離子交聯海藻酸鹽水凝膠在細胞培養和冷凍保存中的研究

李其燁 王世革 劉寶林

(1 上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093;2 上海理工大學材料與化學學院 上海 200093)

隨著再生醫學和細胞治療的快速發展,細胞的需求不斷增加,細胞培養、儲存和運輸面臨越來越多的挑戰。傳統的細胞低溫保存方法是慢速冷凍和玻璃化。慢速冷凍方法通常是將細胞浸入冷凍保護劑中,通過程序降溫設備設定程序降溫至-80 ℃,然后將它們置于液氮中長期儲存。在玻璃化保存中,細胞通常浸入較高濃度的冷凍保護劑中,并用導熱系數較高的材料(如塑料麥管)封裝,直接將細胞浸入液氮中儲存。但高濃度保護劑對細胞的毒性顯著。例如,在細胞治療中,二甲基亞砜(DMSO)保存的細胞移植入患者體內造成嚴重不良反應[1-2]。因此,有必要尋找新的冷凍保存方法來降低保護劑的濃度。

近年來,海藻酸鹽水凝膠作為高生物相容性的材料已被廣泛應用于細胞3D培養[3-4]和冷凍中。細胞微囊化后可以保護它們免受外部環境的影響,并允許氧氣和營養物質的輸送[5-6]。例如,C. A. Amorim等[7]的研究表明,海藻酸鈣水凝膠能夠增加顆粒細胞的聯系,并且可能適用于竇前卵泡的體外培養。在另一項研究中,M. M. Capeling等[8]證明海藻酸鈣水凝膠可以支持人體腸道器官的體外生長并使其上皮分化。M. Matyash等[9]發現海藻酸鈣水凝膠可為神經細胞提供機械支持并增加其生長能力。T. Patra等[10]發現經過海藻酸鈣凝膠包封后,玻璃化組細胞的存活率顯著高于包封的慢速冷凍組,包封在較小直徑微膠囊中的細胞增殖速率大于包封在較大微膠囊中的細胞。此外,許多研究表明,細胞的微囊化可以顯著提高冷凍保存后的存活率。例如,Yao J.等[11]通過海藻酸鈣凝膠微囊化紅細胞,并使用0.7 mol/L海藻糖作為冷凍保護劑進行冷凍保存,結果表明微囊化后紅細胞的存活率明顯高于未微囊化的細胞。在另一項研究中,Huang Haishui等[12]將小鼠胚胎干細胞和人間充質干細胞封裝在海藻酸鈣水凝膠中,并成功實現了用更低濃度的保護劑冷凍保存細胞。結果發現,海藻酸鹽微膠囊外的溶液可以優先玻璃化,從而減緩冰晶對微膠囊內細胞的損傷。S. Saberianpour等[13]使用海藻酸鹽-明膠微球對人骨髓間充質包封并用含有10% DMSO的冷凍保護劑凍存后發現微囊化的細胞可減少凍融損傷。Li C.等[14]的研究認為細胞微膠囊化可以顯著抑制細胞膜上過大的氣泡,減少細胞在加入低溫保護劑時對細胞的滲透損傷,從而提高細胞在冷凍保存過程中的存活率。

水凝膠可以使用靜電噴霧法、乳化法和微流體方法制備[10]。Lu Y. C. 等[15]采用雙流體電噴霧法制備了具有核殼結構的海藻酸鈣水凝膠包埋類器官,冷凍后獲得比包埋在基質膠中更高的細胞存活率。S. Sivan等[16]通過乳化法制備了小尺寸海藻酸鈣微膠囊包封人骨髓間充質干細胞,在體外長時間保持細胞活性。Liu Yingzhe等[17]用微流控裝置合成了高度球形的海藻酸鈣水凝膠,該方法制備過程具有靈活性的優點,并發現CaCl2乳液在海藻酸鈉液滴周圍均勻的空間分布對于獲得高度球形水凝膠至關重要。海藻酸鹽通常與堿金屬離子如Ca2+、Ba2+[18]、Sr2+[19]交聯形成水凝膠。在這些離子中,Ca2+具有較好的生物相容性,而Ba2+和Sr2+具有輕微毒性,只能使用低濃度進行細胞包埋[20]。三價離子(如Al3+、Fe3+)也可以與藻酸鹽交聯形成凝膠。Yang C. H. 等[21]發現與三價陽離子交聯的水凝膠的機械性能明顯優于二價陽離子。

