聚乙烯亞胺修飾化二硫化鉬光控納米粒在阿替洛爾經皮遞藥中的應用

崔藝艦，張凱，喬天琪，劉曉暢

（1.沈陽醫學院基礎醫學院病原生物學專業2021級碩士研究生，遼寧 沈陽 110034；2.河北農業大學理工學院；3.河北北方學院研究生院；4.沈陽醫學院藥學院；5.沈陽醫學院遼寧省過敏性疾病過敏原致病機制研究重點實驗室）

高血壓是世界范圍內的健康問題之一，具有較高的發病率［1］。高血壓的常規療法是口服治療，導致患者的依從性差，生物利用度低［2］。經皮給藥系統 （transdermal drug delivery systems，TDDS）具有提高患者依從性、延長治療效果、減少副作用、提高生物利用度等優勢［2-3］，可克服口服給藥帶來的問題。隨著材料科學和納米技術的發展，多種無機納米材料作為載體材料廣泛應用于TDDS， 如金、 銀的納米粒（nanoparticles，NPs）［4-5］、氧化石墨烯［6-7］等。其中，二硫化鉬（MoS2）由于較高比表面積、易于表面改性、優異的光熱轉換能力而備受關注，已被用于多種藥物遞送的研究中［8-9］。Liu 等［10］研究了聚乙二醇（PEG）修飾的MoS2納米片，發現MoS2的藥物裝載率遠遠高于氧化石墨烯的裝載率。Chou等［11］描述了層狀MoS2作為近紅外光熱劑的光熱特性，并證明層狀MoS2比石墨烯和金納米棒表現出更好的光熱性能。本研究開發了一種三維花狀的聚乙烯亞胺修飾的二硫化鉬納米粒（polyethyleneiminemodified MoS2nanoparticles，PEI-MoS2NPs）作為光熱劑和藥物載體，并對其進行了體外藥物釋放、皮膚滲透、光熱轉化效率和載藥效率研究，以期建立一種可以通過近紅外激光照射控制藥物釋放的TDDS（圖1）。

圖1 PEI-MoS2 NPs作為載體的示意圖

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 四水合鉬酸銨、硫脲、氨基甲酸乙酯、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI，M.W. =10 000 g/mol）均為分析純，購于上海麥克林生化科技有限公司；阿替洛爾（色譜純）購于上海羅恩化學技術有限公司；聚乙二醇400（PEG400，分析純）購于天津百倫斯生物技術有限公司。甲醇、磷酸，均為色譜純，購于山東禹王集團；HE 染色液試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠6只，體重180～220 g，6～8 周齡，實驗動物許可證號SCXK（遼）2019-0001；健康家兔4只，體重1.8～2.2 kg，3 月齡，雌雄不限，實驗動物許可證號SCXK（遼）2019-0001，均購于遼寧長生生物有限公司。適應性喂養1周。本研究經學校實驗動物福利倫理委員會審查，動物使用符合動物福利要求。

1.3 儀器 SYT-102 型多功能透皮擴散儀（延吉艾迪扼科技有限公司）；Perkin Elmer 2000紅外光譜儀（美國Perkin Elmer公司）；Rigaku SmartLab SE X 射線衍射儀（日本Rigaku 公司）；日立SU8100 掃描電子顯微鏡、日立L-2000 高效液相色譜儀（日本Hitachi 公司）；JEOL JEM-2100F 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；H01-1D 磁力攪拌器（上海馳久儀器儀表制造有限公司）；Spherisorb ODS2 C18 色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters 公司）；Mexameter? MX 16皮膚色素檢測儀（德國Courage&Khazaka 公司）；Phars 450/808-10W 多模泵浦激光器（深圳市啟揚光學科技有限公司）；DZF-6051 真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；BT-Zeta100 電位/粒度/分子量分析儀（丹東百特儀器有限公司）；TSJ-Q組織脫水機、BMJ-III 包埋機（常州中威電子儀器廠）；CM1950 冷凍切片機、DM4 B 顯微鏡（德國徠卡生物系統有限公司）；Hamamatsu NanoZoomer-SQ數字切片掃描儀（日本濱松光子學株式會社）。

1.4 方法

1.4.1 PEI-MoS2NPs 的合成 采用一步水熱法合成PEI-MoS2NPs［12］。將1.24 g 四水合鉬酸銨、2.28 g硫脲和1.24 g PEI加入36 ml水中，攪拌溶解。將上述溶液轉移至50 ml特氟隆內襯不銹鋼高壓釜中，在烘箱中220 ℃加熱6 h。5 000 r/min離心10 min 后收集合成的產物，并用去離子水和無水乙醇洗滌3次。在60 ℃真空下干燥24 h后即得PEI-MoS2NPs。

