CircBICD2調節miR-218-5p/RhoA軸對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡和上皮間質轉化的影響

謝耕耘 安曉燕 王佳

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的口腔癌類型,局部淋巴結轉移的高發生率以及遠處器官的侵襲是OSCC相關死亡的主要原因[1-2]。目前對于OSCC的診斷和治療水平有了很大的提升,但相關數據統計表明OSCC晚期患者的5年生存率依然居高不下[3]。因此,深入研究調節OSCC細胞生物學行為的分子生物標志物,可能為OSCC的早期診斷和治療提供新的機會。環狀RNA(Circular RNA, CircRNA)是一種特殊類型的具有環狀結構的非編碼RNA,越來越多的證據表明CircRNA在OSCC進展中發揮著關鍵作用[4]。已有研究報道,環狀RNABICD2(CircBICD2)在OSCC組織和細胞中高表達, 干擾CircBICD2可抑制OSCC細胞增殖、遷移侵襲, 促進細胞凋亡[5]。但CircBICD2調控OSCC細胞惡性生物學行為的具體分子機制尚不完全明確。已有文獻闡明CircRNA-miRNA-mRNA 信號軸參與OSCC的發生和進展[6]。本研究通過生物信息學分析發現CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與Ras同源基因家族成員A(Ras Homolog Gene Family Member A,RhoA)存在結合位點。相關研究顯示,沉默miR-218-5p可促進OSCC細胞增殖[7];過表達RhoA可促進OSCC細胞遷移與侵襲[8]。而CircBICD2能否通過調控miR-218-5p/RhoA軸影響OSCC細胞惡性生物學行為尚不清楚。本研究主要探究CircBICD2對OSCC細胞生物學行為的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集及細胞來源

25 對OSCC組織及癌旁組織(距離癌組織3 cm處)來自于2018 年9 月～2021 年9 月期間在本院首次確診為OSCC的患者。所有患者均提供知情同意書,且本研究獲得本院倫理委員會的批準(批準號: R-202209)。

人口腔上皮細胞系HOEC及OSCC細胞系HSC-4、CAL-27、SCC-15(浙江美森細胞科技有限公司)。

1.2 主要試劑

Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(XYS0185,上海信裕生物公司);CCK-8試劑盒(MH1003,江蘇麥格生物公司);兔源一抗波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、RhoA、神經鈣粘蛋白(N-cadherin)、GAPDH及羊抗兔IgG二抗(貨號:ab8978、ab76055、ab187027、ab245117、ab9484、ab6721)(Abcam公司,英國)。

1.3 細胞培養與分組

在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養HOEC、HSC-4、CAL-27、SCC-15細胞。將SCC-15細胞分為si-NC組(B:轉染si-NC)、si-CircBICD2組(C:轉染si-CircBICD2)、miR-NC組(D:轉染mimic NC)、miR-218-5p組(E:轉染miR-218-5p mimic)、si-CircBICD2+anti-NC組(F:同時轉染si-CircBICD2和anti-NC)、si-CircBICD2+anti-miR-218-5p 組(G:同時轉染si-CircBICD2和anti-miR-218-5p),另將未經任何處理的SCC-15細胞命名為Ct組(A)。各組細胞轉染48 h。

1.4 qRT-PCR檢測CircBICD2和miR-218-5p表達

向組織勻漿和細胞中加入TRIzol,用于分離并提取總RNA,將2 μg RNA逆轉錄為cDNA后開始進行定量反應。CircBICD2、miR-218-5p的相對表達量是分別以GAPDH、U6為內參,通過2-ΔΔct法計算的。引物序列:GAPDH:正向5′-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3′,反向5′-GGTGGAATCATATTGGAACA-3′;CircBICD2:正向5′-TTGGCTCTCCTGCTGTGC-3′,反向5′-GGTCATCCACAATCAGCCCA-3′;U6:正向5′-CG-CTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-218-5p:正向5′-AACACGAACTAGATTGGTACA-3′,反向5′-AGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖

將各組SCC-15細胞(1×104個/孔)加入到96 孔板中孵育48 h,再向各孔加入10 μL CCK-8試劑在37 ℃下孵育2 h。通過酶標儀檢測A值(450 nm處)。

1.6 細胞克隆形成的檢測

將SCC-15細胞(280 個)放入細胞培養板中培養15 d后,除去培養液,將細胞經甲醇固定、結晶紫染色后,開始觀察細胞克隆形成。

1.7 細胞凋亡的檢測

將各組SCC-15細胞用預冷的PBS洗滌2次。然后將細胞以1×106個/mL的濃度重新懸浮在1×結合緩沖液中。取100 μL細胞懸液轉移到5 mL培養管中。將5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶添加到樣品中,然后在室溫下避光孵15 min。將400 mL 1×結合緩沖液添加到每個管中,并立即通過流式細胞術分析樣品。FlowJo軟件用于數據分析。

