生物檢測試劑保藏技術研究進展

劉瑩瑩，趙可心，王藝霏，路凱旋，胡孔新

中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176

1983 年，Mullis 發明了聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，通過酶促反應實現了核酸的體外擴增［1-2］，解決了許多分子生物學研究的難題，極大地推動了分子生物學以及生物技術產業的發展，成為分子生物學與醫學的支撐技術。1992 年，日本科學家Higuchi 將熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）加入PCR 體系中實時監測核酸含量變化，發展出了定量PCR（quantitative PCR，qPCR）［3］。專門針對特定靶序列設計的熒光探針可以通過特異性雜交信號檢測PCR 產物，提高了靶核酸檢測的特異性［4-6］，使得qPCR 被廣泛應用并成為實驗室核酸檢測的常規技術。當時PCR 所用的DNA 聚合酶不耐高溫，每次溫度循環后都面臨聚合酶失活需要重新補充的問題。核酸檢測試劑盒中酶的性能對檢測效果有決定性作用，生物檢測試劑生產和保藏條件不當導致DNA 聚合酶或者逆轉錄酶失活、引物探針溶解后降解等問題導致實驗成功率低。因此，維持生物檢測試劑的活性使其便于保藏與運輸對檢測結果的成功與否至關重要，這仍然是科研人員亟待解決的難題。然而核酸檢測技術發展至今，其在分子生物學實驗室及以外諸多場景的使用仍然受限于以液態形式存儲的生物檢測試劑。近年來，隨著臨床醫學及生物診斷試劑的發展，研究人員探索了多個科學領域開發了一系列利于生物檢測試劑保藏的技術。本文將對生物檢測試劑目前常用的保藏技術，如低溫保藏技術、真空冷凍干燥技術、噴霧干燥技術和玻璃化冷凍技術進行綜述，以期為后續開展相關工作提供科學指導。

1 低溫保藏技術

生物檢測試劑主要包括引物、探針、三磷酸脫氧核苷酸（deoxynucleotide triphosphates，dNTPs）、DNA 聚合酶、逆轉錄酶、Mg2+等。一般合成的引物為干粉，DNA 從有機溶劑中干燥出來，無菌、無核酸酶，可以室溫或-20 ℃密閉長期保存，而溶解后的DNA 應保存在-20 ℃。TaqMan 探針需避光保存，避免熒光基團降解，干粉可在-80 ℃保存一年以上，稀釋成液體后可保存在-20 ℃，應防止反復凍融。dNTP 由dATP、dCTP、dGTP 和dTTP 4 個基本核苷酸組成，是新DNA 鏈的組成元件及PCR 反應必需的組分，在常見的PCR 應用中，各種dNTP的常用終濃度通常為0.2 mmol·L-1，一般在-20 ℃保存。DNA 聚合酶、逆轉錄酶等酶制劑均為催化特定反應的蛋白質，具有生物活性，屬于生物熱敏性物質，高溫條件下容易失活，一般-20 ℃保存。在應用過程中酶有液體和固體兩種形式，其中液體酶制劑穩定性較差，保藏周期短，其活性受金屬離子濃度、pH、溫度等影響。酶促反應發生時隨著反應體系溫度的升高，底物分子的熱運動加快，分子碰撞的機會增加，會提高酶促反應速率；但當溫度升高達到一定臨界值時，溫度的升高可使酶變性，導致酶促反應速率下降。

一般科學研究常用的商品化生物檢測試劑盒放置在-20 ℃可保藏1年左右，且大部分試劑盒注明了反復凍融次數。生物檢測試劑中的生物活性物質包括逆轉錄酶、DNA 聚合酶等必須依賴低溫冰箱進行保藏。楊鎮州等［7］的實驗結果表明酶的儲存溫度為-20 ℃，可以保存6 個月以上，在37 ℃保藏條件下，隨著時間的延長酶活性不斷下降。生物檢測試劑中的酶等試劑經過較長時間的高溫運輸或者暴露于較高溫環境下，均有可能導致實驗結果出現假陰性等不良后果，或者實驗操作人員在保藏試劑過程中將其反復凍融也會導致較大實驗誤差［8］。因此，需保證試劑低溫保藏運輸以保證酶的活性。