與傳統方法不同,本文采用低成本、易得、操作簡單的空氣噴涂裝置制備海藻酸鈣和海藻酸鐵水凝膠,包封了HEK293T細胞和HepG2細胞,研究了交聯過程對細胞存活影響,并成功實現了海藻酸鈣水凝膠包埋細胞的體外培養,還研究了細胞包封后冷凍保存的存活率。最后,發現冷凍保存后包封細胞的存活率明顯高于未包封的細胞。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

DMSO購自北京索萊寶科技有限公司。海藻酸鈉、海藻糖(Tre)、檸檬酸鈉二水合物、無水氯化鈣、六水合三氯化鐵、D-甘露醇、HEPES粉(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)購自上海麥克林生化科技有限公司。DMEM高糖培養基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)、乙二醇(Eg)、丙二醇(Pg)購自國藥集團化學試劑有限公司。青霉素-鏈霉素、T25 細胞培養瓶、T75 細胞培養瓶、15 mL離心管和 50 mL離心管購自Gibco(美國)。磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。吖啶橙/碘化丙啶雙染試劑(AO/PI)購自Nexcelom(美國波士頓)。250 μL 塑料麥管購自富士平工業株式會社(日本)。0.22 μm無菌濾頭購自蘭杰柯科技有限公司,HEK293T細胞和HepG2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 溶液配置

將甘露醇溶于去離子水中,制得0.25 mol/L溶液。DMEM完全培養基含有10%或20%的FBS和1%的青霉素-鏈霉素。通過將海藻酸鈉粉末溶解于甘露醇中配置海藻酸鈉溶液(1%、1.5%、2%、3%,質量分數)。通過將FeCl3·6H2O溶解在HEPES緩沖液中制備了FeCl3·6H2O溶液(0.5%、1%、2%,質量分數),將CaCl2溶解在HEPES緩沖液中制備了CaCl2溶液(0.2 mol/L)。在含有10% FBS的DMEM中制備了檸檬酸鈉溶液(0.06 mol/L)。在含20% FBS的DMEM中制備了兩種冷凍保護劑,cpa-1:Eg(1.5 mol/L)+Pg(1 mol/L)+Tre(1 mol/L),cpa-2:Eg(1 mol/L)+Pg(1.5 mol/L)+Tre(1 mol/L)。在含20% FBS的DMEM中制備了兩種緩沖冷凍保護劑,cpa-3:Eg(0.7 mol/L)+ Pg(0.5 mol/L)+Tre(0.5 mol/L),cpa-4:Eg(1 mol/L)+Pg(0.5 mol/L)+Tre(0.5 mol/L)。在FBS中配置了冷凍保護劑DMSO(5%、10%,體積分數)。上述所有溶液均用0.22 μm無菌濾頭過濾。

1.3 實驗設備

實驗設備如圖1所示。噴壺裝海藻酸鈉溶液或海藻酸鈉與細胞混合液并使進氣口連接到氣泵。噴槍有3種規格的噴嘴和噴針,直徑分別為0.3、0.5、0.8 mm。液體量和液體速度均可使用氣壓調節旋鈕進行調節。液體量也可以通過旋轉噴霧調節旋鈕來控制。此外,可以改變氣泵的氣壓控制液滴大小和噴涂速度。噴嘴和噴針的規格可以改變液滴的大小,本研究中使用的噴嘴和噴針直徑為0.8 mm。實驗前,氣泵用紫外線滅菌,噴槍用高壓滅菌鍋滅菌。使用掃描電子顯微鏡(SEM,TESCAN MIRA4)觀察水凝膠的表面形貌。