1.8 RhoA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的檢測

組織勻漿以及細胞樣品在RIPA緩沖液中裂解以獲得總蛋白。取出40 μg蛋白質進行SDS/PAGE,然后轉移到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉后,在4 ℃下將膜與一抗RhoA(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶4 000)、GAPDH(1∶3 000)孵育過夜,再在25 ℃下與二抗(1∶3 000) 一起孵育2 h。通過ImageJ軟件評估蛋白灰度值。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗

構造BICD2野生型質粒(BICD2-WT)、突變型質粒(BICD2-MUT)、RhoA野生型質粒(RhoA-WT)和突變型質粒(RhoA-MUT),將BICD2-WT、BICD2-MUT、RhoA-WT、RhoA-MUT分別與miR-218-5p mimic或mimic NC共轉染于SCC-15細胞,48 h后,統計熒光素酶活性的變化。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 在組織和細胞中CircBICD2、 miR-218-5p表達及RhoA蛋白表達情況

與癌旁組織相比,OSCC組織中CircBICD2表達及RhoA蛋白表達量升高,miR-218-5p相對表達量降低(P<0.05)(圖1A, 表1);與HOEC細胞比較,HSC-4、CAL-27、 SCC-15細胞中CircBICD2、 RhoA蛋白表達升高,miR-218-5p表達降低,且SCC-15細胞中CircBICD2、RhoA蛋白表達量最高,miR-218-5p表達量最低, 因此, 選取SCC-15細胞進行轉染實驗(圖1B, 表2)。

表1 在組織中CircBICD2、miR-218-5p表達及RhoA蛋白表達比較

表2 在細胞中CircBICD2、 miR-218-5p表達及RhoA蛋白表達比較

圖1 組織中RhoA蛋白的表達(Western blot)

2.2 CircBICD2、miR-218-5p、RhoA蛋白在SCC-15細胞中的表達

與Ct組、si-NC組比較,si-CircBICD2組CircBICD2、RhoA蛋白表達降低,miR-218-5p表達升高(P<0.05);與Ct組、miR-NC組相比,miR-218-5p組CircBICD2表達變化差異無統計學意義(P>0.05),RhoA蛋白表達下調,miR-218-5p表達上調(P<0.05);與si-CircBICD2組、si-CircBICD2+anti-NC組相比,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組CircBICD2表達量變化差異無統計學意義(P>0.05),miR-218-5p表達降低,RhoA蛋白表達升高(P<0.05)(圖2, 表3)。

表3 各組SCC-15細胞中CircBICD2、miR-218-5p表達及RhoA蛋白表達比較

圖2 各組SCC-15細胞中RhoA蛋白的表達(Western blot)

2.3 沉默CircBICD2或過表達miR-218-5p抑制SCC-15細胞增殖

與Ct組、si-NC組相比,si-CircBICD2組A450值及克隆形成率顯著降低(P<0.05);與Ct組、miR-NC組相比,miR-218-5p組A450值、克隆形成率顯著降低(P<0.05);與si-CircBICD2組和si-CircBICD2+anti-NC組相比,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組SCC-15細胞A450值、克隆形成率升高(P<0.05)(圖3, 表4)。

表4 各組SCC-15細胞A450值、克隆形成率、凋亡率比較

圖3 沉默CircBICD2或過表達miR-218-5p對SCC-15細胞克隆形成的影響

2.4 下調CircBICD2或上調miR-218-5p促進SCC-15細胞凋亡

與Ct組、si-NC組對比,si-CircBICD2組SCC-15細胞凋亡率上升(P<0.05);與Ct組、miR-NC組比較,miR-218-5p組SCC-15細胞凋亡率升高(P<0.05);與si-CircBICD2組、si-CircBICD2+anti-NC組比較,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組SCC-15細胞凋亡率降低(P<0.05)(圖4, 表4)。

圖4 各組SCC-15細胞凋亡(流式細胞術)

2.5 沉默CircBICD2或過表達miR-218-5p對SCC-15細胞EMT的影響

與Ct組、si-NC組對比,si-CircBICD2組E-cadherin蛋白上調表達,N-cadherin、Vimentin蛋白下調表達(P<0.05);與Ct組、miR-NC組比較,miR-218-5p組E-cadherin蛋白上調表達,N-cadherin、Vimentin蛋白下調表達(P<0.05);與si-CircBICD2組、si-CircBICD2+anti-NC組相比,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組E-cadherin蛋白下調表達,N-cadherin、Vimentin蛋白上調表達(P<0.05)(圖5、 表5)。

表5 各組SCC-15細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達比較

圖5 各組SCC-15細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(Western blot)

2.6 CircBICD2靶向調控miR-218-5p/RhoA軸

starbase預測CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與RhoA的結合位點(圖6)。與mimic NC和BICD2-WT共轉染組相比,miR-218-5p mimic和BICD2-WT共轉染組熒光素酶活性下調(P<0.05);與mimic NC和BICD2-MUT共轉染組對比,miR-218-5p mimic和BICD2-MUT共轉染組熒光素酶活性變化不顯著(P>0.05)。miR-218-5p mimic和RhoA-WT共轉染組SCC-15細胞的熒光素酶活性顯著低于mimic NC和RhoA-WT共轉染組(P<0.05);與mimic NC和RhoA-MUT共轉染組相比,miR-218-5p mimic和RhoA-MUT共轉染組的熒光素酶活性變化差異不顯著(P>0.05)(表6)。

