運用綿羊頸外靜脈構建面頸部靜脈畸形動物模型

楊霞 沈艷玲 郭軍 劉源 閆志偉 楊向明 吳煒 馮瑤 楊耀武

靜脈畸形(venous malformations, VMs)是由靜脈發育異常引起的一種血管畸形,可以單獨發病,也可以和其他血管畸形聯合出現,范圍可以從局部的淺表病變到涉及多個功能區的彌散樣病變[1-2]。VMs可出現在身體各個部位,好發于面頸部。目前硬化治療是VMs首選的治療方法,常用的硬化劑有平陽霉素、博來霉素、聚桂醇、聚多卡醇、十四烷基硫酸鈉、3%魚肝油酸鈉等。此外,臨床研究發現,無水乙醇硬化治療、纖維蛋白膠復合平陽霉素栓塞硬化治療等技術在大范圍、高回流VMs治療方面顯示了良好的療效。在VMs治療領域硬化劑的種類以及治療方法眾多,但是長期以來缺乏進行療效評價的動物模型,尤其是缺乏能夠用于治療過程觀察、療效對照研究以及新技術、新方法實驗研究的實用性模型,導致對各種治療方法引起靜脈纖維化作用的機理以及療效評價缺乏實驗研究依據。自2013 年以來,我科脈管疾病研究團隊嘗試以綿羊頸外靜脈為基礎,通過手術方法構建了面頸部VMs動物模型,該模型在解剖形態、血流動力學方面雖然與人類VMs仍有一定差異,但是仍有望初步用于硬化治療等的過程觀察以及特定治療技術的療效評價研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇健康成年綿羊5 只,體重25～35 kg,雌雄不限,單側頸外靜脈作為實驗對象。

1.2 實驗方法

1.2.1 綿羊頸外靜脈解剖及觀察 術前24 h禁食水,手術當天使用電動剃毛刀將綿羊頸部被毛剃除,使用鹽酸賽拉嗪注射液(陸眠寧,吉林華牧動物保健品有限公司)進行肌肉注射麻醉,約10 min后,待綿羊意識淡漠、自行倒臥后,將其側臥位固定于手術臺上,碘伏消毒手術區域并鋪無菌洞巾。在隆起的頸外靜脈略下方設計縱行切口,切口區使用2%利多卡因進行局部浸潤麻醉,然后切開皮膚、皮下組織,翻瓣,于胸鎖乳突肌外側充分顯露頸外靜脈,向上解剖到下頜角平面,顯露匯入頸外靜脈主干的上頜靜脈、舌面靜脈,向下解剖至約6 cm處,觀察頸外靜脈走行、分支并測量其外徑。

1.2.2 VMs動物模型制備 模型構建標準:依據人類有回流靜脈VMs的解剖學和血流動力學特征,按照盡量接近和相似原則,預期目標為VMs動物模型有較粗的靜脈管腔、較細的回流靜脈以及較細的匯入靜脈。匯入靜脈有多支,除遠心端縮窄外,保留部分沿途匯入的靜脈細支,回流靜脈由頸外靜脈主干縮窄而成。

模型靜脈長度設計為3 cm。首先通過主干縫線縮窄、匯入分支靜脈縮窄或結扎等方法處理頸外靜脈上端(遠心端),使匯入靜脈孔徑縮窄至2～3 mm,模型下端(近心端)縮窄至1～3 mm,制備完成后創面止血,分層縫合,碘伏紗布覆蓋傷口。術后等待綿羊自然蘇醒,并肌注青霉素(2 次/d,共3 d)抗感染。

1.2.3 綿羊VMs動物模型評價 手術后4 周觀察及取材。綿羊頸部術區剃毛,麻醉方式同前。首先通過多普勒超聲觀察VMs模型及匯入靜脈和回流靜脈的形態、孔徑、血流動力學等情況。隨后沿頸外靜脈略下方縱行切開、翻瓣,顯露頸外靜脈,大體觀察后取材,4%多聚甲醛液固定標本,并行脫水包埋處理,制作蠟塊并切片, HE及Masson三色法染色,光學顯微鏡(奧林巴斯)下觀察標本靜脈壁結構及管腔情況,對動物模型進行綜合評價。在實驗過程中如果出現縫扎線移位脫落、術區感染、模型形態不符合要求等現象,剔除該標本并補充新的實驗動物。

2 結 果

2.1 綿羊頸外靜脈觀察

綿羊頸外靜脈位于雙側頸部側面皮下,臂頭肌和胸頭肌之間的頸靜脈溝內,主干由上頜靜脈、舌面靜脈匯合而成(圖1)。成年綿羊頸外靜脈外徑6～12 mm,平均外徑9.3 mm,從遠心端向近心端走形過程中有細的分支匯入,外徑1～3 mm。觀察發現,雄性綿羊頸外靜脈的外徑總體上大于雌性綿羊,體重大、羊齡長的綿羊頸外靜脈外徑總體上大于體重輕、羊齡短的綿羊。

圖1 綿羊頸外靜脈上段及主干手術改建前后形態

2.2 綿羊VMs動物模型觀察及評價

綿羊頸外靜脈經過主干縫線縮窄、分支靜脈縮窄或結扎等處理后血液回流減慢,即刻出現模型區域靜脈鼓起變粗(圖1)。模型制備手術4 周后大體觀察,見多數標本靜脈孔徑、體積與制備后即刻相比收縮變細,部分標本中心區隆起呈擴張形態,部分模型外周側支靜脈有擴張現象。多普勒超聲檢查顯示制備成功的模型中心區域多數靜脈管腔較粗,回流靜脈、匯入靜脈較細。部分模型有多支粗細不等的匯入靜脈,部分模型靜脈腔內有血栓樣物形成,管腔變小。組織學檢查顯示模型區域靜脈血管內皮及管壁結構與正常靜脈接近,部分模型血管壁增厚。圖2顯示1 例VMs動物模型制備、大體觀察、多普勒超聲檢查及組織學觀察所見。

