基于機器視覺系統佛手炮制前后的判別及顏色-成分相關性分析

陳維玲，陳倩茹，孟江，李旺君，陳燁昕，陳志維，張戴英

（1.廣東藥科大學中藥學院/國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室/廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東 廣州 510006；2.廣州至信中藥飲片有限公司，廣東 廣州 511400；3.東莞廣州中醫藥大學研究院，廣東 東莞 523000；4.廣東和翔制藥有限公司，廣東 廣州 510000）

佛手是蕓香科植物佛手Citrus medicaL. var.Sarco-dactylis Swingle 的干燥果實。其性辛、苦、酸、溫，歸肝、脾、胃、肺經。具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的作用，用于肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥狀[1]。在嶺南地區，臨床使用的佛手飲片多為蒸制后的制佛手，蒸后其辛燥之性降低[2]。目前對佛手炮制前后的質量控制，多依靠人體感官為主進行鑒別，2020 年版《中華人民共和國藥典》關于佛手的標準為“外皮黃綠色或橙黃色，有皺紋和油點。果肉淺黃白色或淺黃色，散有凹凸不平的線狀或點狀維管束。質硬而脆，受潮后柔韌。氣香，味微甜后苦”[1]。關于蒸佛手性狀描述為：“蒸后呈棕黃色或棕黑色”[2]。傳統的質量鑒別方法具有較強的主觀性，且易受到周圍環境的影響，無法客觀標準化。

機器視覺是指計算機通過實現人的視覺功能，對客觀世界的三維場景進行感知、識別和理解，具有非破壞性、精度高、成分效率高、信息量大、靈活等特點[3]。它可以在保證高精度圖像識別和高靈活圖像處理的同時快速地在海量信息中獲取所需要的信息，將大量圖像信息輸入到計算機中構建數據庫。通過計算機相關軟件與建立的圖像數據庫進行互相配合，在短時間內快速地比對提取到的重要特征信息，完成數據信息分析、對比、去除和保持等[4]。機器視覺融合機器學習可以對中藥材的顏色特征進行采集，從而轉化成數字，利用計算機對得到的數據進行對比來對飲片進行實際鑒別和質量控制。目前，機器視覺系統在中藥飲片的定性定量分析中得到廣泛應用。

佛手中的主要活性成分為黃酮及其苷類、香豆素類等化合物[5]?，F代藥理研究表明，佛手中的香豆素具有抗感染、抗菌、抗癌、降血脂等作用[6]，其中6，7-二甲氧基香豆素有抗感染、抗腫瘤、保肝和心血管活性等作用[7?8]；莨菪亭具有抑菌、抗衰老、抗感染、鎮痛、利尿、保肝等多種藥理作用[9]。佛手中的類黃酮可以降低血清中的脂質水平[10]，其主要活性單體成分橙皮苷可以改善2型糖尿病的胰島素抵抗指數[11]。本文選擇橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭為佛手和蒸佛手的指標性成分，采用HPLC 法測定這3 種成分的質量分數，再通過機器視覺系統對飲片顏色特征進行數字化信息處理，利用主成分分析（principal component analysis,PCA）、線性判別分析（principal component analysis,LDA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA）和支持向量機（support vector machine, SVM）等機器學習算法建立快速判別模型，并對其顏色特征值與各化學成分質量分數進行相關性分析，為佛手炮制工藝的控制和質量評價提供參考依據。具體研究思路見圖1。

圖1 佛手炮制前后顏色-成分相關性分析的研究思路圖Figure 1 The research idea diagram of color component correlation analysis before and after the processing of Citrus medica

1 儀器、材料與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型HPLC 儀（日本Shimadzu 公司）、JP-105A型高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）、BSA124S 型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）、KQ-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率150 W、頻率40 kHz）、電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、機器視覺系統主要包括光箱（封閉反光板組成）、光源（光箱頂部兩側各帶2 個18 W 燈管，其光源色溫為5400 K）（見圖2）、FUJI X-T2 型數碼相機（日本Fuji 公司）。

