大蒜素有效成分DATS對糞腸球菌抑制作用的體外研究

王立媛 申思敏 白錫靜

目前根管治療(root canal therapy, RCT)是治療牙髓炎和根尖周炎最有效的方法[1]。然而機械-化學預備手段并不能完全清除根管內的微生物[2-3],即使經過“完善”的RCT,仍有4%～15%的失敗率[4],失敗的主要原因是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)等致病菌引起根管內的持續感染[5-6]。徹底清除這些頑固致病菌,防止再感染,提高根管治療質量,是目前口腔醫學研究的熱點和重點之一[7-8]。

大蒜素是天然植物大蒜的提取物,生物安全性好,抗菌效果明顯,被譽為“廣譜抗生素”,其主要抗菌成分是二烯丙基化三硫(dially trisulfide, DATS),多項研究證實大蒜素及其衍生物對多種細菌具有抗菌作用。目前大蒜素對E.faecalis作用的研究報道較少。本研究將大蒜素抗菌成分DATS與臨床常用的氫氧化鈣制劑作比較,觀察這種天然藥物對E.faecalis的殺滅效果,為牙髓病和根尖周病的臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

糞腸球菌(標準株,ATCC 29212)、大蒜素標準品(二烯丙基三硫化物 DATS)、 BHI微生物培養基、二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司); BHIA培養基90 mm(常德比克曼生物有限公司); 氫氧化鈣糊劑(Well-Paste VERICOM,韓國); 電子分析天平(奧豪斯,美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大蒜素溶液配制 大蒜素標準品DATS溶解于DMSO中,充分震蕩,配制成20 mg/mL的原液,分裝至無菌聚丙烯小管內,存于-80 ℃冰箱,用時取出,BHI液體培養基進行微量稀釋法稀釋。

1.2.2 糞腸球菌菌液配制 按說明書復蘇糞腸球菌標準株,接種于血瓊脂固體培養基中, 37 ℃, 5% CO2條件下培養24 h,超凈臺內觀察菌落生長情況和菌落形態,確認為純培養。挑取3個單菌落,用無菌接種環接種至BHI液體培養基中,比濁儀校正濃度至0.5 mol/L,稀釋100 倍(約1×106CFU/mL)后備用。

1.2.3 DATS最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 采用液體二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC): 用BHI液體培養基將DATS溶液在96 孔板連續二倍稀釋,濃度依次為10 240、 5 120、 2 560、 1 280、……20 μg/mL,每孔加DATS溶液180 μL,加菌懸液20 μL。設立不含DATS的陽性菌液對照組和不含DATS也不含菌懸液的BHI 培養基陰性對照組。同時設立3 個平行對照。37 ℃培養過夜,以肉眼觀察液體清亮無混濁的最低藥物濃度為DATS的MIC值。

將未見細菌生長的各孔培養物,用無菌接種環接種于BHI瓊脂培養基平皿,厭氧培養24 h,培養基平皿無菌落生長的最低藥物濃度即為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)。

1.2.4 DATS對糞腸球菌生物膜的抗菌作用

1.2.4.1 離體牙的收集與預備 經天津市口腔醫院臨床研究倫理委員會審查批準(批準號: PH2021-B-001),選取2021 年10 月～2022 年1 月間因牙周病或正畸原因拔牙的健康單根管牙60 顆,年齡為15～50 歲。在本研究中,選取彎曲度不大于10°的牙根。用刀片清除離體牙表面的牙石及軟組織等附著物,保存在0.01% NaClO溶液中, 4 ℃保存備用。

用5.25% NaClO浸泡牙齒標本24 h。 使用600目金剛砂紙打磨,去除牙根表面的牙骨質。常規開髓、摘除牙髓,用登士柏Protaper 及廠家推薦操作流程,進行根管預備至F3。每次更換銼針均使用5.25% NaClO與17% EDTA交替沖洗,預備完成后超聲震蕩沖洗根管。使用金剛砂片磨除牙齒的冠方及根尖區,保留根中段圓柱形牙根,長度約為6 mm。分裝于BHI液體培養基中, 121 ℃、 1.5 MPa滅菌15 min,靜置于37 ℃、 5% CO2培養箱內, 24 h后觀察無渾濁,確定完全滅菌。 4 ℃保存備用。