1 平筆帽;2 皇冠筆帽;3 噴嘴帽;4 噴嘴;5 噴針;6 噴壺;7 氣壓調節旋鈕;8 扳機;9 進氣口;10 噴針固定螺母;11 噴涂調節旋鈕。

圖2 塑料麥管用于快速冷凍細胞

1.4 細胞培養

在該實驗中,HEK293T細胞和HepG2細胞以相同的方式培養,均使用含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的DMEM培養基。用光學顯微鏡(尼康,日本)觀察細胞形態,待細胞占滿90%的視野開始實驗。將廢棄的培養基從T75培養瓶中輕輕吸出,用2 mL PBS洗滌兩次然后吸出,再加入2 mL胰蛋白酶并在含有5% CO2的培養箱(松下健康醫療器械株式會社)中在37 ℃下孵育(HEK293T細胞1 min,HepG2細胞2 min)。取出培養瓶并輕輕敲擊,用光學顯微鏡觀察,看到大部分細胞變得圓潤后,快速加入3 mL新鮮培養基停止消化,吸出細胞懸液,置于低速臺式離心機中,以1 400 r/min的速度離心4 min,取一部分細胞實驗,部分細胞移入T75培養瓶并加入15 mL新鮮培養基繼續培養以進行后續實驗。

1.5 研究交聯液對細胞存活率的影響

除非另有說明,HEK293T細胞和HepG2細胞的處理方法相同。將約5×106個細胞分別加入至質量分數為0.5%、1%、2% 的FeCl3·6H2O溶液,0.2 mol/L CaCl2溶液或質量分數為2%的海藻酸鈉溶液和新鮮培養基中。這些細胞被處理30 min或1 h。將細胞以1 400 r/min離心4 min,吸出上清液,加入3 mL新鮮培養基反復吹打清洗細胞,再以1 400 r/min離心4 min,吸出上清液,并加入3 mL新鮮培養基重懸。隨后,取5 μL細胞懸液,再取5 μL AO/PI 雙染試劑加入至細胞計數片中進行細胞染色計數(綠色熒光:活細胞,紅色熒光:死細胞)。最后,將細胞計數片放入細胞計數儀中計數并計算其存活率,其余細胞移至24孔板培養24 h和48 h后進行觀察。

1.6 通過噴槍將細胞包埋在水凝膠中以及水凝膠的SEM觀察

細胞包埋操作如下,將1 mL 質量分數為2%的細胞海藻酸鈉混合液加入至噴壺中。將CaCl2或FeCl3·6H2O溶液(50 mL)倒入1 L燒杯中,并以300 r/min的速度攪拌。將氣泵氣壓調節至4.5 mPa后,將噴霧調節旋鈕調節至最大,將氣壓調節旋鈕擰至最緊。隨后將細胞海藻酸鈉混合液噴至燒杯中。每扣動扳機2 s,停止10 s以使其初步交聯保持形態。將燒杯中的液體倒入 50 mL 離心管中,靜置 5 min使其完全交聯并自由沉降。最后,緩慢吸出溶液并加入10 mL新鮮培養基清洗水凝膠,將其轉移至15 mL離心管中并以300 r/min離心2 min。離心后吸出上清液,收集用于后續實驗,并取部分水凝膠用1 mL無水乙醇溶液分散,用超聲充分將其混勻后,取10 μL樣品滴加至剪裁好的錫紙上,放入烘箱烘干,將導電膠粘在樣品臺上,隨后將其粘附在導電膠上,送入SEM掃描電鏡中觀察。

1.7 研究包埋后細胞的存活率

將2 mL檸檬酸鈉溶液加入至裝有包封細胞的離心管中,然后輕輕吹打以加速水凝膠的溶解并釋放出包埋的細胞。將混合液以1 400 r/min離心4 min,吸出上清液以收集細胞,隨后加入5 mL新鮮培養基重懸并將5 μL細胞懸液以及5 μL AO/PI 雙染試劑加入細胞計數板中。將細胞計數板放入熒光細胞計數儀中以計數和測量細胞存活率。