2 真空冷凍干燥技術

鑒于低溫保藏在運輸與操作方面的不便性，常溫保藏的方法應運而生。想要維持qPCR 等生物檢測試劑在常溫保藏和運輸中的生物活性，則需要去除其中的水分，以減少生物檢測試劑各反應組分在保藏過程中可能發生的一系列物理、化學變性和降解反應等［9-10］。目前，有2 種方式可以將生物檢測試劑中的水分去除，一種是針對一般非生物活性試劑的干燥處理，多采用加熱的方式使液態水汽化成水蒸氣而去除［11］，然而加熱過程可能導致生物檢測試劑中的一些生物活性物質失活；另一種是真空冷凍干燥技術（以下簡稱“凍干”），它將液態的生物檢測試劑先冷凍，進而將生物檢測試劑置于密閉環境中，在近真空條件下將液態水升華成氣態水而去除［12］。對于真空冷凍干燥技術而言，首先，需要將生物檢測試劑進行預凍處理，如放置在低溫冰箱，使溶液中的自由水預先冷凍到固態［13］；其次是升華干燥，在真空條件下將生物檢測試劑中的固態水通過升華去除，是凍干過程中水分去除的主要階段，升華干燥速率會通過影響水蒸氣逸出的快慢進而影響生物檢測試劑的內部結構［14］，升華干燥完成后仍然會存在10%左右的水分殘留，殘留水分中包括自由水和結合水［15］；最后是解析干燥，在真空條件下通過解析去除升華干燥未能去除的水分，而結合水的解析干燥需要較高的能量和推動力，本階段設置的溫度在不影響試劑的情況下需盡可能高，真空度盡可能低，解析完成后試劑中可能仍存在1%左右的殘留水分［16］。真空冷凍干燥方式由于整個過程均在低溫下進行，最大程度地降低了對酶等熱敏性生物活性物質的損害，因此應用范圍十分廣泛。

張建中［17］利用真空冷凍干燥技術將核酸檢測試劑中的引物、探針、酶試劑、dNTPs 和緩沖液預混裝進行冷凍干燥處理，研究表明凍干檢測試劑在20 ℃密封保藏條件下，其檢測性能與未凍干液態檢測試劑無明顯差異。侯月娥等［18］為了提高草魚呼腸孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）熒光定量RT-PCR 試劑耐保存且便于運輸等性能，將配制好的全預混草魚呼腸孤病毒Ⅱ型檢測試劑-80 ℃放置3 h，然后利用Triad真空冷凍干燥器設置-35 ℃ 3 h，-20 ℃ 1 h，-15 ℃ 1 h，0 ℃ 3 h，25 ℃1 h的冷凍程序，優化試劑配制方案后成功研制出了全預混草魚呼腸孤病毒Ⅱ型一步法凍干檢測試劑，該凍干試劑4 ℃可保存12 個月，室溫25 ℃可保存3 個月，37 ℃可保存15 d，實現了凍干檢測試劑的常溫運輸和短時間保存。Klatser等［19］對分枝桿菌核酸檢測試劑預混液進行了冷凍干燥處理，發現經過1 年的4 ℃或20 ℃保存，或者3 個月的37 ℃保存后，試劑仍然能夠保持較高的活性。同樣地，Tomlinson 等［20］通過對橡樹猝死病核酸檢測試劑進行冷凍干燥處理，實現了該病菌的田間快速檢測，并證實在室溫下保存20 周后，凍干試劑的活性仍然能夠保持較高水平。Takekawa 團隊利用美國Idaho科技公司的核酸檢測凍干試劑，成功實現了在偏遠地區對野生鳥類禽流感病毒進行現場快速檢測的目標，并建立了一種方便可靠的野外禽流感預警監測方法［21-22］。上述核酸擴增試劑的常溫保存方式均采用了真空冷凍干燥技術，顯示出該方法適用于對熱敏性生物活性物質進行脫水處理的優點。

