基于間接波前整形的近紅外二區熒光共聚焦成像研究

譚 天，史天悅，吳長鋒，彭洪尚

（1.中央民族大學 理學院 光子系統工程軟件教育部工程研究中心,北京 100081；2.南方科技大學 生物醫學工程系,廣東 深圳 518055）

1 引言

高分辨率的光學成像技術一直是推動生物學發展的主要手段，在生物分子解構[1]、光遺傳[2]和細胞形態學[3]等方面發揮著不可替代的作用。然而，生物組織的折射率分布不均勻，組織的散射會引起嚴重的光學像差，使得照明光無法高保真度地聚焦，從而限制了組織成像的深度和信噪比。隨著成像深度的增加，生物組織產生的光學像差階數也逐漸增加[4]，以至于照明光被多次散射而完全丟失其光場信息。這導致實現生物組織深處的非侵入性的高分辨顯微成像變得愈發困難。因此，它也成為光學研究領域公認的難點之一[5]。

生物組織對光的影響主要表現為散射和吸收，兩者均與光的波長密切相關。研究表明在生物組織中存在具有較低散射系數和吸收系數的“近紅外窗口”,可以緩解生物組織對于入射光線的影響[6]。雖然，目前對于近紅外一區熒光材料的研究逐漸完善[7]，但仍難以滿足人們對成像深度的需求。近年來，由于近紅外二區熒光成像具有更深的組織穿透率，故其作為一種新興技術逐漸在成像中得到廣泛應用[8]。在近紅外二區窗口（NIR-II，1 000～1 700 nm），Dai 課題組開發了小動物成像系統[9-10]和光片顯微系統[11]。由于抑制了激發和發射光在生物組織中的散射，生成的圖像明顯比傳統可見光和近紅外一區窗口的圖像更清晰。當前，近紅外二區成像面臨的主要問題是性能優異、生物相容性好的熒光探針比較匱乏[12-13]。因此，開發高效的NIR-II 熒光探針是活體熒光成像的熱點之一。

自適應光學（Adaptive Optics，AO）正在被引入至成像系統中，以校正成像過程中產生的各類光學像差[14]。AO 方法是一種光電儀器和計算方法相結合的方法，由3 個主要組件組成：測量像差的傳感器，補償像差的校正器[15-17]以及根據傳感器測量值計算校正器所需信號的控制器。光學像差可以使用專用波前傳感器進行直接測量，也可以從圖像中間接確定。人們將這兩種方法分別稱為“直接波前測量AO”[18-19]和“間接波前測量AO”[20-21]。在生物成像領域，相比于直接波前測量AO，間接波前測量AO 不需要依賴波前傳感器和在目標區域內置“引導星”標記，可以顯著降低實驗的復雜度和對于目標的侵入性。因為沒有專用的波前傳感器，在確定存在的像差大小和所需的校正方面，間接方法明顯慢于基于傳感器的方法。但是，由于顯微鏡和生物組織產生的像差能夠相對靜態地持續數小時之久[22]，故間接方法在生物顯微成像領域也得到了廣泛的應用。與非線性熒光相結合，Cui 小組[23,24]和Judkewitz 小組[25]分別提出了新的間接波前測量辦法。IMPAC[23]和F-SHARP[25]，各自實現了小鼠大腦中達400 μm深度的雙光子成像。上述工作引發了廣泛關注，但這兩個工作并不能推廣到頭骨比較厚的應用場景[26]。如何進一步抑制生物組織的散射，提高高分辨率系統在生物組織內的成像深度仍有待于人們探索。