1.4.2 PEI-MoS2NPs 的表征 使用BT-Zeta100 電位/粒度/分子量分析儀對PEI-MoS2NPs 進行粒徑大小及Zeta 電位的表征。使用Perkin Elmer 2000紅外光譜儀和KBr 壓片法表征納米粒的化學結構，掃描范圍為400～4 000 cm-1。通過Rigaku SmartLab X 射線衍射儀表征NPs 的結構信息。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡用于觀察NPs 的形態。

1.4.3 光熱轉換性能 配制不同濃度的 PEIMoS2NPs 溶液（0.1、0.5、1.0 mg/ml），在溶液中放入溫度監測器，使用808 nm 多模泵浦激光器照射PEI-MoS2NPs 溶液5 min，記錄溶液的溫度變化。并通過3 次開閉循環實驗探究光熱穩定性。研究不同濃度PEI-MoS2NPs 在不同激光強度（0.2、0.5、1.0 W/cm2）對光熱轉化性能的影響。

1.4.4 HPLC-UV 法測定阿替洛爾的濃度 HPLCUV法色譜條件：流動相為甲醇-水-磷酸溶液（70∶30∶0.1，v/v/v），ODS-2 C18 色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為25 ℃，流速設定為0.7 ml/min，檢測波長為275 nm。

1.4.5 載藥效率的測定 稱取適量PEI-MoS2NPs，分散于pH 7.0 磷酸鹽緩沖液中超聲30 min 后，制成1.0 mg/ml 的PEI-MoS2NPs 的混懸液。然后將相同體積不同濃度的阿替洛爾溶液加入到PEI-MoS2NPs溶液中，使藥物與納米粒的質量比在0.5∶1至1∶8 范圍內。32 ℃恒溫振蕩48 h 后，室溫下以13 300 r/min 離心5 min，分離游離藥物和載藥PEI-MoS2NPs。取上清液按“1.4.4 HPLC-UV 法測定阿替洛爾的濃度”項下測定樣品中游離藥物濃度，按下述公式計算載藥效率：

1.4.6 體外釋放實驗 將水平雙室擴散池置于32 ℃的加熱槽中，擴散池的有效面積為1.5 cm2，體積為4 ml。在2個擴散池之間放置0.22 μm的尼龍濾膜，接收池中加入4 ml 含有15% PEG400 的pH 7.4 PBS溶液，供給池中加入4 ml供給液，其中非激光照射組和激光照射組為0.5 mg/ml 載藥PEI-MoS2NPs溶液（藥物濃度為0.27 mg/ml），對照組為0.27 mg/ml 的阿替洛爾水溶液。在8 h 內每小時從接收池中吸取2 ml 的樣品，并用相同體積的新鮮PBS 替換。在1、3、5 和7 h 取樣后，激光照射組使用激光（0.5 W/cm2）照射供給液5 min。按“1.4.4 HPLC-UV 法測定阿替洛爾的濃度”項下測定樣品中藥物濃度。

1.4.7 體外透皮實驗 使用氨基甲酸乙酯（20%，w/v，5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，脫脊椎法處死大鼠后切除腹部皮膚，仔細清除皮下組織。使用生理鹽水清洗后，置于-80 ℃冰箱中備用。將準備好的皮膚固定于水平雙室擴散池之間，使角質層面對供給池。供給池中加入4 ml 供給液，其中非激光照射組和激光照射組為0.5 mg/ml載藥PEI-MoS2NPs溶液（藥物濃度為0.27 mg/ml），對照組為0.27 mg/ml的阿替洛爾水溶液。在第2、4、6、8 h 取樣2 ml 用于測定，并用相同體積的新鮮PBS 溶液替換。激光照射組于每個采樣點后使用激光（0.5 W/cm2）照射供給液5 min。按“1.4.4 HPLC-UV 法測定阿替洛爾的濃度”項下測定樣品中藥物濃度。

1.4.8 在體皮膚的組織刺激性 采用在體皮膚紅斑指數（erythema index，EI）實驗及蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）用于觀測給藥系統的皮膚刺激性。剃除家兔背部毛發，將皮膚分為4個面積為2.5 cm×2.5 cm 的區域，使用皮膚色素檢測儀測定初始皮膚紅斑指數（EI0）。使用10%（w/v）十二烷基硫酸鈉（SDS） 水溶液作為陽性對照。將500 μl 水、0.5 mg/ml PEI-MoS2NPs 溶液和10%SDS 溶液分別涂布于皮膚分區內，另一空白區與PEI-MoS2NPs 溶液區需使用0.5 W/cm2激光每2 h照射5 min。每2 h測量EIt值，通過以下公式計算ΔEI值：

