流體剪切下軟骨祖細胞的轉錄組響應分析

須凌峰 張月姣 張建昌 余佳 霍婉秋 徐佳麗 王美青

顳下頜關節骨關節炎與異常咬合刺激關系密切[1-2]，本課題組前期研究表明，流體剪切力(flow fluid shear stress，FFSS)可通過多種信號途徑，如mTOR途徑[3]，CaSR途徑[4]，引起軟骨細胞凋亡、終末分化等異常反應。顳下頜關節軟骨細胞根據分化程度可分為增殖細胞、前肥大細胞和肥大細胞等不同類型[5]，其中增殖細胞層中含有軟骨祖細胞(chondroprogenitor cells，CPCs)。軟骨祖細胞在關節軟骨更新修復和穩態維持中扮演著重要的角色[6-7]。在課題組構建的單側前牙反動物模型中，位于軟骨深層的肥大細胞會首先凋亡，而位于軟骨淺層(增殖層)的細胞則表現出較強的抵抗機械力刺激的能力[8]。為探索軟骨祖細胞響應異常力刺激的規律，本研究通過第二代高通量RNA測序和生物信息學分析技術，從分子水平分析了軟骨祖細胞在受到FFSS刺激后的變化，以期深入理解軟骨祖細胞對異常力刺激的反應特點。

1 材料與方法

1.1 軟骨祖細胞的分離與培養

取3 周齡雌性SD大鼠,使用手術刀分離髁突淺層軟骨,組織塊在無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)中漂洗后,在DMEM培養基中將其切碎成1 mm×1 mm組織塊。收集組織,離心,棄上清。胰蛋白酶37 ℃消化20 min,然后使用Ⅰ型膠原酶(2 mg/mL)及Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL)消化1 h。完全培養基終止消化,離心,棄上清,加入完全培養基重懸細胞。細胞培養于37 ℃,含5% CO2的細胞培養箱。培養至第3 代時用于后續實驗。

1.2 流式細胞術

將第一代軟骨祖細胞消化后制成單細胞懸液,調整細胞密度為1×107/mL。取100 μL上述細胞懸液,對照組不加抗體,實驗組加入FITC anti-rat CD90 Antibody(Biolegend, 美國), 4 ℃孵育30 min。孵育完成后PBS反復洗滌細胞3 次,進行上機檢測。

1.3 流體剪切力加載

體外培養至第2 代的細胞經消化收集后,接種于Flexcell StreamerTM(Flexcellint, 美國)Slips 玻片,約3 d長至80%融合時,對細胞加載1.2 Pa的流體剪切力(flow fluid shear stress, FFSS)刺激2 h。

1.4 轉錄組測序

使用TRIzol試劑(Ambion, 美國)進行總RNA提取檢測RNA完整性和總量。合格的樣品經過構建文庫與質檢后使用Illumina NovaSeq 6000(Illumina, 美國)測序。測序部分由北京諾禾致源科技股份有限公司提供技術支持。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 主成分分析及相關性分析 通過諾禾云平臺(https://magic.novogene.com)進行,用以評估樣品間基因表達模式相似程度與組間可區分度。差異表達分析使用DESeq2軟件(1.20.0)進行。本文設定padj<0.05 &|log2(foldchange)|>1為顯著差異表達的閾值。

1.5.2 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通過clusterProfiler(3.8.1)對差異表達基因進行KEGG通路富集分析及GO富集分析,分析結果分別以氣泡圖和柱狀圖進行展示。

1.5.3 差異基因蛋白網絡互作分析 選擇差異表達基因中|foldchange| Top 500的差異表達基因,通過預測蛋白質-蛋白質相互作用的STRING數據庫(http://string.embl.de/)提取相互作用關系。隨后將相互作用數據導入Cytospcape3.8.2軟件,使用CytoNCA軟件計算各節點介數中心度(betweenness, BC)。選擇BC Top 200的節點構建相互作用網絡和核心節點篩選,并通過Cytoscape3.8.2繪制PPI網絡圖。

1.6 定量反轉錄聚合酶連鎖反應

使用TRIzol裂解細胞,按照說明提取總RNA。使用MightyScript 第一鏈 cDNA 合成Master Mix(上海生工)反轉錄為cDNA。使用SYBR Green染料法Mix(上海生工)進行定量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統計與分析

數據使用GraphPad Prism9.0.0(GraphPad公司,美國)進行統計分析與繪制統計圖。使用StudentT檢驗進行2 組間差異比較,P<0.05則認為存在統計學差異。