1.8 不同質量分數海藻酸鈉溶液交聯CaCl2培養HEK293細胞

分別將約5×106個HEK293T細胞加入至1 mL海藻酸鈉溶液(1%、1.5%、3%,質量分數)中。將CaCl2溶液(50 mL)倒入1 L燒杯中,并以300 r/min的速度攪拌,分別使用噴槍進行交聯。收集的水凝膠微膠囊清洗并加入新鮮培養基,將微囊化的細胞在T25培養瓶中培養7 d,在第3天和第7天取部分水凝膠在熒光顯微鏡下觀察。具體操作如下:將少量含有水凝膠的培養基吸出到載玻片上,并加入10 μL AO/PI雙染色試劑并與包封的細胞充分混合。在明場下觀察微膠囊,調整至合適視野用熒光場觀察,發射波長和吸收波長分別為488 nm和520 nm。

1.9 冷凍保存微囊化的細胞并檢測存活率

4種保護劑被用于快速冷凍水凝膠包裹的細胞。對于傳統的DMSO保護劑,將2 mL的DMSO(5%或10%)加入至封裝的細胞中,混合均勻,然后用移液槍轉移至塑料麥管中。對于cpa-1和cpa-2,采用分步添加保護劑的方式,以減少在添加保護劑過程中的滲透性損傷[22-23]。將水凝膠包封的HEK293T細胞與2 mL cpa-3混合后在4 ℃冰箱中孵育10 min,并以300 r/min離心2 min。然后,吸出上清液,加入2 mL cpa-4,在4 ℃冰箱中再孵育10 min。隨后,將細胞離心,吸出上清液,分別加入2 mL cpa-1和2 mL cpa-2,用移液槍吸至塑料麥管中。將塑料麥管直接放入液氮中并使之穩定。在液氮中平衡5 min后,取出塑料麥管,在37 ℃的水浴中振蕩快速復溫,剪斷塑料麥管的末端,將水凝膠收集在15 mL的離心管中。取出部分水凝膠,在顯微鏡明場下觀察,其余的水凝膠通過加入檸檬酸鈉溶液釋放細胞,并通過離心收集,將細胞重新懸浮在新鮮培養基中,檢測細胞存活率。

