萎縮芽孢桿菌WL520生物活性及干旱脅迫下促紫花苜蓿生長效應

武玲玲,謝永麗,2,3*,楊 杰,楊 雪,2,李俊熹,王 添,高 英,常斐斐

(1.青海大學農牧學院,青海 西寧 810016; 2.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室,青海 西寧 810016;3.青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室,青海 西寧 810016)

草地資源涉及一定地域范圍內的草地類型、面積和分布情況,以及由它們所產生的物質蘊藏量,是青海省畜牧業發展的重要基礎,對青海省經濟及生態效益具有重要作用[1]。干草及飼草料加工是畜牧業生產的重要來源,然而青海地區屬內陸西部地區,海拔高(1 644～6 851 m),紫外線強,常年溫度較低,降雨量少,干旱、半干旱、沙荒地較多,包括柴達木盆地、海西州全境等諸多地方都屬于干旱氣候區,牧草種植后因干旱低溫等不利環境因素導致牧草產量和品質降低,草牧業發展嚴重受限,進而對整個青海省畜牧業發展產生了不利影響。同時,青海干旱低溫的氣候條件導致草地生態系統脆弱,土壤貧瘠,植被覆蓋率低,能作為飼草的植物品種相對較少,加之秋冬季節草場植被枯黃,導致可利用優良牧草生長期短,產草量低[2-3]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為世界范圍內栽培歷史最悠久,種植面積最廣泛的豆科苜蓿屬(MedicagoL.)多年生草本植物[4],其優質高產、耐刈割的生產特性及保持水土等生態功能使其作為我國農業產業結構調整、發展優質牧草產業的重要選擇[5-6],同時作為優質高產飼草資源在青海廣泛種植利用。然而,病害逐漸成為制約紫花苜蓿產量增加和質量提升的主要因素。銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum),屬半知菌亞門真菌,普遍存在于土壤和動植物中,可引起苜蓿根腐病[7];禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum),又稱禾谷鐮刀菌,是引起包括苜蓿在內等多種植物病害的真菌病害之一[8];同時,干旱嚴重制約了其產量的提升和種植面積的擴大。因此,提高紫花苜蓿產量及品質可為解決牧草資源短缺及青海草地生態恢復提供指導依據和實踐方法[9-11]。

芽孢桿菌作為一類重要的植物根際促生菌(PGPR),具有能夠進行根系定殖、可產植物激素、分泌多種抗菌物質等特點,部分芽孢桿菌具有較強的抵抗逆境脅迫的能力[12],能夠與宿主植物建立良好的共生關系,且因其良好的拮抗、促生等活性成為了研究熱點[13]。柴加麗等[14]報道,芽孢桿菌作為土壤中廣泛存在的PGPR,自身能夠產生植物生長激素,如赤霉素、生長素及亞精胺等,或產生揮發性化合物(Volatiles),如2,3-丁二酮等物質直接促進植物生長;芽孢桿菌也可通過產生植酸酶、嗜鐵素等促進植物對難溶性磷、鐵等元素的吸收,從而提高植物根際養分,還可通過抑制植物病原菌的生長,降低植物病害的發生,從而間接促進植物生長[15-16]。黃秋斌等[17]研究發現蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) B3-7可定殖在小麥根系,降低小麥紋枯病(Sharp eyespot of wheat)的侵染,從而提高小麥的生物量。楊雪等[18]報道解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) DGL1提高了燕麥(AvenasativaL.)的葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)等含量,且增加了牧草產量,對高原牧草的生長發育產生了顯著影響。鑒于此,我們提出了篩選能夠應對干旱脅迫并具有優良性狀的根際促生菌,為逆境環境下促進牧草生長、提高作物產量及改善生態環境等提供研究思路及解決方案。