表6 熒光素酶活性比較

圖6 Starbase預測CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與RhoA的結合位點

3 討 論

CircRNA呈閉合環狀結構,由于其特殊的結構,使CircRNAs比其線性mRNAs更穩定,這確保了它們的高度保守性[9]。據報道,CircRNA在人類腫瘤中表達異常,參與了腫瘤的進展[10]。如CircBICD2在OSCC 組織和細胞系中上調,抑制其表達顯著降低了OSCC細胞增殖、遷移和侵襲能力[11];下調CircBICD2抑制了肝癌細胞增殖[12]。以上研究表明CircBICD2在OSCC、肝癌等腫瘤中具有促癌的作用。

本研究顯示, CircBICD2在OSCC組織以及OSCC細胞CAL-27、HSC-4、SCC-15中CircBICD2呈高表達狀態,且SCC-15細胞中CircBICD2表達量最高,因此研究對象指定為SCC-15細胞。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腫瘤發生和發展中起重要作用,其涉及細胞極性喪失和細胞間粘附過程,使腫瘤細胞具有遷移和轉移的能力[13]。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin是參與腫瘤細胞EMT的重要蛋白質,N-cadherin和vimentin的減少和E-cadherin的增加通常預示著EMT受到抑制[14]。本研究顯示,沉默CircBICD2可抑制SCC-15細胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表達,促進E-cadherin表達,提示,沉默CircBICD2可抑制SCC-15細胞EMT過程。此外,本研究還發現沉默CircBICD2可抑制SCC-15細胞增殖,促進細胞凋亡。

CircRNA可通過海綿化miRNA來調控腫瘤進展[15]。生物信息學發現CircBICD2可與miR-218-5p靶向結合。miR-218-5p作為一種miRNA,相關研究表明,下調miR-218-5p可促進骨肉瘤細胞增殖,抑制細胞凋亡[16];上調miR-218-5p抑制了喉鱗狀細胞癌細胞增殖和侵襲能力[17];沉默miR-218-5p可促進胃癌細胞EMT[18]。表明miR-218-5p在骨肉瘤、喉鱗狀細胞癌、胃癌等腫瘤中具有抑癌的作用。本研究闡明,在OSCC組織及細胞中miR-218-5p低表達,過表達miR-218-5p可抑制SCC-15細胞增殖和EMT,促進細胞凋亡。此外,本研究還發現,沉默CircBICD2后,SCC-15細胞中miR-218-5p表達升高,且雙熒光素酶報告基因實驗證實了CircBICD2與miR-218-5p的靶向關系,推測沉默CircBICD2可能通過上調miR-218-5p表達抑制SCC-15細胞增殖和EMT,促進細胞凋亡。為了驗證該假設,本研究在下調CircBICD2的基礎上再通過抑制miR-218-5p表達的方式來干預SCC-15細胞,結果發現,anti-miR-218-5p減弱了沉默CircBICD2對SCC-15細胞增殖和EMT的抑制作用以及對細胞凋亡的促進作用。證實了猜想是正確的。

miRNAs是一類小的單鏈非編碼RNA,調節mRNA的轉錄或轉錄后的穩定性[19]。miRNA參與一系列生理活動,包括新陳代謝、細胞分化和腫瘤發生[20]。本研究為了進一步闡明CircBICD2靶向miR-218-5p調控OSCC細胞生物學行為的分子機制。本研究證實了RhoA為miR-218-5p的靶基因。RhoA是一種Rho家族GTP酶,它是細胞骨架功能的關鍵調節劑,RhoA激活已被證明可促進體外和體內腫瘤發生[21]。據報道,上調RhoA可促進OSCC細胞增殖和遷移[22]。提示RhoA在OSCC中發揮癌基因的作用。本研究顯示,在OSCC組織和細胞中RhoA蛋白上調表達,沉默CircBICD2后,SCC-15細胞中miR-218-5p表達升高,RhoA蛋白表達降低;過表達miR-218-5p后,SCC-15細胞中RhoA蛋白表達降低,且CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與RhoA存在靶向結合關系,證明了沉默CircBICD2可能通過上調miR-218-5p來抑制RhoA表達,進而抑制SCC-15細胞增殖和EMT,促進細胞凋亡。

綜上所述,沉默CircBICD2可能通過調控miR-218-5p/RhoA軸來抑制SCC-15細胞增殖、EMT,誘導細胞凋亡。本研究證明了CircBICD2/miR-218-5p/RhoA軸參與OSCC的腫瘤發生。這些發現揭示了OSCC中一個新的調控網絡,并可能有助于確定OSCC的新治療靶點。