1.10 數據分析

每組實驗重復至少3次,數據以平均值±標準差(SD)表示,采用Origin2022軟件中Turkey方差分析做數據分析。

2 結果和討論

2.1 交聯液對細胞存活率的影響

本文采用低成本、易得、操作簡單的空氣噴涂裝置制備海藻酸鈣水凝膠,通過SEM觀察了水凝膠的表面形貌,結果如圖3所示。海藻酸鈣呈粗糙結構,該粗糙結構有利于細胞凍存過程中細胞與凍存液的相互作用。首先研究了交聯溶液對細胞存活率的影響,圖4和圖5顯示了HEK293T細胞和HepG2細胞在交聯溶液中共培養30 min,清洗后加入新鮮培養基培養48 h后的狀態。如圖4(a)～(c)和圖5(a)～(c)所示,在FeCl3·6H2O溶液中(圖4(a)、圖5(a):0.5%,質量分數;圖4(b)、圖5(b):1%,質量分數;圖4(c)、圖5(c):2%,質量分數)共培養30 min并在新鮮培養基培養48 h后,HEK293T和HepG2細胞均漂浮而未貼壁。與此形成鮮明對比的是,在CaCl2(圖4(d)、圖5(d):0.2 mol/L)、海藻酸鈉溶液(圖4(e)、圖5(e):0.2%,質量分數)中共培養30 min并在新鮮培養基培養48 h后,細胞可以正常增殖,貼壁效果幾乎與新鮮組(僅在新鮮DMEM培養基中處理過30 min并在新鮮培養基培養48 h后的細胞)完全相同(圖4(f)、圖5(f))。上述結果表明,FeCl3·6H2O可能對細胞造成明顯的損傷,CaCl2和海藻酸鈉溶液在實驗劑量下不會影響細胞的正常生長。圖6所示為經過交聯液處理后細胞的存活率,其中圖6(a)和圖6(b)分別為HEK293T細胞和HepG2細胞在培養基(1:完全培養基;2～4:質量分數分別為0.5%、1%、2%的FeCl3·6H2O溶液;5∶0.2 mol/L CaCl2;6:質量分數為2%的海藻酸鹽鈉)中共同培養0.5 h及1 h后的細胞存活率。數據顯示,與CaCl2共培養30 min和1 h后,HEK293T的存活率分別為89.48% ± 1.95%和84.8% ± 0.63%。與海藻酸鈉溶液共培養30 min和1 h后,細胞存活率分別為94.75% ± 1.89%和91.22% ± 0.72%。與CaCl2共培養30 min的HepG2細胞在0.5 h處理后存活率為88.14% ± 1.71%,1 h后為81.025% ± 1.365%。與海藻酸鈉溶液共培養30 min后細胞存活率為94.21% ± 0.59%,1 h后存活率降至91.97% ± 0.47%。

圖3 2%(質量分數)海藻酸鈉交聯CaCl2制備的凝膠在掃描電鏡下的圖片

圖4 培養48 h的HEK293T細胞的細胞形態

圖5 培養48 h的HepG2細胞的細胞形態

圖6 與交聯液共培養0.5 h及1 h后的細胞存活率

上述結果表明,無論使用何種溶液,細胞存活率均會隨著細胞在交聯溶液中處理時間的變長而下降。因此,縮短交聯時間可以提高細胞存活率。同時發現海藻酸鈉溶液具有較高的生物相容性,實驗劑量中CaCl2的毒性低于FeCl3·6H2O。這可能是因為高濃度的三價鐵可能導致細胞線粒體損傷[24]。此外,實驗分數下發現隨著FeCl3·6H2O質量分數的增加,細胞存活率增加,HEK293T細胞與FeCl3·6H2O共培養0.5 h后的存活率為15.71% ± 1.42%(0.5%質量分數)、27.11% ± 1.78%(1%質量分數)和51.40%± 2.66%(2%質量分數,圖6(a)),HepG2細胞的存活率為11.46% ± 1.48%(0.5%質量分數)、19.40% ± 2.07%(1%質量分數)和45.88% ± 2.28%(2%質量分數,圖6(b)),具體原因仍有待進一步研究。

