培養菌于裂解液中,輕輕混勻后滴加100 μL裂解后的菌液于樣品孔中,15 min觀察結果,結果判讀:根據檢測條上紅色線條位置判斷碳青霉烯酶種類。

1.2.3.3 采用全基因組測序對碳青霉烯酶篩查陽性菌株進行碳青霉烯酶耐藥基因檢測,菌株外送廣東美格基因科技有限公司進行全基因組測序,對于返回的全基因組測序數據,使用fastq v0.20軟件對數據進行質控[3],確保測序數據質量符合要求。隨后使用SPAdes v3.13.1軟件將測序后的雙端序列組組裝[4]。經過組裝后,使用contig-tools軟件(https://gitlab.com/antunderwood/contig_tools)去除長度小于500 bp的contigs;接著使用kraken2 v 2.1.2軟件將組裝完成的contigs與kraken2物種分類數據庫進行對比完成菌種鑒定[5]。獲得組裝完成的contigs后,ABRicate v0.8.7軟件(https://github.com/tseemann/abricate)基于ResFinder用于對樣本含有的耐藥基因進行鑒定[6]。mlst v2.23.0 軟件(https://github.com/tseemann/mlst - Torsten Seemann)用于比對管家基因從而鑒定菌株的ST分型。

2 結果

2.1 CRPA臨床分布特征

在22株CRPA中,男性患者20例(90.9%)高于女性患者2例(9.1%);年齡分布范圍為39～89歲,平均68.3歲,60歲及以上患者17例(77.3%)顯著高于60歲以下的患者;科室分布主要是危重醫學科13例(59.1%),其次是呼吸內科4例(18.2%)、神經內科3例(13.7%)、神經外科和普通外科各1例(4.5%);標本類型中最常見的是痰液標本14例(63.8%),其次是肺泡灌洗液標本4例(18.2%),尿液、膽汁和腹腔引流液標本各1例(4.5%)。

2.2 CRPA耐藥特征及碳青霉烯酶檢測結果

在收集到的22株臨床分離CRPA菌株中,耐藥率最低的為頭孢他啶/阿維巴坦(22.7%),其次為慶大霉素和阿米卡星(27.3%),哌拉西林/他唑巴坦(59.1%),頭孢吡肟(63.6%)。耐藥率在70%以上的依次是頭孢他啶和氨曲南(77.3%),環丙沙星(86.4%),左氧氟沙星(95.5%)。mCIM試驗初篩碳青霉烯酶陽性共5株,膠體金免疫層析法檢測產碳青霉烯酶CRPA共5株,兩者結果一致,詳情見表1。

表1 CRPA耐藥特征及碳青霉烯酶檢測結果

2.3 CRPA全基因組測序結果

全基因組測序結果顯示,在5株碳青霉烯酶篩查陽性的CRPA中,4株產金屬β-內酰胺酶IMP-45及絲氨酸酶OXA-1,OXA-50,且均為ST549型,1株產金屬β-內酰胺酶NDM-1,為ST245型,而CZA耐藥CRPA菌株均產金屬β-內酰胺酶,這與膠體金免疫層析法檢測結果與mCIM結果一致。此外,5株CRPA全部攜帶與銅綠假單胞菌的毒力密切相關的ExoS、ExoT和ExoY基因。

3 討論

PA耐藥機制包括天然耐藥、獲得性耐藥、適應性耐藥,耐藥表型可呈多重耐藥(Multiple drug-resistance,MDR)、廣泛耐藥(Extensively drug-resistant,XDR)、全耐藥(Pan drug-resistance PDR),難治耐藥性(Difficult-to-treat resistance DTR),其中CRPA為臨床上常見且重要的多重耐藥菌。據我國細菌耐藥監測網數據顯示,PA在2005至2018年期間對碳青霉烯類藥物的耐藥率保持在25%-30%,2022年對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為22.1%和17.6%[7],近幾年呈緩慢下降趨勢。Zhao等[8]收集了廣東省10家醫院的416株PA,CRPA占比96.9%,MDR和XDR多達64.8%和15.7%。以上種種證據表明,CRPA感染和治療的形勢依舊嚴峻。此外,相對于碳青霉烯類敏感銅綠假單胞菌,CRPA感染給患者帶來更長的住院時間及更高的死亡率[9-10]。Khalili等[11]納入了7家醫院患者的116株研究發現,入住ICU、機械通氣及菌株全耐藥是CRPA感染導致死亡率上升的最重要因素。Hu等[12]研究數據顯示CRPA感染危險因素包括年齡≥60歲患者、住院尤其是入住ICU。本研究中,22株CRPA中≥60歲患者17例,分布科室主要是危重醫學科,這與國內外的研究結果相一致。原因可能主要是患者基礎疾病多、病情危重、自身抵抗力低及各種侵入性操作頻繁等造成了CRPA的產生。