1.2.4.2 分組 預備好的牙根60 個,隨機分為4 組(n=15)。各組處理如表1所示。

表1 實驗分組 (n=15)

1.2.4.3 感染模型制備 取45 顆牙根建立根管感染模型。分裝有牙根的離心管中注入標準菌液建立感染模型,置于37 ℃, 5% CO2培養箱內孵育28 d, 每2 d更換1 次菌懸液。在整個過程中嚴格無菌操作。孵育結束后延牙體長軸剖開,掃描電鏡觀察E.faecalis生物膜形成情況。

1.2.4.4 放置根管消毒劑及檢測消毒效果 無菌生理鹽水蕩洗根管,干燥后,以黏蠟封閉底部根管口,并將牙根固定于六孔板中,每孔1 顆牙根。

按表1所示,使用無菌注射器將藥物分別注入根管內。將六孔板置于培養箱內,分別于實驗第1 天、第3 天和第7 天,每組取出5 個標本,無菌生理鹽水蕩洗去凈根管內試驗藥物,干燥后,滅菌慢速球鉆均勻磨除根管內層牙本質,電子天平稱取4 mg牙本質粉末,置于2 mL BHI液體培養基無菌試管中,培養72 h。取肉湯上層液體,以電子比濁儀讀取濁度,記錄數值。

1.3 數據分析

使用SPSS 26.0統計軟件,各組不同時間點的濁度值比較選用單因素方差分析(表2), 不同實驗組間同一時間點的兩兩比較采用Tamhane法,各實驗組內不同時間點的兩兩比較采用LDS法,檢驗水準取α=0.05。

表2 各組不同時間點根管內層牙本質粉末培養上層液體濁度

2 結 果

2.1 DATS最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

采用倍比稀釋法測定DATS的MIC值為2 560 μg/mL, MBC值為5 120 μg/mL。

2.2 感染模型的建立

掃描電鏡觀察顯示大部分牙本質小管內有細菌生長 (圖1),細菌侵入深度可達500 μm,感染模型建立成功。

圖1 牙本質小管感染糞腸球菌的模型建立(SEM, ×6 000)

2.3 藥物對糞腸球菌生物膜的抗菌作用

第1 天時, DATS組、氫氧化鈣糊劑組渾濁度顯著低于陽性對照組,有明顯抑菌效果,差 異具有統計學意義(P<0.05);兩實驗組渾濁度顯著高于陰性對照組(P<0.05),仍有細菌生長;DATS組抗菌效果顯著優于氫氧化鈣組(P<0.05) (圖2)。DATS組,第3 天和第7 天的渾濁度與陰性對照組均無統計學差別(P>0.05),已無細菌生長。氫氧化鈣糊劑組,第3 天較第1 天殺菌作用更明顯(P<0.05);第3 天與第7 天渾濁度無統計學差別(P>0.05);各時間點渾濁度顯著高于陰性對照組(P<0.05),均有細菌生長(圖3)。

圖2 各組不同時間點根管內層牙本質粉末培養上層液體濁度

圖3 同一組不同時間點根管內層牙本質粉末培養上層液體濁度

3 討 論

E.faecalis是革蘭氏陽性菌,腸球菌屬,存在于人體的口腔、呼吸道、腸道等多個部位,是一種條件致病菌, 被認為是感染根管中最難清除的菌種之一[9]。是難治性根尖周炎、根管治療失敗再感染根管的主要致病菌[10]。杜琛[11]和李瑩雪等[12]研究發現,E.faecalis在根管治療后持續或繼發性感染根管中具有較高的檢出率。 Zheng 等[13]的實驗表明,E.faecalis能高度耐受低氧、高鹽、寡營養的惡劣環境,并快速獲得抗藥性和形成生物膜[14-15]。同時,E.faecalis還表現出對堿性脅迫的抗性[16-17]。這些特性使E.faecalis成為根管治療失敗的一個難題。本實驗對不易產生耐藥并具有抗菌作用的中藥大蒜素對E.faecalis的抑菌作用進行研究。