圖2 綿羊頸外靜脈VMs模型

3 討 論

在VMs研究領域,學者們一直在探索并構建VMs動物模型。 Castillo等[3]用突變的PIK3CAH1047R在雜合子狀態下和內源性啟動子中以鑲嵌方式誘導表達引起小鼠VMs,這些小鼠在出生時不同的部位均有皮下血管畸形。 Castel等[4]在轉基因小鼠中使用Cre-loxP技術以組織特異性的方式表達激活的PIK3CAH1047R突變等位基因來產生VMs基因工程小鼠模型。小鼠中出現的病變經組織學檢查類似于人類血管畸形,這些異常表現為擴張的海綿狀血管腔。 Boscolo等[5]將表達TIE2-L914F的人臍靜脈內皮細胞注射進免疫缺陷小鼠體內形成了VMs病變,并隨著時間的推移不斷擴大,該方法建立的模型表現出血管擴張,細胞層變薄且不連續等特征與人類VMs十分相似。國內學者在建立轉基因裸鼠VMs動物模型方面取得了一定的進展[6]。盡管這些VMs動物模型在研究發病機制、潛在治療藥物方面能夠發揮一定作用,但是因為構建的病變體積偏小,難以進行硬化治療相關研究。高慶紅等[7]和Zhao等[8]將家兔耳緣靜脈用于平陽霉素、魚肝油酸鈉等硬化治療機理研究,揭示了硬化劑對兔耳緣靜脈的損傷及致纖維化作用。盡管如此,兔耳緣靜脈因為孔徑較細,其應用仍有一定的局限性。

在腦血管畸形、全身靜脈曲張研究領域,很多學者應用外科手術或水囊縮窄等方法建立了動靜脈畸形及靜脈曲張動物模型。趙曉勇等[9]用外科手術方法成功建立了穩定高流量腦動靜脈畸形動物模型,該模型簡單、穩定、可重復性強。李健等[10]用血管吻合的方法建立了可操作性強,經濟便捷又安全的動靜脈畸形動物模型。方和平等[11]用水囊縮窄法建立了食管/胃底靜脈曲張動物模型,以上研究為VMs動物模型構建提供了另一種思路。鄭家偉等[12]的一項研究顯示,成年山羊頸外靜脈的平均外徑可達5.4 mm,是頭頸部血液回流的主干靜脈。頸內靜脈位于頸部血管神經束內側,細小或缺如。成年綿羊體格更為高大,頸外靜脈孔徑更大。本課題組以綿羊頸外靜脈為基礎,通過手術結扎和縮窄等方法,初步建立了面頸部 VMs 動物模型。

研究顯示,綿羊頸外靜脈位置表淺,外徑可達到6～12 mm,平均外徑9.3 mm,因體重、羊齡、性別不同有較大差異。靜脈內含瓣膜,管壁內膜較薄,外膜較厚,頸外靜脈從遠心端向近心端走形過程中粗細不等的分支靜脈匯入。應用縫線縮窄、分支靜脈結扎等方法改建后,初步形成了單囊腔VMs解剖形態,具有較粗的靜脈管腔、較細的回流靜脈以及多支較細的匯入靜脈。多普勒超聲及組織學觀察其血流動力學特點、管壁結構類似于VMs病變。

在模型制備、觀察過程中發現,綿羊頸外靜脈被縮窄改建后,因即刻回流受阻,模型區域靜脈有時會顯著擴張,一定時間后可能形成腔內血栓,與人類VMs血管腔內的血栓相似。另一個現象是在手術后4 周,多數模型區域靜脈孔徑收縮變細、管壁增厚,這可能是因為靜脈壓力、血流動力學改變所致,也可能與手術微小創傷、血管外周纖維組織粘連有關。此外,模型制備也遇到一些問題。因為綿羊頸外靜脈作為頭頸部的主要回流靜脈,其血液流速快、管腔壓力大,部分制備的模型在手術4 周后出現縫扎線移位、脫落現象,頸外靜脈恢復原來形態。在血流的長期沖擊下,縫扎線移位現象導致在回流靜脈孔徑和血液流速精確控制方面存在一定的難點,相同構建方法制備出的動物模型在靜脈體積、血液流速方面有一定差異。因此模型制備有一定的失敗率,如果構建的動物模型不符合要求,需要重新制備。此外,通過綿羊頸外靜脈構建VMs的目的是將其應用于治療學研究,因靜脈改建后即刻存在靜脈損傷、組織水腫、潛在術后感染等問題,VMs模型處于不穩定狀態,不適合用于治療學研究,因此將其觀察期定于改建后4 周。從觀察結果看,制備成功的模型4 周后組織水腫消退,靜脈及周圍組織基本恢復正常。

該研究初步建立了有回流的面頸部VMs動物模型,其解剖學及血流動力學特征與轉基因VMs動物模型小動物靜脈血管相比,更有利于進行高回流VMs相關治療學研究。因研究的主要目的不是從基因學角度構建VMs模型,因此未進行相關的分子生物學檢測和免疫組織化學等檢測。盡管靜脈改建后其解剖形態及病理學特征與人類VMs仍有較大差異,但是在沒有更理想選擇的前提下,模型為該領域相關治療學、影像學及治療機理研究提供了一個有價值的手段。在后續研究中,課題組將進一步改進、優化模型構建及檢測方法,使模型構建趨于科學化、標準化。