頭孢他啶/阿維巴坦(CZA)是一種新型β-內酰胺酶抑制劑合劑,阿維巴坦可抑制A類、C類、部分D類(如OXA-48)絲氨酸β內酰胺酶而不能抑制B類金屬β-內酰胺酶[13],因此在臨床上CZA主要用于治療不產B類金屬β-內酰胺酶的碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌和CRPA引起的感染[2],相對于粘菌素B,CZA治療CRPA具有更低的死亡率和更高的細菌清除率[14]。但隨著CZA應用,CZA耐藥PA隨之出現,國內外報道逐漸增多。Yin等[15]報道34.3% CRPA對CZA耐藥,Frieder等[16]報道50.9% XDR的PA對CZA耐藥,Zhu等[17]報道49.7% 攜帶blaKPC基因的CRPA對CZA耐藥。本次研究的22株CRPA中,CZA耐藥率最低,僅為22.7%,且后續檢測菌株均未攜帶blaKPC基因,這可能與研究地域有關,此外樣本量不足也是本院CRPA菌株體外實驗對CZA耐藥率低的原因之一,需要我們后續加大菌株數量進一步證實。CZA耐藥PA的出現進一步增加臨床選擇抗菌藥物治療CRPA的難度。本研究中,僅有CZA、慶大霉素和阿米卡星耐藥率低于30%,其他抗菌藥物耐藥率均超過50%,但由于氨基糖苷類藥物靜脈給藥時在肺泡濃度較低,一般不作為單藥治療。粘菌素也常常用于治療CRPA引起的感染,但由于粘菌素腎毒性較大同時存在異質性耐藥。這些均體現了院內感染CRPA耐藥的嚴重形勢?；诖?我們建議本院臨床可將CZA可作為治療CRPA感染經驗用藥,為臨床提供新的治療思路。另外,本組實驗結果顯示,本院CRPA主要分離自呼吸道標本,由于呼吸道標本來源細菌難以區分感染或定植,因而為了結果接近臨床,實驗室人員宜對呼吸道標本進行涂片鏡檢質量評估,合格呼吸道標本來源CRPA為感染可能性較大,臨床醫生對此類呼吸道標本來源CRPA需綜合評估其屬致病菌可能性,避免抗菌藥物不合理使用。

本全基因組測序的結果顯示,在5株碳青霉烯酶篩查陽性的CRPA中,4株產金屬β-內酰胺酶IMP-45及絲氨酸酶OXA-1,OXA-50,1株產金屬β-內酰胺酶NDM-1,這與膠體金免疫層析法檢測結果及mCIM結果一致,體現了現有膠體金試劑盒可以作為臨床快速精準判斷的一種手段。此外,OXA屬于D類碳青霉烯酶,有不同的β-內酰胺酶類抗生素水解譜,大多數屬于窄譜β-內酰胺酶[30]。有研究指出OXA可能對β-內酰胺酶的內在敏感性水平有影響,盡管在耐藥性仍需要進一步闡明[31]。OXA-50是唯一存在于PA中的D類碳青霉烯酶,濫用β-內酰胺酶會造成OXA-50變體的出現,這會改進的亞胺培南的水解光譜[32]。因此,突變體的出現會導致逃逸現象的產生,進而造成更多耐藥菌株的的出現。CRPA具有非常多樣化的適應性特征和毒性機制,感染過程的第一步是PA與上皮宿主細胞結合,與宿主細胞接觸后,III型分泌系統被激活,將分泌的毒素(ExoS、ExoY、ExoT和ExoU)直接注入宿主的細胞質,在這種細菌的入侵和傳播期間,這些效應蛋白在不同程度上參與細胞毒性[33-34]。全基因組測序的5株菌株均含有與毒力相關ExoS、ExoT和ExoY基因。研究表明,ExoS編碼一種具有GTP酶激活蛋白活性的細胞毒素和腺苷二磷酸核糖基轉移酶活性[35]。ExoY是一種腺酰環化酶,其作用破壞肌動蛋白細胞骨架,抑制宿主細胞的細菌吸收,并增加內皮滲透性;然而,ExoY在感染中的重要性仍不清楚[36]。ExoT是PA臨床和環境菌株基因組中最普遍的效應劑[37]。毒力基因的存在和缺失的變異可能也是耐藥機制中最為明顯的效應蛋白。但由于本次實驗菌株量有限,所以不能確定碳青霉烯類抗生素耐藥與毒力基因的存在之間是否有直接關系。另外,全球流行的高毒力銅綠假單胞菌克隆株ST型主要為ST111、ST175、ST235[38-39],廣東地區主要流行ST244、ST274、ST1971和ST313等[8]。本組實驗結果顯示5株產金屬β-內酰胺酶的CRPA的ST型為ST549型(4株)和ST245型(1株),并未出現上述高毒力克隆株。國內學者從慢阻肺患者體內分離出ST549[40],國外學者在墨西哥一家醫院也分離出了ST549[32]。此外,國外一項關于50個多重耐藥革蘭氏陰性菌分離株抗菌藥物耐藥基因的研究發現了1株ST245型PA[41],2019年巴西也首次發現了ST245[42]。

綜上所述,本院CRPA對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率低,產碳青霉烯酶不是CRPA對碳青霉烯類耐藥主要機制,而產金屬β-內酰胺酶可能是CRPA對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥主要機制。但本研究仍存在一定的不足之處,1.收集的CRPA菌株量較少、未對菌株進行粘菌素藥敏檢測,CRPA耐藥數據不夠詳細;2.本組實驗只對5株碳青霉烯酶初篩陽性菌株進行全基因組測序分析其碳青霉烯酶耐藥基因和ST分型,日后應對不產碳青霉烯酶CRPA進行碳青霉烯類耐藥機制分析及分子流行病學分析,協助臨床更好防治CRPA感染。