本文制備了生物相容性好、熒光亮度高的近紅外二區熒光探針，在808 nm 激光激發下，發射波長覆蓋990～1 300 nm，可以有效地抑制生物組織的散射對激發光和熒光信號的影響。進一步將基于間接波前測量的自適應光學方法與激光掃描共聚焦系統相融合，以校正生物組織產生的光學像差，提高穿透組織成像的分辨率和對比度。比較了兩種常見的用于間接波前測量的控制算法，“遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）”[27]和“動態自適應散射補償全息術（Dynamic Adaptive Scattering compensation Holography，DASH）”[28]。實驗表明，雖然DASH 算法被用于雙光子成像的像差校正時，具有比GA 算法更快的收斂速度和更高的信號提升能力，但在線性熒光成像中GA 算法的校正效果卻優于DASH 算法。本文開展了一系列的仿體和活體實驗，使用間接波前測量校正不同像差后，熒光信號強度提升為校正前的1.47、1.95 和2.85 倍，提升了系統的分辨率與對比度。本研究將近紅外二區熒光探針與自適應光學像差補償技術相結合，為深層生物組織內高分辨成像提供了新路徑。

2 材料與方法

2.1 近紅外二區熒光材料

在可見光和傳統的近紅外一區窗口（700～900 nm），生物組織具有很強的散射，在近紅外二區窗口（1 000～1 700 nm），光學散射顯著降低?？紤]到半導體聚合物具有良好的生物相容性和較高的量子效率（3%）[29]，本文選擇其作為熒光探針材料，如圖1 所示。熒光探針在700～900 nm 處有很強的吸收，在990 nm 處和1 118 nm 處具有兩個發射峰。因此，在808 nm 激光的激發下，可以實現近紅外二區發射，從而顯著降低生物組織對于激發光和熒光信號的散射。

圖1 半導體聚合物熒光探針的吸收與發射光譜Fig.1 Absorption and emission spectra of the semiconductor polymer fluorescent probes

2.2 熒光微珠的制備

將直徑為100 nm 的聚苯乙烯（PS）微球稀釋到0.5 wt%的水溶液中，利用超聲儀使其充分分散后用0.22 μm 的濾頭過濾。調配水和四氫呋喃（THF）體積比滿足5∶1，向PS 微球中快速注入1 mg/L 的半導體聚合物THF 溶液并渦旋10 s，之后攪拌6 h，以保證熒光探針的裝載。將熒光微珠在15 000 g 下離心30 min 后倒掉上清液并加水超聲，重復清洗1 次后制得的熒光微珠樣本用于成像實驗。

2.3 電紡絲樣本制備

電紡絲由于具有復雜的三維結構以及易于負載熒光材料的特性，可以模擬生物復雜的血管組織成像。使用1 mg/L 的半導體聚合物THF 溶液將電紡絲浸透后在黑暗通風環境中晾干，之后用速干膠和玻片進行封裝以制得由半導體聚合物標記的電紡絲樣本。電紡絲樣本中典型電紡絲的直徑在8 μm 左右。

2.4 散射模型的制備

將0.2 g 的瓊脂糖與1.7 mL 純水混合后在90 °C 下恒溫攪拌，充分溶解后加入0.1 mL 全脂純牛奶并繼續加熱，待混合均勻后取出靜置凝固以制得具有一定散射系數的瓊脂散射模型。

2.5 活體小鼠樣本制備

對3 個月大的C57 小鼠使用異氟烷氣體進行麻醉后用電動理發剪和脫毛膏取出頭部的毛發。通過尾靜脈注射100 μL、濃度為200 μg/L 的半導體聚合物溶液并通過腹腔注射10%的水合氯醛溶液以保證長時間麻醉。充分麻醉后使用手術剪剪去頭皮，并用3%的過氧化氫溶液清理骨外膜防止其對實驗造成影響，最后使用生理鹽水清洗創口。

