基于氣相色譜-質譜法測定塞來昔布中磺酸酯類基因毒性雜質的殘留量

趙晨陽，劉曉夢，邢亮彬，李亞麗，趙立新，艾連峰 ，哈婧

1.河北省藥品審評中心，石家莊 050091；2.河北科技大學化學與制藥工程學院，石家莊 050018；3.石家莊海關技術中心，石家莊 050051；4.河北醫科大學公共衛生學院，石家莊 050017

塞來昔布（celecoxib，CXB），化學名為4-［5-（4-甲苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基］苯磺酰胺，屬于解熱鎮痛抗炎藥-非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）［1］。作為一種高度選擇性的環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑［2］，塞來昔布幾乎沒有胃腸道不良反應［3-4］。因其具有抗炎鎮痛等作用，臨床上主要用于治療風濕性關節炎和骨關節炎等疾?。?-8］。

在塞來昔布的工藝合成和純化過程中，磺酸基團與醇類溶劑共存時有可能生成磺酸酯類基因毒性雜質（genotoxic impurity，GTI），如塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯（圖1）?；蚨拘噪s質是指能直接或間接損害DNA，導致基因突變或具有致癌傾向的物質［9-12］。在原料藥的生產過程中，所使用的起始物料以及中間體、試劑、溶劑、催化劑、反應中生成的副產物，還有在藥物合成和儲存過程中產生的降解產物都會造成基因毒性雜質的產生［9］。GTI 在低濃度下即可造成人體遺傳物質的損傷，具有致突變性和致癌性，在用藥過程中嚴重威脅到患者的健康［10，13-14］。因此，需要嚴格控制GTI 在藥物中的限度，建立準確可靠的分析檢測方法跟蹤檢測藥物的工藝過程，對于保障用藥安全具有重大意義。

圖1 塞來昔布及兩種雜質結構式Fig.1 Structural formulae for celecoxib and two impurities

本研究期望通過氣相色譜串聯質譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）法 建立測定塞來昔布原料藥及其制劑中塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯兩個磺酸酯類雜質含量的方法，為塞來昔布原料藥及其制劑中塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯的檢測提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 7697E+7890A+5975C（美國Agilent 公司）頂空氣相色譜質譜聯用儀；Vortex genie-2漩渦振蕩器（美國Scientific 公司）；XSE205DU 電子天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q 超純水制備儀（美國Millipore公司）。

塞來昔布原料藥（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：BR21062501、1039171101、1039171102、1039171103）；塞來昔布膠囊（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：06910；江蘇正大清江制藥有限公司，批號：210914；輝瑞制藥有限公司，批號：DT6150；青島百洋制藥有限公司，批號：211201611）；塞來昔布磺酸甲酯（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：BR26452801）；塞來昔布磺酸乙酯（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：BR26452801）；無水硫代硫酸鈉和碘化鈉均為分析純；乙腈（色譜級，美國Sunrise Chemical 公司）；超純水。

1.2 方法

1.2.1 溶劑的配制 按20∶80（體積比）的比例將水和乙腈混合配制稀釋劑，渦旋混勻，使用時現用現配。

衍生試劑的配制：精密稱取無水硫代硫酸鈉30 mg置于50 mL 棕色容量瓶中，加入適量超純水溶解。再稱取60 g 碘化鈉置于同一容量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度線，搖勻。

標準品儲備液的配制：精密稱取塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯標準品各10 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，加入80%乙腈水溶液溶解并定容至刻度線，搖勻，配成1 mg·mL-1的標準品儲備液。轉移至棕色標準溶液瓶中，放置于4 ℃冰箱避光保存。

標準品溶液的配制：使用時根據需要，將標準品儲備液用稀釋劑溶液配制成不同濃度的混合標準溶液，精密量取0.5 mL 置于20 mL 頂空瓶中，再加入0.5 mL 衍生試劑，迅速壓蓋密封，振搖混勻。