2.2 細胞包封后對存活率的影響

以上數據表明,交聯溶液會降低HEK293T和HepG2細胞的細胞存活率,然而,在與海藻酸鈉交聯后可以緩解CaCl2和FeCl3·6H2O的毒性。圖7(a)、7(b)分別表明了HEK293T和HepG2細胞與不同質量分數的FeCl3·6H2O以及CaCl2交聯后細胞的存活率,其中(1:新鮮對照組(完全培養基);2～4:質量分數分別為0.5%、1%、2% 的FeCl3·6H2O溶液與質量分數為2%的海藻酸鹽鈉交聯包埋細胞;5∶0.2 mol/L CaCl2與質量分數為2%的海藻酸鹽鈉交聯包埋細胞),其中交聯時間為30 min,數據表明,水凝膠包埋后的細胞存活率增加,其中不同質量分數的FeCl3·6H2O交聯海藻酸鈉并包埋的HEK293T細胞的存活率分別從15.705%±1.415%增至33.96%±4.36%(0.5%質量分數,P<0.001),從27.11%±1.78%增至38.66%±2.39%(1%質量分數,P<0.001),從50.13%±3.61%增至52.08%±2.63%(2%質量分數)。HepG2細胞存活率從11.46%±1.48%增至26.49%±1%(0.5%質量分數,P<0.001),從19.40%±2.07%增至33.61±3.23%(1%質量分數,P<0.001),從45.88%±2.28%增至50.61%±2.65%(2%質量分數,P<0.05)。在與CaCl2交聯細胞包封的水凝膠中,交聯后的細胞存活率高于約90%。使用噴槍制備的水凝膠包封細胞以及AO/PI染色的結果如圖8所示,圖中為包封的HEK293T細胞。a～c為以2%質量分數FeCl3·6H2O為交聯溶液的水凝膠包封細胞,a為細胞包封在海藻酸鐵水凝膠明場下的圖片,b為包封在海藻酸鐵水凝膠中的活細胞,c為包封在海藻酸鐵水凝膠中的死亡細胞;d～f為以CaCl2為交聯溶液的水凝膠包封細胞,結果表明,使用噴槍可以制備尺寸約為20～400 μm的水凝膠。使用AO/PI(綠色為活細胞,紅色為死細胞)對微囊化細胞進行染色后,通過熒光顯微鏡可以發現,與FeCl3·6H2O交聯后包封的細胞中的死亡細胞多于與CaCl2交聯后包封的細胞中的死亡細胞,但包封后兩種交聯液制備水凝膠包封細胞的存活率均得到了提升,證明與海藻酸鈉交聯后可以緩解CaCl2和FeCl3·6H2O的毒性。以上數據表明,噴槍法制備的水凝膠可以達到良好的細胞包封效果,可能是由于高生物相容性海藻酸鈉可以先包裹細胞,然后再與CaCl2和FeCl3·6H2O交聯,減少了周圍環境對細胞的破壞,從而保護細胞。因此,CaCl2交聯的水凝膠更適合用于包埋細胞。

圖7 細胞在水凝膠包封前后的存活率

圖8 水凝膠包封HEK293T細胞在明場和熒光場中的觀察結果

2.3 不同海藻酸鹽質量分數包封HEK293T細胞并培養

在證明噴槍法制備的水凝膠可以達到良好的細胞包封效果后,選擇HEK293T細胞作為代表細胞系,研究了不同質量分數海藻酸鈉溶液與CaCl2交聯包埋細胞后的培養效果,結果如圖9所示,圖9(a)、(b)、(c)分別表示質量分數為1%、1.5%、3%的海藻酸鈉溶液分別與0.2 mol/L的CaCl2溶液交聯包埋HEK293T細胞并3D培養3 d后的結果。對比圖9(a)～(c)可知,海藻酸鈉質量分數越高,水凝膠微球越均勻和規則。這可能是因為海藻酸鈉的質量分數越高,液滴越容易在交聯溶液中保持其形態。此外,較高的海藻酸鈉質量分數可能會導致更快的交聯,以此來減輕磁力攪拌對凝膠形態的破壞。如圖9(a)所示,孵育3 d后,一些包封細胞的(1%質量分數的海藻酸鈉)水凝膠被分解并釋放包封的細胞,可能由于機械性能太低所致。相比之下,基于較高質量分數的海藻酸鈉(3%質量分數)的水凝膠微球更加均勻和規則。圖10為不同質量分數海藻酸鈉溶液交聯0.2 mol/L的CaCl2溶液封裝HEK293T細胞3D培養7 d后的結果,圖a～c、d～f和g～i中使用的海藻酸質量分數分別為1%、1.5%、3%。其中a、d、g為水凝膠包封細胞明場下的圖片;b、e、h為水凝膠包封下的活細胞;c、f、i為水凝膠包封下的死亡細胞。培養7 d后的染色結果表明,僅有少量細胞死亡,90%以上的細胞存活,用3種質量分數的海藻酸鈉包封的細胞均可以較好的在體外培養。