2.6 系統光路設計

設計的共聚焦成像系統如圖2（彩圖見期刊電子版）所示，808 nm 近紅外連續激光器（DL808-400，CrystaLaser，USA）發射的波長為808 nm 的近紅外光作為激發光。發出的激光首先經過一個偏振片和4f 擴束系統變為偏振光且光斑半徑擴大為初始的8.3 倍，以更方便液晶空間光調制器（Spatial Light Modulator，SLM）對入射光束進行調制。隨后擴束的激光光束經過一反射鏡反射后以特定的角度入射到SLM（PLUTO-2.1-NIR-135，holoeye，Germany）上。入射光經過SLM 調制后通過一個4f 收束系統使得光斑半徑縮為擴束后的0.42 倍。之后入射光先后經過二向色鏡（Dichroic mirror，DM）、掃描振鏡（Galvo scanner，GS）（6210 H，Cambridge Technology，USA）、掃描透鏡（Scan lens）（SL50-3P，Thorlab，USA）、管鏡（Tube lens）（TTL200 MP，Thorlab，USA）、反射鏡和顯微物鏡（XLPlan N 25X，Olympus，Japan）聚焦于樣本上。通過掃描振鏡、掃描透鏡和管鏡組成的中繼光路可以實現聚焦光斑在樣本平面內的掃描，最大掃描視場為1 320 μm×1 320 μm。樣本激發出的熒光信號通過物鏡、反射鏡、管鏡、掃描透鏡、掃描振鏡和二向色鏡后由一焦距為125 mm 的凸透鏡聚焦于光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）上，PMT 前放置一直徑為75 μm 的小孔以濾除目標激發區域以外的雜散光。在光學上，SLM 與樣本表面的散射介質共軛，通過在SLM上疊加一定的相位全息圖，以對散射介質產生的像差進行補償，從而緩解因散射介質導致的入射光不聚焦的問題。

圖2 基于間接波前測量的近紅外激光共聚焦掃描顯微系統Fig.2 Near-infrared laser scanning confocal microscope based on indirect wavefront sensing

本文實驗均采用808 nm 連續激光對樣本進行激發，使用長通濾光片和 PMT 收集波長大于980 nm 的近紅外熒光信號后重建圖像。

相比于目前常用的雙光子、多光子成像采用的500～700 nm 左右的信號光，本系統采用近紅外一區激發、近紅外二區發射的單光子成像方式具有更好的穿透組織的能力，可以有效提升未校正時的信號強度，為波前整形提供良好的前置條件。

2.7 基于間接波前測量的光學像差補償方法

在穿透散射介質的共聚焦成像中，由于散射介質對于入射光的散射作用，會使聚焦光斑的質量下降，并且隨著深度的增加，這種影響會愈加顯著，從而降低圖像的對比度并影響成像的分辨率。對此，研究人員提出了直接測量像差波前并在反演后使用SLM 對其進行校正的直接波前傳感的方法[18-19]。但是該方法不僅需要引導星等來標記從所需成像點發出的光，還會顯著增加系統復雜度。

基于間接波前傳感的方法不需要波前傳感器和引導星，其原理如圖3 所示。在經過一輪完整的成像流程后，探測器將捕獲到的熒光信號傳遞至計算機，經過特定的算法處理后對SLM 的相位校正作出控制并進行第二輪成像，再一次接受從傳感器捕獲的熒光信號。經過一系列的成像并對成像效果使用評價函數（Cost Function，CF）進行測量，計算機最終會找到可靠的校正模式。

圖3 控制SLM 的反饋系統Fig.3 Feedback system for controlling SLM

當聚焦光斑質量提升時，成像熒光強度會顯著提升，同時因為更小的光斑會導致成像的展寬縮減，這會使得成像的整體銳度提升。所以本文選取了銳度函數作為對整體成像質量的評判標準，具體如下：

其中：n為成像圖中采樣點的個數，f為由采樣點坐標及其熒光強度建立的曲面函數。

遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）是一種用于間接波前測量的經典方法[27]。在迭代過程中使用評價函數對不同的相位矩陣調制下的成像圖進行分析，選取評價函數較高的相位矩陣作為親代，對其加權平均后生成子代，最終得到可以很好校正像差波前的校正模式。該算法已用于波前整形并可以取得較好的優化效果，但是目前還沒有將其用于近紅外二區單光子熒光共聚焦顯微鏡中的報道。