供試品溶液的制備：精密稱取供試品10 mg，置于20 mL 頂空瓶中，分別加入稀釋劑和衍生試劑各0.5 mL，立即壓蓋密封，搖勻。

加標供試品溶液的制備：稱取塞來昔布約10 mg，置于20 mL 頂空瓶中，分別加入所需濃度的標準品溶液和衍生試劑各0.5 mL，立即壓蓋密封，搖勻。

1.2.2 儀器條件 頂空條件：平衡溫度為60 ℃，平衡時間為30 min。

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent DB-624毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，1.4 μm），高純氦載氣，流速1.2 mL·min-1，進樣口溫度220 ℃，分流進樣方式，分流比為100：1，程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃·min-1升至80 ℃，再以20 ℃·min-1升至220 ℃，保持2 min，總運行時間為25.333 min。

質譜條件：四級桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，選擇離子監測采集模式，溶劑延遲2 min。塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯經衍生后得到的衍生產物分別為碘甲烷和碘乙烷。兩種目標物質的質譜參數如表1所示。

表1 2種目標物質質譜參數Table 1 Mass spectral parameters for two target substances

1.2.3 衍生試劑的選擇 為防止直接進樣易導致基質污染進樣口等問題，可采取衍生化技術提高磺酸酯類的靈敏度和穩定性［15-16］。本實驗分別考察了五氟苯硫酚和碘化鈉作為衍生試劑的效果。稱取12 份塞來昔布原料藥，分別置于20 mL 頂空瓶中，其中6 份加入所需濃度的混合標準品溶液和五氟苯硫酚衍生試劑各0.5 mL，另6 份加入所需濃度的混合標準品溶液和碘化鈉衍生試劑各0.5 mL，迅速壓蓋密封，搖勻。

1.2.4 平衡溫度的考察 本實驗分別考察了平衡溫度為30、40、50、60、70 和80 ℃時對測定結果的影響。將相同濃度的標準溶液經碘化鈉衍生后，分別在平衡溫度為30、40、50、60、70 和80 ℃的條件下上機測定，并記錄結果。

1.2.5 平衡時間的考察 本實驗分別考察了平衡時間為10、20、30、40 和50 min 時對測定結果的影響。將相同濃度的標準溶液經碘化鈉衍生后，分別在平衡時間為10、20、30、40 和50 min 的條件下上機測定，并記錄結果。

1.2.6 色譜柱的考察 本實驗分別考察了Agilent DB-624 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，1.4 μm）和Agilent HP-5 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，1.0 μm）對測定結果的影響。將兩個目標物質的標準溶液經碘化鈉衍生處理后，分別使用兩種色譜柱上機測定。

1.2.7 系統適應性 精密量取6 份混合標準工作液0.5 mL 分別置于20 mL 頂空瓶中，各自加入0.5 mL 衍生試劑，立即壓蓋密封，搖勻。按1.2.2小節條件頂空進樣，每份工作液進樣1針，記錄衍生產物碘甲烷和碘乙烷的保留時間、峰面積并計算RSD。

1.2.8 專屬性 分別配制空白試劑、混合標準限度對照溶液、樣品和加標樣品溶液按1.2.2 小節條件上機測定，記錄色譜圖。

1.2.9 基質效應與線性關系 本實驗以基質匹配標準溶液10、20、和50 ng·mL-13 個水平的響應值所對應質量濃度的純溶劑標準溶液的響應值進行比較考察基質效應。若基質效應在80%～120%，表明基質效應不明顯；若基質效應＜80% 或＞120%，表明存在基質抑制或基質增強。

分別配制濃度為10、20、50、100、200 和500 ng·mL-1的塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯混合標準工作液，各取0.5 mL 分別置于20 mL 頂空瓶中，各加0.5 mL NaI 衍生試劑，立即壓蓋密封，上機測定。分別以塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯的濃度為橫坐標（x），以塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯的衍生產物碘甲烷和碘乙烷的峰面積為縱坐標（y），建立標準曲線。

1.2.10 重復性 取6 份同一樣品，每份各加0.5 mL 10 ng·mL-1的混合標準工作液，再加0.5 mL衍生試劑，迅速壓蓋密封，置于頂空進樣器中，上機測定，記錄目標物質的檢測量。

1.2.11 中間精密度 在同一實驗室，由不同分析人員在不同時間進行中間精密度試驗，考察本方法在上述不同條件下對精密度的影響。取塞來昔布樣品，在定量限10 ng·mL-1做樣品加標回收實驗，平行處理6份。