目前，真空冷凍干燥技術在生物制藥方面也得到了較廣泛的應用，大大提升了制藥的效率［23］。同時，在疫苗研發與生產中也發揮了重要作用。鄭波等［24］改進了水痘減毒活疫苗的冷凝分裝工藝，并成功制備了穩定一致的冷凝疫苗；韋曉玲等［25］通過重組慢病毒載體凍干，成功制備了無需冷凍保存的病毒基因載體；Hassett 等［26］研發的乳頭狀瘤病毒凍干粉末疫苗能夠實現與市面上的人乳頭狀瘤病毒疫苗Cervarix?相同的免疫原性，實現了該疫苗的常溫儲存和運輸。真空冷凍干燥技術優勢在于可使生物檢測試劑等產品的質量穩定，精確控制低加工溫度可最大限度地降低產品固有特性的風險，例如共晶熔化或超過玻璃化轉變溫度，從而使凍干試劑加工成較高質量的產品。然而，真空冷凍干燥技術也存在一些不足之處，比如生物檢測試劑凍干過程中擴增性能下降，凍干試劑的失活主要是酶試劑在凍干過程中失活導致的，需要添加海藻糖、蔗糖或葡聚糖等凍干保護劑來維持其生物活性，保護劑的篩選與驗證對于凍干試劑的檢測性能也至關重要；其次，試劑脫水后只會殘留較少的有效物質，呈粉末狀，轉移困難，因此凍干過程中可能還會適當添加賦形劑，包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或山梨醇等，然而賦形劑對預混裝試劑檢測性能的影響需進一步驗證。

3 噴霧干燥技術

噴霧干燥技術的原理是通過霧化器的霧化作用，將液體分散為細小的顆粒，霧滴在干燥的熱介質空間中蒸發水分從而得到干粉物質，大致可分為3個步驟：①霧化，主要用霧化器霧化液料形成微小霧滴；②干燥，霧滴與熱空氣直接接觸迅速蒸發干燥；③分離，分離和收集干燥顆粒［27］。目前，常用的霧化器一般分為壓力式噴霧器、氣流式噴霧器、離心式噴霧器等類型。噴霧干燥技術的主要特點［28-29］包括以下幾個方面。①霧化后，霧滴體積顯著增大，霧滴與高溫空氣接觸的瞬間可達到90%～95%以上的水分蒸發。根據設備差異，干燥時間可在5～30 s內，物料迅速干燥，不受高溫影響。②適用于熱敏性物料的干燥方法為：在進行噴霧干燥時，對于熱敏感性物料來說，需要特別注意物料的處理方式。物料與熱空氣直接接觸，但多數熱量用于蒸發水分，物料溫度不會超過高溫空氣濕球溫度，也不會受高溫空氣的影響，無損質量品質。③應用于從高級合成物到化學品的生產。采用噴霧干燥技術，應用于料液固含量在0～60%含固物料的干燥過程，并可以通過調整工藝參數，高效生產出滿足粉末顆粒大小、形狀、密度、分散性、多態性以及流動性等精準特性的高質量粉末。