近年來，另一種高效的間接波前傳感的自適應光學算法被報道。它在雙光子成像系統中具有極快的收斂速度并且可以實現較高的信號增強，被稱為動態自適應散射補償全息術（Dynamic Adaptive Scattering compensation Holography，DASH）。該方法利用SLM 將入射光束分為兩束，一束為調制波前，一束為參考場。兩束入射光同時入射進行干涉測量，使得迭代速度顯著增加[28]。本文嘗試將上述兩種波前整形方法應用于近紅外二區單光子熒光共聚焦顯微鏡中，以檢驗他們在該系統中對于像差的校正效果，選取效果更好的方法進行進一步實驗。

由于本系統掃描振鏡的掃描頻率對單次成像有限制，單輪迭代的時間一般為45～60 s，若需要對動態散射介質進行補償，可使用掃描頻率更快的掃描振鏡，將單輪迭代時間縮短至5 s 以內。

3 結果與討論

3.1 系統像差測試與校正

在系統搭建過程中由于各光學元件和參數的不精確會產生系統像差，在全視場上成像時可以使用GA 算法進行校正，補償結果可作為成像系統的系統像差。

對熒光微珠樣本直接進行掃描共聚焦成像并使用GA 算法進行校正，結果如圖4（彩圖見期刊電子版）所示。

圖4 系統像差的測試與校正。（a）未進行校正時的樣本成像；（b）經過系統像差校正后的樣本成像圖；（c）評價函數隨迭代輪次的變化曲線；（d）GA 算法計算得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）全視場圖中比例尺為200 μm，感興趣區域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.4 Testing and correction of the system aberrations.(a) Imaging of samples without correction;(b) imaging of samples after systematic aberration correction;(c) curve of the evaluation function as a function of iterative order;(d) the corrected phase diagram calculated by GA；scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b)

由圖4 可知，通過對系統像差校正前后的成像進行對比發現，在校正系統像差后，此前未被激發或信號強度較低的熒光微珠信號得到了較大的提升。通過對評價函數隨迭代次數的變化進行分析（圖4（c）），GA 算法可以在2-3 代內快速收斂至理想值，體現了GA 算法可以快速校正像差的特點。圖4（d）為最終迭代后施加在SLM 上的相位圖，可以認為該相位圖能夠對系統像差進行校正。

3.2 體外電紡絲樣本的像差校正

為了對比GA 算法和DASH 算法在近紅外二區熒光共聚焦成像中的像差補償效果，在相同的像差條件下分別使用GA 算法和DASH 算法進行相位圖校正。使用近紅外二區熒光共聚焦系統對電紡絲樣本進行成像，選取成像較為清晰的區域作為目標平面。在對目標平面對焦之后，將載物臺向下平移30 μm。通過這種方式引入了一個30 μm 的空氣平板，可以在成像光路中引入了一個固定的像差。通過對比GA 算法和DASH算法的校正效果驗證這兩種算法在近紅外二區單光子熒光共聚焦顯微鏡成像中的適用性，實驗結果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。

圖5 電紡絲像差校正結果。（a）引入一個30 μm 的空氣平板并僅進行系統像差校正的成像圖；（b）在圖（a）成像情況下，使用DASH 算法進行像差校正；（c）在圖（a）成像情況下，使用GA 算法進行像差校正；（d）為（a）（b）（c）中感興趣區域的局部放大圖白線標記處的熒光強度分布；（e）DASH 算法得到的校正相位圖；（f）GA 算法得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）（c）全視場圖中比例尺為200 μm，感興趣區域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.5 Aberration correction results of electrospinning.(a) Image with a 30 μm air plate and performing only system aberration correction;(b) in the case of imaging in figure (a),aberration correction caculated by using DASH;(c) in the case of imaging in figure (a),aberration correction caculated by using GA;(d) fluorescence intensity distribution at the white line marker in partial enlarged pictures of the region of interest in figures (a) (b) (c);(e) the corrected phase map calculated by DASH;(f) the corrected phase diagram calculated by GA；Scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b) (c)