本研究以分離自青海干旱沙地白刺根際的芽孢桿菌菌株WL520為材料,對菌株拮抗活性、耐逆性、產IAA及固氮能力進行測定,并進一步測定干旱脅迫下,菌株對紫花苜蓿生長及耐逆性方面的影響,以期為耐干旱生物菌肥的研發提供優質菌源,同時為促進紫花苜蓿生長、退化植被修復等方面提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料:紫花苜蓿(M.sativa)‘新牧1號’由青海省海南藏族自治州同德牧場提供;

菌株:芽孢桿菌WL520分離自青海省海西蒙古藏族自治州烏蘭縣沙地白刺(N.tangutorum)根際;

病原菌:銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)由青海大學草地資源與省部共建實驗室保存;

試劑及培養基:革蘭氏碘液[19]、Salkowski比色液[20]、LB培養基[21]、PDA培養基[22]、Ashby無氮培養基[22]、蛋白酶檢測培養基、淀粉酶檢測培養基、果膠酶檢測培養基、β-1,3-葡聚糖酶檢測培養基[20]。

1.2 方法

1.2.1菌株拮抗病原真菌活性測定 打取直徑為5 mm銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)菌餅,分別接種至PDA平板中央,以菌餅為中心的4個對稱點作為接種點,各放置4個直徑 4 mm濾紙小圓片;將菌株WL520接種于5 mL的LB液體培養基中,以37℃,200 r·min-1振蕩培養12 h后,將菌液點接在濾紙小圓片中央培養2 d后觀測菌株抑菌圈的直徑并記錄。

抑菌水解酶活性:用直徑為5 mm的打孔器分別在蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、β-1,3-葡聚糖檢測培養基中央打孔;吸取5 μL活化后的WL520菌液接種至4種檢測培養基中央,28℃恒溫培養箱中培養3 d。蛋白酶、果膠酶檢測培養基直接觀察是否有透明圈產生;淀粉酶、β-1,3-葡聚糖酶檢測培養基分別利用革蘭氏碘溶液、0.1%的剛果紅溶液浸染靜置10 min后,倒去染液,觀察培養基是否有透明圈產生,根據所形成的透明圈判斷該菌株是否具有產水解酶特性。

1.2.2菌株耐旱性測定 利用PEG-6000人工模擬干旱條件,將菌株WL520分別接種至含9%,11%,14%,16% PEG-6000的LB液體培養基中,置于恒溫培養箱37℃,200 r·min-1條件下恒溫振蕩培養12 h制成菌懸液,利用分光光度計測定其OD600值,以不含PEG-6000的LB液體培養基為對照,測定菌液的吸光度值,分析菌株耐旱性。

1.2.3菌株產IAA能力測定 菌株WL520活化14 h后恒溫振蕩培養7 d后與Salkowski比色液(10 mL 0.5 mol·L-1FeCl3+ 30 mL蒸餾水+50 mL 98% H2SO4)按2∶1體積比混合至白色陶瓷板中,黑暗靜置30 min,1個處理3個重復,以LB液體為對照,觀察是否發生顯色變化,若溶液變為紅色,則表明菌株具有產IAA能力;將菌株菌懸液離心(4℃,10 000 r·min-1)10 min,取5 mL上清液于離心管中,加入等量比色液,避光靜置30 min后測定其OD530值,根據所繪制的標準曲線計算菌株WL520產IAA的量[21]。

1.2.4菌株固氮能力測定 將WL520菌株接種至LB液體培養基,振蕩培養12 h后吸取5 μL菌液轉接至Ashby無氮液體培養基中搖床恒溫(37℃)培養3 d,所配制的Ashby培養基中加入具有固氮能力的芽孢桿菌,該培養基顏色發生變化,菌液變渾濁。根據顏色變化來判斷該芽孢桿菌是否具有固氮能力,根據菌液在試管中是否變渾濁作為判斷依據,檢測其固氮能力;同理,吸取5 μL菌液接種于Ashby固體培養基中,在37℃恒溫培養箱中培養3 d,觀察并記錄菌落生長情況,根據所形成的透明圈大小,檢測其固氮能力[23]。