目前，生化醫療領域產品加工行業常用的真空冷凍干燥法會導致生物材料孔層塌陷，從而影響其理化結構。而噴霧干燥法可避免物料孔層塌陷，但現有的噴霧干燥技術的干燥溫度對生物檢測試劑活性會造成影響，高溫噴霧法及亞高溫噴霧法溫度均大于60 ℃，常溫噴霧法進口溫度為0～60 ℃［30］。由于常溫噴霧法存在干燥動力小除濕難度大的問題，噴霧干燥技術在生物檢測試劑保藏方面可結合冷凍干燥，從而降低干燥試劑所消耗的能耗。因此，除傳統的噴霧干燥技術外，針對不同領域近年來還出現了節能噴霧、冷凍噴霧、納米噴霧和過熱蒸汽噴霧等新型噴霧干燥技術。其中，噴霧冷凍干燥技術（spray-freeze drying，SFD）是近年發展起來的微粉化新技術，實現了真空冷凍干燥技術和噴霧干燥技術的結合，發展成為適用于蛋白質和肽類等性質不穩定成分的微粉化技術，縮短了冷凍和干燥時間，可獲得孔隙率高、生物活性高的粉末產品，在食品、醫藥等領域有廣泛的應用。Zhang等［31］利用噴霧冷凍干燥技術生產全脂奶粉，有效地縮短了干燥時間，獲得了高孔結構的奶粉粉體。車馨子等［32］使用噴霧冷凍干燥技術獲得了粒徑集中分布在117.13～200.06 μm的魚油微膠囊顆粒，將其與傳統噴霧干燥制備的魚油微膠囊產品對比，發現噴霧冷凍干燥技術制備的魚油微膠囊質量更優。

噴霧冷凍干燥技術在醫藥領域經常被應用于藥物研究33］。Poursina 等［34］利用噴霧冷凍干燥技術研制出了用于治療骨質疏松癥的激素類藥物——鮭魚降鈣素。肖安風等［35］利用噴霧干燥技術優化的工藝制備柚苷酶固體酶制劑，所得酶制劑中α-L-鼠李糖苷酶活力達19 000 U·g-1，酶活總回收率為78.1%；柚苷酶的活力達4 700 U·g-1，酶活總回收率為28.3%；酶制劑含水量6.5%。張琪等［36］利用噴霧干燥技術制備固態植酸酶制劑，結果發現植酸酶的酶活回收率可達80%。噴霧干燥技術是酶制劑干燥領域應用最廣泛的技術之一［37］。采用噴霧冷凍干燥技術可生產出生物活性高、可溶性好、粒徑可控的諸多產品，因此其在醫藥領域有廣泛的應用。但噴霧干燥技術也存在一些不足之處，主要包括能耗高、設備昂貴且體積大、結構復雜、操作不靈活、易粘壁等。后續可開展該技術對DNA 聚合酶和逆轉錄酶生物活性影響的研究，為生物檢測試劑保藏提供思路。

4 玻璃化冷凍技術

目前對于一些生物制品，例如疫苗、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及生物酶等試劑，多以溶液形式生產，然而這些試劑在常溫條件下極易發生蛋白質的快速降解導致其生物活性大大降低。真空冷凍干燥技術的凍干過程中試劑需承受各種各樣的應力，這些應力常常直接或間接導致蛋白質活性不穩定［38］。玻璃化冷凍技術中的玻璃化是指在一定的降溫速率下液態物質直接轉變為玻璃化固體狀態的過程，期間沒有晶體結構的生成，也能夠保持液相時期的分子以及離子的分布，在冷凍和解凍的過程中也不會在液態和晶體之間來回變化，這時所表現出的力學性質與玻璃相似，故稱這種狀態為玻璃態，是一種介于液態與固態之間的狀態。發生玻璃化轉變時所對應的溫度稱之為玻璃化轉變溫度（glass transition temperature，Tg）。保持制品的玻璃態需儲存在低于或等于該物質的Tg，若制品的Tg 高于室溫，則有希望實現室溫下較長時間的穩定保存。