圖9 水凝膠包封HEK293T細胞培養3 d后的形態

圖10 水凝膠包封HEK293T細胞培養7 d后的形態以及熒光染色結果

2.4 冷凍保存后細胞的存活率

觀察了冷凍保存后的微膠囊并檢測了冷凍保存后的存活率,結果如圖11所示,其中交聯液為2%質量分數的海藻酸鈉交聯0.2 mol/L的CaCl2溶液。圖11(a)所示為HEK293T細胞封裝后以CPA2為保護劑冷凍保存復溫后的結果;圖11(b)所示為兩種細胞微囊化前后在以體積分數為5%、10%的DMSO為保護劑的前提下冷凍保存的存活率,其中1～6組分別表示為:1-對照組(新鮮細胞無DMSO);2-水凝膠包封后的細胞(不含DMSO);3-水凝膠包封細胞后用10% DMSO冷凍;4-水凝膠包封細胞后用5% DMSO冷凍保存;5-新鮮細胞用10% DMSO冷凍保存;6-新鮮細胞用5% DMSO冷凍保存。圖11(c)所示為新鮮細胞的存活率以及HEK293T細胞在以CPA1和CPA2為保護劑的前提下微囊化并冷凍保存前后的存活率。由圖11(a)可知,冷凍保存后包封細胞的水凝膠的形態保持了良好的形態。由圖11(b)可知,在無水凝膠包封的情況下,HEK293T細胞的存活率為33.16%±2.70%(10% DMSO)和16.75%±2.3%(5% DMSO)。然而,水凝膠包封后的細胞存活率增至76.51%±5.32%(10% DMSO)和60.86%±2.41%(5% DMSO)。對于HepG2細胞,經過DMSO處理的細胞的存活率從未包封前的48.93%±3.06%(10% DMSO)和36.22%±2.54%(5% DMSO)增至包封后的78.79%±4.43%(10% DMSO)和64.64%±3.13%(5% DMSO)?？梢钥闯?水凝膠包封后冷凍細胞的存活率明顯提高。由圖11(c)可知,在保護劑CPA-1和CPA-2中玻璃化凍存微囊化的HEK293T細胞后,也發現了相同的結果。在CPA-1中,HEK293T細胞在微膠囊化前的存活率為47.24%±2.15%,微膠囊化后為56.71%±2.35%。在CPA-2中,水凝膠微膠囊化后HEK293T的存活率從33.5%±0.8%增至79.05%±3.76%。顯然,水凝膠包封后冷凍保存的HEK293T細胞的存活率顯著提高,進一步表現了水凝膠在細胞凍存中對細胞的保護作用。

圖11 微囊化的細胞低溫保存后的圖片以及存活率

3 結論

為了探究更快的方法制備海藻酸鹽水凝膠包埋細胞并探究水凝膠在細胞培養及低溫保存中的優勢,選用噴槍設備制備了海藻酸鈣與海藻酸鐵凝膠包封了HEK293T和HepG2細胞,得到如下結論:

1)在交聯液與細胞共同培養的實驗中論證了隨著時間延長,細胞存活率下降,Fe3+會對細胞造成不可逆損傷,Ca2+的生物相容性好很多。同時發現凝膠后顯著降低了細胞在交聯液中的毒性。

2)采用噴槍設備將HEK293T細胞封裝在不同質量分數的海藻酸鈉制備的海藻酸鈣凝膠中培養7 d,發現該方法制備的水凝膠不會影響微囊化細胞的培養。

3)在微囊化后細胞的凍存實驗中,發現水凝膠包封后在以DMSO為保護劑的快速冷凍保存,以及使用乙二醇(1 mol/L)+丙二醇(1.5 mol/L)+海藻糖(1 mol/L)的玻璃化保存中均對細胞有顯著的保護效果,再次證實了該方法用于細胞包埋、細胞培養及凍存的可行性。

關于噴筆制備水凝膠提出以下展望,該方法成本低,操作簡單,可以更快地包封細胞,并且可以通過減少交聯時間來降低細胞損傷。缺點是需要人工操作,制備的水凝膠大小不一,可以考慮采用自動化設備來解決這一問題。