1.2.5菌株的分子鑒定 16S rDNA基因序列:以芽孢桿菌WL520基因組DNA為模板進行16S rDNA擴增。引物序列:正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,反向引物1492R:5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增條件:95℃ 4 min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃2 min,34個循環;72℃ 10 min。16S rDNA擴增產物純化后測序,測序結果通過NCBI數據庫進行BLAST比對,并通過MEGA7.0軟件制作系統發育樹[24]。

gyrB基因序列:以WL520菌株基因組DNA為模板進行gyrB基因擴增,引物序列:正向引物UP2r:5′-AGCAGG-GTACGGATGTGCGAGCCR-TCNACRTCNGCRTCNGT-CAT-3′,反向引物UP1:5′-GAAGTCATCATGAC-CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′。PCR擴增條件:95℃ 4 min,98℃ 10 s,62℃ 1 min,72℃ 2 min,30個循環;72℃ 8 min。將gyrB基因擴增產物純化后測序,測序結果同上述方法一致,通過MEGA7.0軟件制作系統發育樹。

1.2.6干旱脅迫下WL520促紫花苜蓿生長效應測定 紫花苜蓿培養:挑選籽粒飽滿,大小均勻的紫花苜蓿種子于溫水中浸泡30 min軟化種皮,用10%次氯酸鈉溶液消毒20 min后用無菌水沖洗3～5次后自然風干。將風干后的種子置于直徑為10 cm,高度為10 cm的0.35 L花盆中進行盆栽試驗,50?！づ?1,播種于無菌土中,將其置于28℃,光/暗周期16 h/8 h的光照培養箱中培養15 d左右。

菌懸液制備:將菌株WL520接種于含有100 mL LB液體培養基的錐形瓶中,37℃,200 r·min-1條件下培養12 h,轉入50 mL離心管,在8 000 rpm·min-1條件下離心5 min,棄上清,無菌水洗滌菌體3次,加入適量無菌水將菌體懸浮,使用分光光度計測定其600 nm下的吸光度值,待其OD600值調至1.00制成菌懸液。

紫花苜蓿不同處理組:培養7 d左右,待植株高度達到5～10 cm時,配制15% PEG-6000溶液,采用PEG-6000人工模擬干旱條件,設置4個不同處理組:CK,無菌水為對照,對紫花苜蓿進行灌根處理,每3 d灌根1次,共灌根5次;CK+B,用WL520菌株菌懸液對紫花苜蓿進行灌根處理,每3 d灌根1次,共灌根5次;D,無菌水每3 d灌根1次,共灌根2次后,用15% PEG-6000溶液每3 d灌根1次,共灌根3次。DB,用15% PEG-6000干旱脅迫對紫花苜蓿進行灌根處理,每3 d灌根1次,共灌根2次后,用菌株菌懸液每3 d灌根1次,共灌根3次。每次灌根45 ml,經灌根處理后,對其進行洗根處理,取出每組不同處理下的15株苜蓿,測定株高、鮮重等生長生理指標[25-26]。

葉綠素含量測定:參考植物生理學實驗指導書[27]。稱取0.2 g新鮮苜蓿葉片,擦凈剪碎放入研缽中,加入2 mL提取液(96%乙醇),充分研磨成勻漿狀至組織變白;過濾并用提取液洗滌后定容至25 mL棕色容量瓶,搖勻;立即測定OD665、OD649和OD470值并按照公式計算苜蓿幼苗組織中葉綠素的含量。

超氧化物歧化酶(SOD)含量測定:參照植物生理學實驗指導書[27]。稱取苜蓿葉片2.5 g,加入少量pH=7.8的磷酸緩沖液,研磨成勻漿,轉移至25 mL容量瓶中,用同一緩沖液定容;在4℃下,10 000 r·min-1,離心15 min,上清液即為酶粗提取液;取5 mL離心管4支(2支為測定管,2支為對照管),加入反應試劑后混勻;1支對照管進行遮光處理,與其他各管同時置于4000 lx日光燈下反應,溫度設為35℃;30 min后測定OD560下的吸光度值,按照公式計算SOD活性。