在引入一個固定像差的基礎上，在SLM 上施加圖4（d）所示的相位圖，即只進行系統像差的校正，成像結果如圖5（a）所示?？梢钥闯鲭娂徑z展寬較為嚴重且熒光強度較低。分別經過DASH算法和GA 算法校正后，圖像的對比度和熒光強度得以提升，如圖5（b）和5（c）所示。對紅框中單根電紡絲進行熒光強度分析量化，結果如圖5（d）所示?？梢钥闯?，由于兩種算法校正效果的差異，使得校正后的對焦平面略有不同。

以上實驗結果表明兩算法均可以實現對于外加像差的校正，DASH 算法顯著降低了電紡絲不正常的展寬，將其寬度由23.8 μm 降低至10.5 μm，但是信號強度卻沒有明顯提升。這可能與DASH算法得到的相位圖有關（圖5（e）），相比于GA 算法得到的相位圖（圖5（f）），DASH 算法產生了過多的雜散相位，導致部分入射光發散而無法參與激發。GA 算法在維持背景信號幾乎不變的情況下將熒光信號的峰值強度提升為初始的1.47 倍，并且將電紡絲的寬度由23.8 μm 降低至11.6 μm，顯著提高了熒光信號的強度和成像對比度與分辨率。

DASH 算法相比于GA 算法，對電紡絲展寬具有更好的校正效果。DASH 算法可以產生點擴散函數（PSF）更小的聚焦光斑，符合其適用于雙光子成像的特征。但GA 算法對于入射光全光束的調制使得其可以更加有效地利用入射光強，顯著提升激發熒光的信號強度。本實驗表明在近紅外二區單光子共聚焦成像中，GA 算法較DASH算法更適用。因此，本文使用GA 算法結合近紅外二區共聚焦系統來驗證其對于各類散射介質產生像差的校正效果。

3.3 仿體實驗的像差校正

為驗證GA 算法對散射介質產生像差的校正效果，通過在電紡絲樣本上添加一定的散射介質作為仿體進行體外實驗。經過對比實驗，本系統對厚度最大約500 μm 的瓊脂散射模型具有較好的校正效果。在電紡絲樣本與顯微物鏡之間添加厚度為480 μm 的瓊脂散射模型模擬在成像過程中生物組織對入射激發光的散射，先后進行添加散射介質成像、校正系統像差成像和校正全像差成像。

實驗結果如圖6 所示，添加散射介質后，由于其對入射光線的散射，激發光斑質量極差，不止熒光強度大幅度下降，也產生了大量的背景噪聲，嚴重影響了成像質量（圖6（b））。通過在SLM 上施加圖4（d）所示的相位圖以校正系統像差，成像質量有一定的提升，但入射光散射導致的背景噪聲依舊十分嚴重（圖6（c））。最后使用GA 算法對整體成像的全像差進行校正，結果如圖6 所示（d），對比只進行系統像差校正下的成像，在提升了整體熒光強度的情況下顯著降低了背景噪聲。對圖6（a）～6（d）紅框區域白線標記處的熒光強度分布進行分析量化，結果如圖6（e）所示?？梢钥闯?，在添加介質且未進行任何處理時，電紡絲樣本的成像質量極差，熒光信號被淹沒在背景噪聲之中。在進行系統像差校正后，出現了一些熒光信號，但大量的背景噪聲導致成像中不能看到明顯的熒光強度峰值，成像的對比度很低，而在使用GA 算法對全像差進行校正后，出現了明顯的熒光強度峰值且在峰值處的熒光強度提升為僅進行系統像差校正的1.95 倍，顯著提升了成像對比度?？梢钥闯鼋涍^像差校正后的電紡絲成像與初始的參考圖像相比具有近似的半高寬。說明本方法有效減少了散射介質的影響，由于SLM 對于入射光的調制使得入射光角度略微偏移，熒光峰值偏移約2.5 μm，該尺寸相比于全視場而言可以忽略。驗證了該算法對散射介質產生的像差具有良好的校正效果。