1.2.12 穩定性 按1.2.1 小節條件分別配制樣品溶液、定量限濃度標準品溶液及含有定量限濃度的樣品加標溶液，分別在0、2、4、8、12 和24 h 時將各溶液按1.2.2小節條件測定2種目標物質的峰面積并計算RSD值。

1.2.13 耐用性 本實驗通過微調色譜條件來考察測得的兩個目標物質混合標準溶液濃度的變化，包括改變進樣口溫度（210、230 ℃）、流速（1.1、1.3 mL·min-1）和起始柱溫（35、45 ℃）。配制18 份濃度為20 ng·mL-1的樣品加標溶液，每個條件分別進樣3份，記錄結果。

1.2.14 準確度 稱取9 份塞來昔布原料藥分別置于20 mL 頂空瓶中，按1.2.1 條件方法制備得到低、中、高3 種不同加標水平的樣品加標溶液，濃度分別為10、20和50 ng·mL-1，每個濃度平行制備3 份，按1.2.2 條件上機測定并使用外標法計算目標物質的回收率。

1.2.15 樣品測定 將所有塞來昔布原料藥及其制劑按1.2.1條件方法制備，每批平行制備3份，按1.2.2條件方法上機測定。

2 結果與分析

2.1 衍生試劑的選擇

五氟苯硫酚作為衍生試劑時，兩個目標物質的回收率只有60%左右，而碘化鈉為衍生試劑時，兩個目標物質的回收率均大于80%。因此，本實驗選擇以碘化鈉為衍生試劑，對塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯進行衍生生成碘代烷后，經HS-GC-MS 法測定。衍生產物碘甲烷和碘乙烷的質譜圖如圖2 所示。由質譜圖可看出，衍生產物碘甲烷和碘乙烷的監測離子質荷比與分子量相同，且均有特征碎片離子127。

圖2 碘甲烷和碘乙烷質譜圖Fig.2 Mass spectra of iodomethane and iodoethane

2.2 平衡溫度的優化

本實驗分別考察了平衡溫度為30、40、50、60、70 和80 ℃時對測定結果的影響。結果如圖3所示，隨著平衡溫度的升高，測得目標物質的峰面積也越大。但當平衡溫度為70 ℃和80 ℃時，目標物質的峰面積反而降低。因此，本實驗選擇60 ℃作為平衡溫度進行試驗。

圖3 平衡溫度對測定的影響Fig.3 Effect of equilibrium temperature on determination

2.3 平衡時間的優化

本實驗分別探究了平衡時間為10、20、30、40和50 min 時對測定結果的影響。結果如圖4 所示，當平衡時間到達30 min時，目標物質的響應值達到最大，峰面積不再隨著平衡時間的延長而增大。因此，本研究選擇30 min 作為頂空進樣的平衡時間。

圖4 平衡時間對測定的影響Fig.4 Effect of equilibration time on determination

2.4 色譜柱的選擇

本實驗分別考察了Agilent DB-624 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，1.4 μm）和Agilent HP-5 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，1.0 μm）對測定結果的影響。結果發現，衍生產物碘甲烷和碘乙烷在DB-624 毛細管色譜柱上保留較好，且兩目標物質之間、兩目標物質與溶劑峰之間的分離度均＞1.5，表明分離效果好。因此，本研究選擇Agilent DB-624 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，1.4 μm）進行實驗。

2.5 系統適應性

在1.2.2 儀器測定條件下，兩目標物質保留時間的RSD 分別為0.02%和0.05%（≤2%），峰面積的RSD 分別為4.91%和8.54%（≤10%），均符合要求，表明該方法系統適應性良好。

2.6 專屬性試驗

專屬性的實驗結果如圖5 所示，衍生產物碘甲烷和碘乙烷的保留時間分別為8.43 和12.83 min，空白溶劑和樣品溶液中不存在對目標物質造成干擾的干擾峰，空白溶劑峰也與目標峰完全分離，不干擾碘甲烷的檢測，表明該方法專屬性良好。