丙二醛(MDA)含量測定:參考植物生理學實驗指導書[27]。稱取1 g新鮮苜蓿葉片,加入少量10% TCA和石英砂于研缽中,研磨至勻漿;以4 000 r·min-1離心10 min,吸取2 mL上清液并加入2 mL 0.6% TBA(硫代巴比妥酸)溶液,對照加蒸餾水2 mL,混勻后于沸水浴上反應15 min,迅速冷卻后再離心,取上清液測定OD532、OD600和OD450值,并按照公式計算苜蓿幼苗組織中MDA的含量。

2 結果與分析

2.1 菌株WL520的拮抗活性

2.1.1拮抗病原真菌活性 以銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)為病原指示菌,測定菌株WL520拮抗病原真菌活性,發現芽孢桿菌WL520對銳頂鐮孢菌、禾谷鐮孢菌抑菌圈直徑分別為16.70 mm、15.20 mm,能較好的抑制病原真菌的生長,表現出良好的拮抗病原真菌活性(圖1,表1)。

表1 菌株WL520拮抗病原真菌活性Table 1 Antagonistic activity of strain WL520 to fungal pathogens

圖1 菌株WL520拮抗病原真菌活性Fig.1 Antagonistic activity of strain WL520 to fungal pathogens注:A,拮抗禾谷鐮孢菌活性;B,拮抗銳頂鐮孢菌活性Note:A,Antagonistic activity to F. graminearum;B,Antagonistic activity to F. acuminatum

2.1.2抑菌水解酶活性 菌株WL520可在蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、β- 1,3 -葡聚糖酶4種抑菌水解酶檢測培養基上產生透明圈,表明該菌株在生長過程中具有產生蛋白水解酶、淀粉水解酶、果膠水解酶、β-1,3 -葡聚糖酶4種抑菌水解酶的能力(圖2)。

圖2 菌株WL520抑菌水解酶活性Fig.2 Determination of antimicrobial activity of strain WL520注:A,蛋白酶活性;B,淀粉酶活性;C,果膠酶活性;D,β-1,3-葡聚糖酶活性Note:A,Protease activity;B,Amylase activity;C,Pectase activity;D,β-1,3-Glucanase activity

2.2 菌株WL520耐旱性

干旱條件下,植物生長發育會受到嚴重制約,導致葉片葉綠素含量降低,含有細胞毒性的代謝物質積累,從而使成株植物發生萎蔫。菌株WL520在含有PEG-6000濃度為9%,11%,14%,16%的LB液體培養基中均能生長(圖3),表明該菌株具有一定的耐旱性。

圖3 芽孢桿菌WL520耐干旱性Fig.3 Drought tolerance of Bacillus WL520

2.3 菌株WL520產IAA能力

通過對菌株WL520進行定性及定量的產IAA能力測定,發現菌株在按一定比例混合的Salkowski溶液當中變紅,表明菌株WL520具有產IAA能力;通過繪制標準曲線,得到標準方程為y=0.032x+0.019,測得菌株WL520在530 nm處的OD值為0.386,計算得到其菌株分泌IAA的含量為11.47 mg·L-1,表明菌株WL520具有較好的產IAA能力(圖4)。

圖4 芽孢桿菌WL520產IAA顯色反應Fig.4 IAA chromogenic reaction of Bacillus WL520

2.4 菌株WL520固氮能力

有固氮能力的芽孢桿菌增強植物吸收氮元素、改善土壤理化性質。將培養12 h后的WL520菌液接種在液體及固體Ashby無氮培養基上后,菌液在液體培養基中渾濁且在無氮固體培養基上形成菌落,表明菌株WL520具有一定的固氮活性(圖5)。