圖6 散射介質像差校正結果。（a）直接成像圖；（b）添加散射介質后的成像圖；（c）添加介質后進行系統像差校正后的成像圖；（d）添加介質后進行全像差校正后的成像圖；（e）圖（a）-（d）局部放大圖中白線標記處的熒光強度分布；（f）GA 算法計算得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）（c）（d）全視場圖中比例尺為200 μm，感興趣區域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.6 Aberration correction results of scattering medium.(a) Direct imaging;(b) image after adding scattering medium;(c) image after system aberration correction;(d) image after total aberration correction;(e) distribution of fluorescence intensity at white line markers in partial enlarged pictures of (a)-(d);(f) the corrected phase map calculated by GA;Scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b) (c) (d)

3.4 活體小鼠腦部成像實驗

為檢驗本系統在活體成像中對于生物散射組織的校正效果，對保留了完整顱骨的小鼠顱內血管進行成像。在僅校正系統像差和校正全像差兩種情況下對活體小鼠顱骨以下具有較明顯信號的血管進行成像，經過測量，該血管位于顱骨以下320 nm。

實驗結果如圖7（彩圖見期刊電子版）所示。由于顱骨對于入射光的散射致使激發光斑質量不佳，整體成像的熒光信號強度不佳（圖7（a））。使用GA 算法進行校正后，被顱骨散射而無法參與熒光激發的光線被重新聚焦，使得激發起的熒光強度大幅度提升（圖7（b）），對圖7（a）和7（b）白線標記處的熒光強度分布進行分析，結果如圖7（c）所示。結果顯示全像差校正后的熒光強度較只進行系統像差校正時提升了2.85 倍。證明該方法用于活體生物成像時對活體組織產生的像差具有校正能力。圖7（d）為評價函數隨迭代輪次的變化曲線?？梢?，相比于體外成像實驗（圖4（c）），其上升速度較慢，需要約9-10 代才收斂至理想波前。這說明該算法對于復雜像差的校正需要迭代更多的輪次。

圖7 活體小鼠顱內成像。（a）僅進行系統像差校正的小鼠顱內血管成像圖；（b）進行全像差校正后的小鼠顱內血管成像圖；（c）圖（a）（b）中白線標記處的熒光強度分布；（d）評價函數隨迭代倫次的變化曲線；比例尺：（a）（b）中比例尺為200 μmFig.7 Intracranial imaging results of living mice.(a) Image of intracranial blood vessels in mice with only systematic aberration correction;(b) image of intracranial blood vessels in mice with full aberration correction;(c) the fluorescence intensity distribution at the white line markers in (a) and (b);(d)curve of the evaluation function as a function of iterative order;scale: 200 μm in (a)(b)

4 結論

為了改善成像過程中由于系統和散射介質等產生的光學像差對最終成像質量的影響，本文介紹了兩種基于間接波前測量的光學像差補償方法，并將其與近紅外二區共聚焦成像系統相結合，利用液晶SLM 對入射激發光波前進行整形從而實現對于系統、介質等產生的光學像差的補償。該方法可以在數次迭代內顯著提升穿透介質后成像的信號強度及成像對比度與分辨率。實驗結果表明，GA 算法相比于DASH 算法在近紅外二區共聚焦線性熒光成像中具有更好的校正效果，在穿透空氣平板、瓊脂散射介質和小鼠顱骨的成像中，信號強度分別提升為僅進行系統像差校正的1.47倍、1.95 倍和2.85 倍。本研究為進一步開展活體小鼠顱內非侵入式熒光成像提供了有意義的參考。