2 結 果

2.1 實驗樣本可靠性分析與差異表達

CD90是一種典型的干細胞表面標志物。流式細胞術結果顯示,提取的大鼠髁突原代軟骨細胞CD90陽性細胞率達到98.51%(圖1)。經過Illumina測序后,對結果進行主成分分析,結果顯示:對照組三個樣本聚集緊密,而FFSS刺激組樣本稍微分散,但仍能夠很好地區分對照組和FFSS刺激組(圖2A)。樣本間Pearson 相關分析結果顯示,對照組組內差異較小,而FFSS刺激組組內差異略大(圖2B)。即:FFSS刺激后軟骨祖細胞的基因型發生了明顯變化,并能夠很好地與對照組區分。

圖1 軟骨祖細胞CD90陽性細胞率

圖2 主成分分析(A)與樣本間相關性分析(B)

2.2 差異表達基因篩選

在FFSS刺激后的樣本中共篩選出了1 996 個與對照組相比有顯著差異表達的基因,其中1 348 個基因表達上調, 648 個基因表達下調(圖3)。表2展示了上調和下調差異表達基因中排名前10的基因,顯著上調的基因包括了溶質載體蛋白家族成員Slc6a12、 Slc25a48,補體家族成員C3,特異性受體酪氨酸激酶家族成員Adgrv1、脂聯素家族成員Lcn2等。

圖3 差異表達基因火山圖

表2 Top10差異表達基因

2.3 GO和KEGG富集分析

為更加深入地研究軟骨祖細胞在受到FFSS刺激后的反應機制,我們進行了上調和下調差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并從中挑選了排名前20的信號通路進行可視化分析。

對上調差異表達基因的KEGG通路富集分析結果表明,軟骨祖細胞對FFSS刺激的生物學反應主要集中在與炎性反應、免疫調節等生物學過程密切相關的信號通路,如TNF信號通路、IL-17信號通路、TOLL樣受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路和破骨細胞分化等相關信號通路;對下調差異表達基因的KEGG通路富集分析結果表明,軟骨祖細胞主要受到細胞周期、p53信號通路、細胞外基質受體交互、Foxo信號通路、局部黏附、PI3K-Akt信號通路、細胞衰老以及Wnt信號通路等的影響。

對于上調差異表達基因進行GO功能富集分析后發現,受FFSS異常力刺激后,軟骨祖細胞參與的生物學過程主要與細菌來源分子反應、脂多糖反應、血管生成、炎癥反應及細胞分裂等相關,在細胞組分方面主要涉及細胞外基質、膠原三聚體、細胞膜等;在分子功能方面主要涉及軟骨祖細胞對抗氧化活性、生長因子活性、受配體活性、細胞因子活性等。對于下調差異表達基因進行GO功能富集分析發現,軟骨祖細胞的生物過程及細胞組分主要集中在多個與細胞分裂相關的活動中;在分子功能方面,軟骨祖細胞主要涉及細胞骨架結合與活性改變等內容(圖4);GO富集分析結果則顯示,在生物學過程和細胞組分這兩方面主要富集在與細胞分裂相關的活動中。

2.4 炎癥及細胞周期相關基因表達

本研究在進行富集分析時發現:炎癥反應和細胞周期改變是軟骨祖細胞在異常力刺激下發生的重要生物學變化之一。為此,利用熱圖分別展示炎癥反應相關基因和細胞周期相關基因的表達變化情況,結果表明:炎癥相關基因(如Il-1α、Il1r1、Hif1-α、 Nfkb1、Ccl7等)的表達顯著上調(圖5A),細胞增殖相關標志物(如Mki67、 Ccnd1、 Ccnd1、 Pcna等)的表達顯著降低,而周期素依賴性激酶抑制因子1A(Cdkn1a)的表達水平顯著增高(圖5B)。

2.5 PPI網絡的構建

通過PPI網絡分析,發現了幾個核心基因,包括參與細胞增殖、凋亡等生物學過程的白細胞介素-6(Il6)、激活轉錄因子3(Atf3)、蛋白微管相關蛋白2(Stmn2)、趨化因子配體2(Ccl2)、視黃酸受體(Ret)、蛋白激酶Cγ(Prkcg)、核因子kappa B抑制因子α(Nfkbia)[9-14];涉及細胞移動與黏附相關生物學過程的血管細胞黏附分子1(Vcam1)和肌球蛋白(Acta1)[15-16],以及在調控氧化應激方面發揮重要作用的超氧化物岐化酶2(Sod2)[17](圖6)。