2.5 菌株WL520分子鑒定

將擴增到的菌株WL520的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列在NCBI數據庫內進行BLAST同源性序列比對并構建基因序列系統發育樹。16S rDNA比對結果顯示:菌株WL520與B.atrophaeusM43具有99%的同源性(圖6);gyrB比對結果顯示菌株WL520與B.atrophaeusBA59具有100%的同源性(圖7);菌株WL520鑒定為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖6 基于16S rDNA基因序列構建的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed based on 16SrDNA gene sequence

圖7 基于gyrB基因序構建的系統進化圖Fig.7 Phylogenetic diagram based on gyrB gene sequence construction

2.6 干旱脅迫下WL520促紫花苜蓿生長效應

2.6.1紫花苜蓿生物量 菌株WL520菌懸液對紫花苜蓿灌根處理(CK+B)后,植物株高、根長及鮮重分別達到11.33 cm,10.27 cm和0.165 5 g,與對照(CK)相比,分別提高了53.73%,12%和65.01%;干旱脅迫下,菌懸液灌根(DB)后植株株高、根長及鮮重分別達到10.93 cm,11.63 cm和0.122 4 g,與干旱脅迫(D)相比,其株高、根長及鮮重分別提高了17.91%,40.12%和57.53%;菌懸液灌根(CK+B)處理后紫花苜蓿株高及鮮重與對照(CK)、干旱脅迫(D)形成顯著差異,其根長沒有顯著差異(P<0.05)。因次,具有干旱耐受性的萎縮芽孢桿菌WL520對紫花苜蓿具有一定促生作用,并在干旱脅迫下對紫花苜蓿具有促生效應(圖8,表2)。

表2 紫花苜蓿生物量測定Table2 Biomass determination of alfalfa

圖8 干旱脅迫下WL520促紫花苜蓿生長效應Fig.8 Growth-promoting effect of WL520 on alfalfa under drought stress注:CK,對照;CK+B,菌液灌根;D,干旱處理;DB,干旱處理+菌液,下同Note:CK,control;CK+B,root-irrigation by bacterial suspension;D,drought treatment;DB,root-irrigation under drought stress,the same as below

2.6.2紫花苜蓿葉綠素含量 與對照(CK)相比,菌懸液灌根處理(CK+B)后的紫花苜蓿葉綠素含量提高了26%;與干旱處理(D)相比,菌懸液灌根(DB)后其葉綠素含量提高了12%。因此,在菌液灌根(DB)后正常生長和干旱脅迫下,均可提高紫花苜蓿葉綠素含量(圖9)。

圖9 紫花苜蓿葉綠素含量Fig.9 Chlorophyll content of alfalfa

2.6.3紫花苜蓿超氧化物歧化酶(SOD)含量 菌懸液灌根(CK+B)后紫花苜蓿SOD含量為103.2 μg·g-1FW,與對照(CK)相比,明顯提高了72.76%(圖10);干旱脅迫(D)下,植株SOD含量為62.4 μg·g-1FW,菌懸液灌根(DB)后,植株SOD含量為97.87 μg·g-1FW,含量提高了56.84%。菌懸液灌根后,增加了紫花苜蓿體內SOD的含量;SOD能夠通過清除植物體內過量的氧自由基來保持細胞結構和生物大分子的完整性,從而提升了紫花苜蓿的抗逆性。

圖10 紫花苜蓿SOD活性測定Fig.10 Determination of SOD activity in alfalfa

2.6.4紫花苜蓿丙二醛含量 與對照(CK)相比,菌懸液灌根(CK+B)后紫花苜蓿丙二醛含量為1.553 μmol·g-1FW,相比CK降低了5.41%;干旱脅迫(D)處理后,丙二醛含量明顯升高,達到2.977 μmol·g-1FW,而在菌懸液灌根(DB)后丙二醛含量為1.618 μmol·g-1FW(圖11),相比干旱脅迫(D)降低了45.65%,說明在干旱脅迫(D)下紫花苜蓿生物膜脂過氧化程度提高,而在菌懸液灌根(DB)后丙二醛含量降低,表明菌株WL520可減緩紫花苜蓿膜脂過氧化程度、降低丙二醛含量,從而提高紫花苜蓿的耐旱性。