測量后用棉簽清潔皮膚，將家兔處死后取皮，進行HE染色。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0 軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PEI-MoS2NPs 的表征 PEI-MoS2NPs 的平均直徑為（486±81.70） nm。PEI-MoS2NPs 的Zeta 電位為（-27.023±0.63）mV，與MoS2NPs 的Zeta 電位［（-14.64 ±1.72）mV］［13］相比，NPs電量增加，表明PEI 修飾后可增加NPs 的穩定性。使用紅外光譜、X 射線衍射、透射電鏡和掃描電鏡對PEI-MoS2NPs 的結構進行表征，結果見圖2。圖2A 顯示了PEI-MoS2NPs 的掃描電鏡圖片。MoS2納米片卷曲成不規則的花狀。樣品的透射電鏡結果（圖2B、2C）與掃描電鏡結果一致。PEI-MoS2NPs 的HREM 結果顯示樣品的晶型結構不明顯，說明樣品的結晶度不夠，這與下述X射線衍射的結果一致。PEI-MoS2NPs 的紅外光譜（圖2D）所示。1573 cm-1和881 cm-1處的峰為-NH的彎曲振動。1 051 cm-1和1 090 cm-1處為MoS2的特征峰。結果表明，PEI 成功地修飾在了MoS2表面。PEI-MoS2NPs 的X 射線衍射結果（圖2E）表明PEI-MoS2納米顆粒具有相對較低的結晶度，與MoS2六方晶相的晶體結構相匹配［14］，表明PEI對MoS2的結晶度有一定的影響，降低了結晶度，這與文獻中的結論［9］一致。

圖2 PEI-MoS2 NPs的表征

2.2 光熱轉換性能研究 通過測定不同濃度的PEIMoS2NPs 溶液在近紅外激光照射（0.5 W/cm2、5 min）下的溫度，探討PEI-MoS2NPs 的光熱特性。對照組（水）在近紅外激光照射后表現出小而緩慢的溫度上升，而PEI-MoS2NPs 溶液的溫度在激光照射期間迅速上升。當1.0 mg/ml NPs 溶液受到0.5 W/cm2的刺激時，溫度達到了71.5 ℃。見圖3。研究結果表明，溶液溫度與PEI-MoS2NPs 的濃度和激光密度成正比?？紤]到對皮膚的刺激，后續研究選取0.5 mg/ml的PEI-MoS2NPs溶液，激光強度0.5 W/cm2進行后續研究，使用該條件溶液溫度可升至64.8 ℃。此外，光熱循環實驗結果表明PEIMoS2NPs具有良好的光熱穩定性?？偟膩碚f，PEIMoS2NPs具有較好的光熱轉化能力。

圖3 PEI-MoS2 NPs的光熱轉化能力

2.3 載藥效率的測定 載藥效率隨著阿替洛爾濃度的增加而增加，當阿替洛爾與PEI-MoS2NPs 的比例為4∶1（w/w）時，載藥效率最高，可達到53.86%，見圖4A。

圖4 PEI-MoS2 NPs的載藥及釋放能力

2.4 體外藥物釋放實驗及體外透皮實驗 使用PEI-MoS2NPs 作為載體裝載阿替洛爾的釋放速度顯著慢于直接使用同濃度的阿替洛爾溶液（P＜0.05）；當PEI-MoS2NPs 未采用NIR 激光照射時，阿替洛爾在3 h 后釋放濃度增長沒有顯著差異（P＞0.05），8 h 累積釋放量為（364.64±31.67）μg/cm2。而NIR 照射組8 h 累積釋放量高達（572.11±37.99）μg/cm2，顯著增加1.56 倍（P＜0.05），表明近紅外光可作為載藥PEI-MoS2NPs 中藥物的釋放開關，見圖4B。NIR 照射組的8 h 累積皮膚透過量為（91.09±11.36）μg/cm2，是未進行光照組（59.98±7.14）μg/cm2的1.5 倍，且在8 h 內沒有出現劑量衰竭效應，而未經載藥的阿替洛爾溶液在3 h 后出現劑量衰竭效應，表明808 nm 激光控釋的PEI-MoS2NPs適用于TDDS，見圖4C。

2.5 在體皮膚的組織刺激性 與空白對照組比較，局部使用10% SDS 后，ΔEI 非常顯著增加（P＜0.01），表明家兔可對皮膚刺激物產生正常的反應；與空白對照組比較，PEI-MoS2組、NIR組ΔEI差異無統計學意義，見圖5?？瞻讓φ战M、NIR 組和PEI-MoS2NPs 組均可以看到清晰的皮膚結構，角質層的片層結構完整，各組未有顯著病理變化；而SDS 組角質層變薄，真皮層可見大量嗜酸性粒細胞，見圖6。在體皮膚紅色素指數實驗與HE 染色結果均表明PEI-MoS2NPs 和NIR 對皮膚無刺激性，具有高生物相容性。