氫氧化鈣具有抗菌性,可以殺滅或抑制感染根管中的多種細菌[18],能夠減輕牙髓炎和根尖周炎患者的疼痛程度,被廣泛應用于臨床[19]。氫氧化鈣是接觸性消毒藥物,殺菌作用主要依靠其高堿性。即使飽和的氫氧化鈣,仍不能對牙本質上的E.faecalis生物膜達到良好的清除效果[17]。一方面,E.faecalisd的菌體直徑小于牙本質小管的直徑[20],可在牙本質小管和管間牙本質定植,氫氧化鈣彌散性差,難以直接作用殺滅細菌[21];另一方面,E.faecalis可通過細胞質的緩沖能力和“質子泵”機制保持菌體內pH值的平衡[22-23],同時天然牙本質具有降低氫氧化鈣pH值的能力。本研究使用臨床常用的pH值為11的成品氫氧化鈣糊劑,作用于E.faecalis感染根管模型,比較不同時間點根管內壁的感染情況。結果顯示:第1 天開始氫氧化鈣糊劑組牙本質小管中殘留細菌量明顯減少(P<0.05),第1、 3、 7 天均與陰性對照組存在顯著性差異,提示氫氧化鈣對E.faecalis有殺菌效果,但不能完全清除細菌。其中第7 天較第3 天,菌量雖有下降但無統計學意義,分析原因與氫氧根消耗減少和氫氧化鈣本身沒有揮發性及擴散能力,使其無法對牙本質小管深層的細菌及其毒素起作用有關。因此,氫氧化鈣無法對感染根管中的E.faecalis起到較好的殺滅或抑制作用。

大蒜為百合科蔥屬類植物,以鱗莖入藥,是一種傳統中藥,古人很早就發現其具有藥用價值[24],因其生物安全性好,抗菌效果明顯,被譽為“廣譜抗生素”[25]。大蒜素是大蒜提取物的多種成分的總稱,含有多種生物活性化合物,其中DATS是多種大蒜提取物中占比最高的一種硫化物,約占所有混合大蒜素的41.5%[26]。有多項研究表明:DATS的生理活性作用更有效[27]。大蒜素的抗菌機制主要與菌體巰基酶的競爭性抑制[28]、對病原微生物菌體結構的侵入和破壞[29]、生物被膜的抑制和消散[30], 以及DATS的作用靶點及多重抑制效應等有關[31]。本研究選用大蒜素的有效成分DATS進行研究,成分單一,抗菌效果明確。

王祥柱等[32]研究顯示,高濃度(5 120 mg/L)DATS對饑餓期E.faecalis生物膜抑菌抗菌效果較好。本實驗采用倍比稀釋法測定DATS的最小殺菌濃度為5 120 μg/mL,與該學者的研究結果一致。實驗中比較不同藥物對E.faecalis的殺菌效果,也選用5 120 μg/mL的DATS。劉琳[33]選用12 mg/mL的大蒜素注射液與甲醛甲酚(FC)進行比較,其殺菌效果與FC無明顯差異,證實大蒜素對E.faecalis明確的滅菌效果,并具有明顯低于FC的毒性。本研究結果顯示, 5 120 μg/mL的DATS第1 天時已顯示對E.faecalis明顯的殺滅效果, 第3 天時可以將E.faecalis全部殺滅,效果優于對照組的臨床常用的氫氧化鈣糊劑。進而證實了大蒜素對生物膜狀態的E.faecalis有明確的抑制與殺滅效果,提示可以將大蒜素用于難治性感染根管的治療,具有強于氫氧化鈣的殺菌抑菌效果和揮發性的優勢。

大蒜素是大蒜中分離提取出的化合物,抗菌效果明顯,不易產生耐藥性。對難治性感染根管的E.faecalis生物膜有殺滅效果。但大蒜素有刺激性氣味,遇熱不穩定,從而減弱甚至喪失功效,使其在臨床上的應用受到一定的限制。大蒜素進一步應用于口腔臨床治療還有賴于對其藥理作用在分子水平上的深入研究,以及對大蒜素制劑的進一步研制。