1984年，Fathy等［39］提出了玻璃化冷凍技術，是一種將物質轉變成玻璃樣無定形體的技術。1985年，Rall 等［40］首次玻璃化冷凍胚胎細胞獲得成功，這引起了人們對該技術的極大興趣。在蛋白質的生物藥物領域，利用玻璃化冷凍技術延長藥品的貯存時間，達到了非冷鏈條件下穩定保藏的目的。Levine［41］應用玻璃化冷凍技術，加入海藻糖等保護劑生產的疫苗能夠在極端溫度下保藏。Ohtake等［42］使用海藻糖等凍干保護劑、蛋氨酸和明膠等，利用玻璃化冷凍技術成功研制出了熱穩定的減毒活沙門氏菌Ty21a細菌疫苗，該疫苗在37 ℃條件下能夠穩定儲存約12周。該技術不僅提高了活Ty21a 疫苗的溫度穩定性，而且增強了產品的免疫原性，有效延長了疫苗的保質期，實現了常溫條件疫苗的儲存和運輸，為不發達地區使用疫苗提供了極大地便利。此外，生物檢測試劑中的生物酶一般是與甘油按照一定比例混合后在低溫條件下保藏，應用玻璃化冷凍技術也可改善酶試劑的保藏條件。Treml 等［43］使用Ficoll400 和松三糖等試劑成功研制了玻璃化的限制性內切酶，該酶可在室溫或37 ℃條件下穩定保藏4 個月；并且成功研制了克隆小鼠白血病病毒逆轉錄酶與Klenow酶，可在室溫條件下保藏，并在30 s 內復溶于水，研究表明其Tg 至少為40 ℃（45 ℃為最佳）才能保證制品在室溫下的穩定性。Tonnis 等［35］利用玻璃化冷凍技術，以海藻糖作為保護劑，研制的乳酸鹽脫氫酶可在60 ℃條件下穩定保藏4周。玻璃化冷凍技術在玻璃化期間也需要添加海藻糖等凍干保護劑以防止酶結構的劇烈變化，維持生物制品的高活性，延長其穩定的保藏時間，降低了冷鏈保藏及運輸條件下產生的經濟成本。該技術目前在細胞與胚胎、組織和器官中的應用也較多。例如，Zhao 等［44］利用玻璃化冷凍技術對人體大型卵巢組織進行玻璃化冷凍，對處理后的組織進行形態學分析、凋亡檢測以及使用免疫組織化學方法來檢測解凍后的卵泡活性，結果發現玻璃化組與程序冷凍組兩組加工工藝處理條件下，解凍后原始卵泡比例與正常形態比較無統計學差異，兩組卵泡凋亡率無差異，且玻璃化組間質細胞凋亡率低于程序冷凍組。玻璃化冷凍技術具有操作步驟簡便、儲存穩定性好、復蘇率高等優勢。此外，在低毒性的保護劑濃度和較高降溫速度的前提下優化玻璃化制品的Tg，即可實現制品的常溫儲存，這對于玻璃化冷凍技術的進一步發展和應用具有重要意義。

目前，大部分生物檢測試劑仍需依賴專門的冷鏈運輸，其設備復雜、成本高昂、運輸耗時，對于交通落后地區的運輸難以實現空運。若遇上重大緊急疫情爆發，極有可能會因為冷鏈運輸資源緊張、運輸費時或疫區交通不便而導致試劑供應不及時。冷凍保藏作為一項重要的手段，在生物、醫學領域對生物檢測試劑、細胞或組織等的保藏中仍發揮著重要的作用（4 種不同技術比較詳見表1）。因此，選擇一套合適的保藏技術手段，對于試劑的運輸、維持活性物質的生物活性，保證檢測質量及穩定性具有重要意義。

表1 4種不同技術在生物檢測試劑應用研究中的對比Table 1 Comparison of four different technologies in the application research of biological detection reagents

5 展望

隨著分子生物學檢測技術應用越來越廣泛，試劑保藏問題備受關注，真空冷凍干燥技術、噴霧冷凍干燥技術和玻璃化冷凍技術等試劑保藏技術應運而生，實現了生物檢測試劑的常溫穩定保存，解決了生物檢測試劑低溫儲存和運輸的限制。冷凍干燥過程中冷凍階段、干燥階段以及凍干后的試劑保藏過程相對復雜。其中，冷凍階段冰-水界面形成、速凍等均可能會導致蛋白質變性/降解反應增加［45-47］，不可避免地會對生物檢測試劑中部分生物活性物質造成損傷［48］。此外，干燥階段可能會導致酶等蛋白質周圍水分去除后天然構象發生變化，進而影響其生物活性。