圖6 差異表達基因的蛋白網絡構建及核心基因篩選

2.6 核心基因的驗證

為了驗證PPI網絡挖掘的核心基因,通過qRT-PCR驗證核心基因的表達量。結果顯示Acta1、 Atf3、 Ccl2、 Il6、 Nfkbia、 Ret、 Vcam1的表達變化與測序結果一致(圖7),而Sod2、 Stmn2表達無明顯變化,Prkcg表達變化與測序結果相反(圖7)。

圖7 核心基因驗證

3 討 論

關節軟骨是重要的負重組織,關節軟骨細胞對負荷變化可做出相關的生物學響應。本文采用轉錄組學分析方法,探討了下頜髁突軟骨祖細胞響應FFSS刺激的生物學活動特點,結果表明:軟骨祖細胞對FFSS的響應主要集中于炎性反應和細胞周期這兩大生物學過程,信號通路涉及與細胞增殖、凋亡、分化、細胞移動、細胞代謝等生物學過程,Acta1、Atf3、Ccl2、Il2、Nfkbia、Ret、Vcam1在這些生物學過程中可能發揮重要作用。

位于淺層的軟骨祖細胞具有增殖和向成熟軟骨細胞分化的能力[18]。異常生物力在骨關節炎發生、發展過程中發揮著重要作用,并誘發明顯的炎癥反應[19]。白細胞介素-17(IL-17)是一種細胞因子,在骨關節炎病理過程可促進IL-1β、TNF、IL-6等炎性因子及基質金屬蛋白酶和一氧化氮(NO)的生成[20],并促進骨關節炎惡化[21];PI3K/AKT/mTOR的激活能夠促進軟骨細胞增殖能力的恢復,對維持關節軟骨組織穩態起重要作用,但該通路也參與骨關節炎的發生與發展[22],軟骨細胞中IL-17 介導的 PI3K/AKT/mTOR 通路的激活,可促進軟骨退變[23]。JAK-STAT被認為是細胞功能的中心節點之一,參與免疫適應、組織修復、炎癥、凋亡、等多種生物學過程[24]。有報道指出:軟骨細胞受到白細胞介素-1(IL-1)刺激時其增殖能力將下降,而抑制JAK2/STAT3信號通路則能部分恢復受損軟骨細胞的增殖能力[25];而最近一項研究表明,JAK/STAT信號通路的激活能夠促進軟骨祖細胞衰老[26];腫瘤壞死因子-α/核因子-κB(TNF-α/NF-κB)信號通路是炎癥反應中最重要的信號通路之一,抑制TNF-α/NF-κB信號通路的激活,可以抑制顳下頜關節軟骨祖細胞的炎癥反應并維持軟骨生成能力[27]。本研究結果中PPI網絡分析顯示, Il6、Nfkbia等炎性和抗炎相關基因是互作網絡中的核心分子。先前的研究表明流體剪切力能夠刺激軟骨細胞產生前列腺素E2(PGE2),誘導Il6的合成[20]。Atf3是骨關節炎發展的關鍵介質。炎性細胞因子通過NF-κB途徑上調Atf3的表達,而Atf3缺乏會減弱IkB和p65的磷酸化狀態,抑制NF-κB信號, 從而抑制軟骨細胞中細胞因子誘導的Il6轉錄[28]。 Vcam1是一種重要的炎性反應介質, Vcam1表達增加與炎癥及組織損傷有關[29]。而Nfkbia能夠抑制與炎性反應相關的NF-κB/REL復合物。在FFSS刺激后,軟骨祖細胞Nfkbia表達水平升高, 可能是細胞對于炎性過程的一種保護性反應。這些結果提示炎癥反應是軟骨祖細胞對異常力刺激的主要響應。

骨關節炎軟骨中,軟骨細胞通過改變代謝來適應骨關節炎中的炎性環境[30]。溶質載體(solute carrier, SLC)是一類負責物質在胞內胞外之間運輸的跨膜蛋白,在細胞代謝過程中發揮著重要的作用[31]。本研究發現軟骨祖細胞在受到FFSS刺激后,Slc6a12、Slc25a48的表達水平顯著升高。盡管尚且沒有溶質載體蛋白與骨關節炎發病相關的報導,但是這些結果提示溶質載體可能與骨關節炎病理過程中軟骨細胞代謝改變相關。

總之, 本研究通過采用第二代高通量轉錄組測序技術,首次證明軟骨祖細胞對于FFSS刺激的主要響應表現為炎癥反應,并揭示了參與這一過程的幾個重要炎性反應相關信號通路,如NF-κB、IL-17、MAPK、JAK-STAT、PI3K/Akt等,從而為進一步研究軟骨祖細胞在力刺激作用下的功能活動特點及其可能的治療靶向,提供了轉錄組學研究基礎。