圖11 紫花苜蓿丙二醛含量Fig.11 Determination of malondialdehyde content in alfalfa

3 討論

紫花苜蓿富含蛋白質、維生素等營養成分,因其抗逆性強、生長迅速等特點已成為世界上最主要的飼料作物之一。干旱脅迫作為最主要的非生物脅迫因子之一,限制了苜蓿的正常生長發育,因此探究提高紫花苜?？购档姆椒▽朔珊档貐^紫花苜蓿栽培的制約具有重要意義[28-29]。

芽孢桿菌營養需求簡單、繁殖生長快、可產抗逆性芽孢等特點而具有顯著生防潛力,成為研發生防菌劑的理想菌株[30]。芽孢桿菌在生長過程中所產生的代謝產物,如Surfactin、Fengycin、EPS、鏈霉素等能抑制病原菌生長,從而間接促進植物的生長[31]。本研究發現菌株WL520對禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和銳頂鐮孢菌(F.acuminatum)有顯著拮抗作用,同時,它能夠產生蛋白酶、淀粉酶、果膠酶等抑菌酶類[32],推測其可通過水解病原菌細胞壁成分而抑制病原菌的生長,間接促進植物生長、提高植物產量。IAA是重要的植物激素,并且是調節植物生長發育全過程的信號物質,PGPR可以通過自身代謝產生植物激素,來促進植物細胞生長[19];菌株WL520具有較好的產IAA能力,表明該菌株在促植物生長方面具有潛在優勢。同時,菌株WL520具有較好的固氮能力,固氮類芽孢桿菌可通過固定大氣中的氮素、豐富土壤營養及改善土壤結構等來促進植物生長[33]。

干旱脅迫會降低植物對水分的吸收利用,加速植物體內活性氧的積累,從而抑制種子萌發,影響植物生長發育。韓德梁等[34]發現干旱脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量下降,SOD和POD兩種氧化酶活性會隨干旱脅迫的強弱以及時間發生不同變化。吳淼等[35-36]出通過提高植物氧化物酶活性、促進激素和滲透調節物質的產生來應對過氧化損傷,調節細胞質的滲透勢來提高植物的吸水能力。施燕華等[37]發現在不同程度干旱脅迫下添加巨大芽孢桿菌,降低了幼苗葉片和根系中相對電導率和MDA含量,保護了紫花苜蓿幼苗細胞質膜結構和功能。本研究中菌株WL520具有一定的耐旱性,在干旱脅迫下,該菌株能夠提高紫花苜蓿的株高、根長、鮮重及葉綠素含量,增加產量,增強植物的光合能力。植物遭受逆境脅迫時產生大量超氧自由基,使膜脂質發生過氧化反應,產生丙二醛,而SOD能夠通過清除植物體內的氧自由基降低丙二醛含量,從而增強植物的抗逆性。本研究發現菌株WL520灌根紫花苜蓿幼苗后能夠有效降低紫花苜蓿MDA含量,提高SOD含量,表明菌株WL520可緩解紫花苜蓿在干旱脅迫下所帶來的傷害,增強對逆境的適應能力,從而提高植物的產量和品質。

4 結論

本研究通過對菌株WL520進行分子鑒定,測定菌株拮抗、抑菌、耐逆等活性,并測定干旱脅迫下菌株對紫花苜?！履?號’生長效應的影響,發現菌株WL520具有優良抗性及生物活性,在干旱脅迫下對紫花苜蓿的株高、根長、鮮重產生顯著影響,同時,葉綠素、SOD、MDA含量發生顯著變化,表明菌株對紫花苜蓿具有顯著促生效應。因此,本研究為通過施用根際促生菌提高紫花苜?？购的芰μ峁﹥炠|菌株及一定的依據。