圖5 專屬性色譜圖Fig.5 Proprietary chromatograms

2.7 基質效應和線性關系

基質效應的結果如圖6 所示，本實驗的基質效應在80%～120%，表明基質效應基本不存在。

圖6 基質效應Fig.6 Matrix effect

線性結果如表2 所示，塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯均在10～500 ng·mL-1范圍內線性關系良好。采用逐級稀釋，以信噪比S/N≥10 的最低濃度作為定量限。按上述條件，測得兩個雜質的定量限均為10 ng·mL-1。

表2 2種目標物質的線性結果Table 2 Linear results for two target substances

2.8 重復性試驗

6 份樣品加標溶液中塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯檢測量的RSD 分別為8.60%和5.42%（≤10%），表明該方法重復性良好。

2.9 中間精密度試驗

6 份樣品加標溶液中塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯檢測量的RSD 分別為7.18%和8.95%（≤10%），表明該方法精密度良好。

2.10 穩定性試驗

穩定性結果如表3 所示，標準品溶液和樣品加標溶液在24 h 內峰面積的RSD 均小于10%，樣品溶液中未檢出，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

表3 2種目標物質的穩定性試驗結果Table 3 Stability test results for two target substances

2.11 耐用性試驗

耐用性結果見表4 所示，兩個雜質在不同條件下測得濃度的RSD 均小于10%，表明該方法耐用性良好。

表4 耐用性試驗結果 (n=3)Table 4 Durability test results (n=3)

2.12 準確度試驗

準確度結果見表5 所示，兩雜質低、中、高3 種加標水平的回收率均在80.87%～106.52%，RSD 均小于10%，表明該方法的準確度良好。

表5 準確度試驗結果 (n=3)Table 5 Accuracy test results (n=3)

2.13 樣品測定

樣品的測定結果顯示，所有塞來昔布樣品中均未檢出塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯雜質。

3 討論

本研究開始時采用的進樣方式為直接進樣，但是發現兩個目標物質均沒有出峰，推測可能是直接進樣導致塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯在進樣口發生了高溫分解，從而對實驗造成了干擾［17］，因此采用頂空進樣來進行試驗。與直接進樣相比，頂空進樣不需要復雜的前處理步驟，不存在高濃度的樣品污染進樣口等問題［18］。

歐洲藥典（European Pharmacopoeia，EP）［19］中經過碘化鈉衍生后，采用頂空GC-MS 法檢測幾種原料藥中磺酸酯類基因毒性雜質。本試驗經過比較，最終選擇了碘化鈉作為衍生試劑，該方法操作簡便、干擾小、通適性強。

在不同結構的基因毒性雜質中，每人可接受限度“毒理學關注閾值”（threshold of toxicological concern，TTC）為1.5 μg·d-1［20-22］?；蚨拘噪s質的結構相似時，可能具有相同的作用模式，因此該類基因毒性雜質的總量應小于1.5 μg·d-1。塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯的結構相似，所以兩者的TTC 均應小于0.75 μg·d-1。塞來昔布的最大日服用量為600 mg，因此，塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯的限度為1.25 μg·g-1。在本實驗條件下，兩雜質的標準限度對照溶液應不超過12.5 ng·mL-1。因此，本實驗制定的標準限度對照溶液濃度為10 ng·mL-1，可滿足塞來昔布中塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯1.25 μg·g-1的靈敏度。

本研究采用衍生化技術與GC-MS 法相結合測定塞來昔布中的塞來昔布磺酸甲酯和塞來昔布磺酸乙酯，并將該方法成功運用于實際樣品。在實驗過程中，該方法的線性范圍、定量限和準確度均可滿足實際檢測需要。以頂空進樣，避免了高濃度的樣品污染進樣口等問題，且前處理方便快捷、重現性好，可為藥品監督管理部門修訂塞來昔布原料藥及制劑質量標準提供借鑒，使塞來昔布原料藥及制劑質量標準更符合實際。目前，基因毒性雜質問題頻發，磺酸酯類基因毒性雜質相關分析的研究也有一定的進展，但也存在一定的缺陷，如測定的磺酸酯類基因毒性雜質較為單一。因此，未來需要將更多的磺酸酯類基因毒性雜質列入未來的研究計劃中。