生物檢測試劑中的DNA 聚合酶可耐高溫，具有高度熱穩定性，而凍干后穩定性較易維持；逆轉錄酶不耐受高溫、穩定性較差［49-50］，凍干后維持長期保藏的難度較大。此外，生物檢測試劑中的引物、探針為寡核苷酸片段，保藏不當會導致其降解。目前，引物/探針凍干粉形式的生產工藝已相對成熟，廣泛應用于實驗室科研和臨床診斷中，大部分商品化的核酸提取試劑盒（磁珠法）中也使用了可常溫保藏凍干粉形式的蛋白酶K，避免了酶在長時間的高溫運輸或者由于操作/保藏不當暴露于較高溫度環境下可能造成實驗結果出現假陰性等不良后果。

商品化的DNA 聚合酶/逆轉錄酶一般需要添加甘油后在-20 ℃低溫保藏，運輸過程依賴冷鏈運輸。目前，核酸檢測試劑多數為酶混合液與核酸擴增反應液分開包裝，部分商品化試劑盒以一管式預混液，均以液體形式存在，無法實現常溫保藏及運輸。而且低溫-20 ℃保藏條件下除酶以外多為冷凍固態，實驗過程中需解凍，但試劑的配制較為復雜繁瑣，實驗人員操作不當極易引起試劑漏加、交叉污染等情況，因此正規的核酸檢測實驗室會設置分區由專業人員進行實驗操作。此外，各反應組分尤其是引物、探針和酶用量較少，對移液器的精準度要求高［51］，且試劑配制完成后需將其混勻或借助離心機回收吸附在管壁上的液體。目前，盡管有一些商品化的生物檢測試劑以混合形式存儲在一個反應管中，稱為“預混裝”，以簡化操作，但是這種儲存方式并不是每個反應組分的最佳儲存環境，其性能和穩定性也會受到一定程度的影響［52］。例如，保存在“預混裝”試劑中的酶可能會因失去甘油的保護而變性失活或降解。引物和探針可能會因稀釋而導致在儲存過程中降解速度高于原本高濃度的“母液”形式。此外，“預混裝”中包含了除了核酸模板以外qPCR 所需的全部成分，可能會引起無模板情況下的非特異性擴增反應。為了最大程度地維持酶的生物活性，備選的方法是將PCR 試劑與酶分開儲存，使用“半預混裝”的方式。除了酶以外的PCR 試劑并不能在最優的條件下保存，因此它們的活性仍然受到一定程度的影響。在操作過程中，雖然試劑添加步驟相對減少，但操作者仍然需要將酶與“半預混裝”試劑混合在一起，而且酶的用量非常少，因此還是需要依賴精確的移液器進行操作。同時，混合之后，仍然需要混勻處理。由此可知，當前生物檢測試劑的保藏技術大部分為低溫儲藏，低溫保藏條件下，液態生物檢測試劑實驗過程中需要考慮人員的專業性和嚴謹性，且操作步驟較為復雜，一定程度上限制了核酸檢測技術的發展以及在非實驗室檢測環境開展檢測活動。

如果要解決上述問題，我們需要尋找一種方法，可以讓生物檢測試劑以“預混裝”的形式常溫下長期保存，并且不影響其原有的活性。例如真空冷凍干燥技術較多應用于生物檢測試劑保藏，在凍干之前，試劑會被預先混合，并精確地分裝成單次所需用量，去除水分以減少對活性的影響，常溫下仍然能夠維持其原有活性。操作過程中，實驗人員只需加入適量的無酶無菌水對其進行復溶即可，無需特殊的儀器操作，降低了對人員專業素質和設備的要求，推動了新一代保藏技術的發展，為后續生物檢測試劑實現長時間常溫保藏提供了可能。