一種注射式軟骨移植體的構建及應用探究

馬超群 李海強 吳煒

頜面部由于腫瘤,外傷及先天性發育不良導致的軟骨缺損畸形嚴重影響了患者的美觀和心理健康,在臨床上需要通過外科手術的方式借助軟骨移植體進行修復和整形。常用的移植材料包括人工合成材料和自體軟骨,然而人工材料易引起多種并發癥[1-2]。因此自體軟骨仍然是臨床修復移植的金標準[3-4]。目前常用的自體軟骨包含鼻中隔軟骨,耳軟骨以及肋軟骨[5]。鼻中隔軟骨是最常用于鼻背側重建的移植體,不需要額外的手術切口,同時提供了良好的剛性支持[6]。鼻中隔軟骨優勢顯著,但可取量不足限制了應用[7]。耳軟骨作為另一種選擇,自然彎曲形態及組織學結構導致其難以雕刻,且質地偏脆,遠期移植的畸形和翹曲發生率較高[8-9]。肋軟骨的優勢在于其豐富的可用性。對于需要大量移植材料的病例,肋軟骨是首選的移植供體[10-11]。肋軟骨相對容易雕刻成形,吸收率低,但是易發生不可預測的翹曲[12]。

為解決以上問題,臨床上通常將軟骨切割為直徑1～3 mm左右的碎塊,避免了塊狀移植帶來的翹曲和變形,有利于精確充填不規則的缺損畸形[13]。碎片化的軟骨結構單元有利于周圍纖維組織和血管的長入,便于移植體的營養交換和長期存活[14]。但碎塊大小往往依賴于術者的經驗,缺乏準確的評估。不均勻的碎片移植會導致外觀的不平整和顆粒感明顯而影響美觀效果。本研究探索了一種冷凍研磨的快速軟骨顆?；幚矸绞?能夠短時間內將軟骨塊處理為均勻的顆?；浦矄卧?結合富血小板凝膠(platelet-rich gel, PRG)共移植評價顆?；浌且浦驳男Ч麃頌樵摲绞降倪M一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物實驗獲得空軍軍醫大學實驗動物中心倫理委員會批準(批準號: IACUC-20231257),于空軍軍醫大學實驗動物中心完成。 6 只2～2.5 kg成年新西蘭白兔,用于獲得新鮮的肋軟骨; 3 月齡健康新西蘭白兔5 只,雌雄不限,體重 2 kg,由耳中央動脈提取PRG; 6～8 周雄性免疫缺陷鼠 15 只(湖南維通利華實驗動物技術有限公司),用于顆粒軟骨和顆粒軟骨-PRG移植體埋植及鼻背增高模型構建。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素鏈霉素、 II型膠原酶(Gibco,美國); 掃描電鏡(S 4800, Hitachi公司,日本); 激光粒度分析儀(Mastersizer 3000, Malvern公司,英國)。

1.3 顆粒軟骨及PRG的制備

過量麻醉處死新西蘭兔,取出肋軟骨,用含1%青霉素-鏈霉素的PBS反復清洗5 遍。剝除肌肉筋膜及表面纖維,用無菌手術刀將軟骨切割成直徑3～5 mm的碎塊。碎塊置入研缽后依次進行液氮低溫冷凍和研磨獲得顆粒軟骨。將制備好的顆粒軟骨保存在冰上備用。取200 mg置于蒸餾水中用于粒徑分析。用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管從兔耳中動脈采集15 mL血液轉移至無菌離心管, 1 800 r/min離心8 min,將上層血漿轉移至新的無菌離心管, 3 600 r/min離心8 min。棄去上層1/2的血漿,重懸底部黃白色沉淀,即得PRP。 PRP 加入微量凝血酶可成膠為PRG。

1.4 體外培養顆粒軟骨活性評估

將研磨的軟骨顆粒平均分成6 份,每份約200 mg,在六孔板中進行培養。每2～3 d更換培養基,分別于第1、 7、 14 天用0.2% Ⅱ型膠原酶消化過夜。用含血清的培養基終止消化,通過70 μm細胞濾網過濾后,收集細胞懸液1 000 r/min離心5 min。用300 μL PBS重懸細胞,與PI避光孵育15 min,流式細胞儀分析活死細胞的比例。

1.5 可注射移植體的制備及表征

對照組(n=5)為500 mg的顆粒軟骨,裝入2.5 mL的注射器中以備裸鼠注射;實驗組(n=5)分別按照60%、 80%以及100%質量體積分數混合PRP與顆粒軟骨,加入微量凝血酶成膠后測定強度以篩選最佳比例,以最佳比例的移植體裝入2.5 mL的注射器以備注射。實驗組移植體用4%多聚甲醛固定48 h,梯度脫水后噴金,掃描電鏡觀察。

1.6 裸鼠注射移植

麻醉裸鼠,碘伏棉球擦拭皮膚,裝有移植體的2.5 mL注射器更換16G無菌針頭,刺入皮下后水平行進至距離進針點2 cm時將移植體擠出。逆著進針方向緩慢抽出針頭,消毒進針口。在8 周解剖分離標本,直接稱量記錄濕重,以排水法重復測量體積記錄并對大體輪廓拍照后4%多聚甲醛固定,梯度脫水,二甲苯透明(2 次),石蠟包埋進行組織切片,分別行HE和番紅染色。