圖5 在體皮膚紅色素指數實驗結果（n=3）

圖6 活體刺激后兔皮的HE染色結果（×80）

3 討論

聚合物修飾化無機納米材料是藥物遞送領域的研究熱點之一。本文通過靜電吸附作用，采用一步水熱合成法成功制備了PEI-MoS2NPs［15-16］。PEI 作為改良劑，常用以提高納米材料的溶解度，增加納米材料在藥物遞送中的應用［17-18］。本研究中PEI 修飾可以增加MoS2NPs 的帶電量，從而增加其在水溶液中的穩定性。X 射線衍射結果表明，與純MoS2相比，N 摻雜的PEI-MoS2NPs的（002）峰從14.11°移動到17.02°［19］。這可能與納米粒片層結構層間距變窄有關，由于PEI 的N 原子的半徑（0.80 ?）小于取代的S 原子（1.04 ?），N 進入MoS2的結構，從而導致片層間距減小。此外，傅里葉變換紅外光譜、掃描電鏡和透射電鏡表征結果表明，PEI 成功地修飾在了MoS2的表面，形成新型3D花狀PEI-MoS2NPs。

光刺激是常用的藥物釋放控釋開關之一，常用于按需給藥系統［20-21］。無機納米材料的光熱性能是一種很有前景的控釋特性。一般來說，光熱材料具有較高的光吸收率，光熱材料通過光照后，光能被吸收，會激發材料內部的電子或原子，使其處于高能態。這些高能態的電子或原子會與材料內部其他的原子或自由電子振動模式相互作用，通過這種能量傳遞和能級轉化從而將光能轉化成熱能。研究表明，MoS2在近紅外區域（808 nm）表現出強烈的吸收，MoS2的濃度和激光功率是影響轉換性能的重要因素［8，17］。本研究結果表明，PEI-MoS2NPs可以有效地將近紅外轉換為熱能而不損傷皮膚。皮膚溫度的增加也會增加藥物釋放和藥物經皮吸收。藥物釋放和皮膚滲透是藥物經皮吸收的2 個重要步驟，一般認為是被動擴散過程［22］。皮膚溫度升高可以增加藥物分子在角質層中細胞間脂質的擴散［23］。皮膚角質層由細胞間脂質和角質細胞組成，是大多數物質經皮吸收的天然屏障［24］。由于角質層的屏障功能，粒徑較大的PEI-MoS2NPs，不能以整體的形式跨過皮膚角質層，只能在制劑基質中起到調控藥物釋放的作用［25］。本研究開發基于PEI-MoS2NPs的NIR響應的藥物遞送系統，可通過激光照射的方式增加藥物從納米粒中的釋放，為按需給藥提供了新的思路。與單純使用藥物溶液相比，避免了劑量衰竭問題，可以延長給藥系統的作用時間，為提高患者的依從性提供了新思路。

此外，藥物裝載效率是影響給藥系統的另一個重要因素。盡管二維MoS2納米片具有出色的光熱性能，但較低的藥物裝載能力仍然限制了其在載藥系統的應用［10］。Yang 等［9］的研究表明具有較大表面積的三維MoS2NPs 表現出較高的藥物裝載能力。因此，本研究使用三維MoS2NPs作為TDDS平臺，以達到持續釋放阿替洛爾的需求。除了PEI-MoS2NPs 的三維花狀結構外，PEI 的-NH2也可能提供了阿替洛爾的結合位點。因此，PEI-MoS2NPs 表現出較高的藥物負載量，1 g PEI-MoS2NPs 可負載0.54 g 阿替洛爾，為開發新的可持續釋放的長效TDDS提供了可能性。

本研究合成了PEI-MoS2NPs，用于遞送β1-腎上腺素能受體阻滯劑阿替洛爾，PEI-MoS2NPs 能夠有效地結合阿替洛爾，實現約54%的藥物負載。NIR 刺激有效增強了藥物的釋放，并促進了藥物在皮膚中的滲透。將PEI-MoS2NPs 作為透皮遞送系統，為按需光控遞藥系統的開發提供了新的思路。此外，由于實驗條件所限，本文缺少在體研究和PEI-MoS2NPs 載藥機制研究，后續將進一步從孔隙變化、藥物與納米粒相互作用等角度評估這種新型材料在TDDS應用的潛力。