1.7 裸鼠鼻背增高功能模型構建

根據前期結果,選用實驗組構建裸鼠鼻背增高模型(n=5)。麻醉裸鼠,消毒皮膚,將移植體注射入鼻背皮下,抽出針頭,消毒皮膚。記錄注射前后和8 周時的裸鼠鼻背形態。

2 結 果

2.1 顆粒軟骨活性分析及移植體表征

手動切割的軟骨碎塊(圖1A)經過低溫研磨的流程成為白色粉末狀態的顆粒軟骨(圖1B)。研磨所得顆粒主要分布區間在15～126 μm,呈近似正態分布,平均直徑約為76 μm(圖1C)。體外培養實驗中,隨著時間加長顆粒軟骨中細胞的存活率逐漸上升。在第1 天僅為74.5%,第7 天為80.7%, 第14 天達到88.1%(圖1D)。對照組移植體呈現流動態而難以成型(圖1B);實驗組移植體成膠后可以維持形態((圖2B),掃描電鏡結果顯示顆粒軟骨被大量纖維蛋白網絡連接而形成整體,隨著顆粒軟骨含量增高,纖維蛋白的比例逐漸減少(圖2A);壓縮強度測試顯示80%質量體積分數的移植體在同等大小應力下具有較小的應變量(圖2C),其彈性模量最高為210 kPa(圖2D)。80%質量分數移植體具有最佳的力學性能,后續實驗采用該比例。

圖1 顆粒軟骨的制備與活性分析

圖2 可注射移植體的表征

2.2 移植體大體觀察

對照組移植體形態保持較差,移植物容易與周圍組織分離,表面無包膜,僅可見附著少量血管組織(圖3A);實驗組移植體形態保持良好,不易與周圍組織分離,表面被光滑的纖維膜包裹,其下有大量血管爬行(圖3D)。與對照組相比,實驗組移植體保留了更飽滿光滑的輪廓和合適的厚度,質量保留率為81.64%,而對照組質量保留率僅為75.50%(表1)。

表1 移植物的濕重、 體積和質量保留率

圖3 可注射移植體的體內評估

2.3 組織切片觀察

HE染色顯示,兩組移植體軟骨陷窩結構清晰,實驗組可見大量毛細血管,而對照組僅偶見毛細血管。對照實驗組軟骨陷窩周圍陽性著色面積高于對照組,表明細胞活性更強。實驗組顆粒軟骨與纖維組織結合緊密,而對照組軟骨顆粒與纖維組織接觸松散(圖3B～3E)。在safranin O染色中,實驗組的陽性染色面積更大, 顯示顆粒軟骨的活性優于對照組(圖3C～3F)。CD31免疫熒光染色進一步證實,實驗組移植體新生毛細血管數量遠遠高于對照組移植體(圖3G～3I)。

2.4 鼻背增高模型效果觀察

裸鼠鼻背增高模型證實,移植體在注射即刻形成了順應鼻背自然曲度的形態,達到顯著的增高效果(圖4A)。在8 周后,鼻背增高的厚度相較于注射即刻略有減小,但仍然保留了清晰的輪廓和自然的增高曲線(圖4B)。CT結果顯示了移植物與周圍組織的良好融合(圖4D)。大體觀察顯示移植體表面光滑,并有血管組織爬行,保證了移植體內部的營養供應(圖4E)。番紅O染色也顯示移植體重塑為一個形態自然的整體,切片局部證實了顆粒軟骨良好的生存活力(圖4C～4F)。

3 討 論

在頜面部修復中，平滑的輪廓和自然的形態是整復手術的終極目標[15]。有研究利用軟骨細胞聚集體負載PRF的方式促進軟骨再生，但是該方法需要復雜的實驗室培養流程，短期內難以實現臨床轉化[16]。目前而言，臨床上碎塊化軟骨的應用更加普遍[17-18]。但已有報道是通過手動切割的方式實現軟骨的碎化，過程十分耗時，由此得到的顆粒大小也不均一[19]。在遠期的效果中，軟骨顆粒大小的不均一會導致形態的不規則[20]。除此之外，軟骨經過碎化后的移植活力也是影響遠期效果的重要因素。關于碎化軟骨的活力也有相關報道，雖然其中有一些矛盾的結果，但是多數研究表明嚴重程度的擠壓和碎化會降低軟骨細胞的存活率[21-23]。除此之外，已有報道均是在常溫下對于軟骨組織進行擠壓和切割[24-25]。但已有報道均是在常溫下對于軟骨組織進行擠壓和切割。在本研究中，軟骨塊在低溫下進行物理研磨，有效避免了常溫下機械作用力對于細胞活力的損傷，流式細胞術分析也證實顆粒軟骨中的細胞存活率仍然能夠達到80%。

軟骨經過顆?；幚碇髸蔀闊o定形狀態,難以實現精確的形態塑造。許多報道通過筋膜包裹的方式來應對這一問題[26-27],但是筋膜的獲取往往造成二次創傷,而且筋膜隔絕了移植體與受體部位的直接接觸導致其組織融合緩慢。利用筋膜包裹移植體也需要開放式的手術切口,手術瘢痕難以避免,難以滿足頜面部整復手術微創美觀的要求。本研究利用富血小板凝膠中的纖維蛋白網絡將顆粒軟骨連接為一個整體,解決了顆粒軟骨難以定型的問題,同時利用注射的方式可以避免瘢痕的產生。在動物實驗中,顆粒軟骨與PRG構建的移植體展現了良好的形態維持和顯著的鼻背增高效果。同時可以看到PRG的加入也促進了移植體的血管化和組織融合,組織切片染色更證實了其對于顆粒軟骨活性保持的積極作用。

綜上所述,基于低溫研磨技術能夠實現軟骨組織的快速顆?；幚聿⒈ＷC其活性,與富血小板凝膠構建的可注射式移植體能夠實現更加微創的頜面部軟骨移植修復。