圖2 機器視覺系統Figure 2 Machine vision system

1.2 藥品與試劑

收集廣東不同飲片企業的生制佛手樣品共60批，經廣東藥科大學中藥學院劉基柱副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus medicaL.var.sarco-dactylis Swingle 的干燥果實的炮制加工品，詳細信息見表1，佛手飲片見圖3。其中生品（S1～S30）和炮制品（Z1～Z30）各30 批，制佛手按照《廣東省中藥飲片炮制規范》進行炮制：噴水后蒸2～3 h，取出，曬干。6，7-二甲氧基香豆素（批號：CHB201102）、莨菪亭（批號：CHB201202）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，橙皮苷（批號：RFS-C00601910011）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，質量分數均大于98%。甲醇、乙腈為色譜純，水為屈臣氏蒸餾水。

表1 佛手飲片樣品信息表Table 1 Sample information of Citrus Medica

圖3 佛手飲片原始圖像Figure 3 Original image of Citrus Medica

2 方法與結果

2.1 多成分質量分數的測定

2.1.1 混合對照品儲備液的制備 分別取橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中加甲醇定容配置成質量濃度分別為228.00、76.50、74.25 μg/mL 的混合對照品儲備液，密封置于4 ℃保存備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取已過5 號篩的佛手生品和制品粉末各1 g，分別精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，蓋緊瓶蓋，置KQ-300DE 型數控超聲波清洗器中超聲45 min，放至室溫，用甲醇補足質量，搖勻，靜置，取上層溶液，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液，密封保存。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為UltimateTMXB-C18色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～5 min，15%（體積分數，下同）B→23%B；5～15 min，23%B→28%B；15～30 min，28%B→50%B；30～46 min，50%B→85%B；46 ～47 min，85%B→95%B；47 ～50 min，95%B→98%B。檢測波長：330 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液，照倍比稀釋法分別吸取0.5、1.0、2.5 和5.0 mL 的混合對照品溶液，放置在10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，與混合對照品儲備液組成5個濃度梯度的混合對照品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，以對照品質量濃度為橫坐標（X）、其峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。得到橙皮苷、莨菪亭、6，7-二甲氧基香豆素的回歸方程分別為Y1=2.639 2×104X1?2.984 2×104（R12=0.999 3），線性范圍為7.125 0～228.000 μg/mL；Y2=7.960 2×104X2?3.007 9×104（R22=0.999 8），線性范圍為2.390 9～76.500 μg/mL；Y3=8.520 1X3?2.764 5（R32=0.999 8），線性范圍為2.320 3～74.250 μg/mL。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 精密度考察 取同一批佛手粉末（S6），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，連續進樣6 次測定。計算得到橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭峰面積的RSD 值分別為3.19%、2.16%、1.75%，均小于4%，說明儀器的精密度良好。

2.1.5.2 樣品穩定性考察 取同一供試品溶液（S6），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定。計算得到樣品中橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭峰面積的RSD 值分別為0.67%、1.73%、1.47%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.5.3 重復性試驗 取同一批次（S6）供試品粉末6份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定，計算供試品中橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭的峰面積，得到橙皮苷、6，7-二甲氧香豆素、莨菪亭的質量分數分別為740.47、44.71、51.46 μg/g，RSD 值分別為1.72%、4.24%、4.22%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.5.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知3 種成分質量分數的佛手粉末0.5 g，共6 份，按照1∶1 的比例分別加入橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定，計算得到加樣回收率分別為：橙皮苷92.28%（RSD 值1.29%）、6，7-二甲氧基香豆素101.54%（RSD 值1.85%）、莨菪亭105.17%（RSD值1.90%），表明本方法具有良好的回收率。

2.1.6 質量分數測定 分別取表1中的佛手生品、制品粉末60 批，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，每個樣品重復測定3次，記錄各樣品的峰面積，采用外標法計算樣品中3 種成分的質量分數，結果見圖4。結果顯示，佛手炮制后6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭質量分數都有不同程度升高，其中6，7-二甲氧基香豆素的升高有統計學意義（P＜0.01）；而橙皮苷質量分數的降低亦有統計學意義（P＜0.01），可能是佛手蒸制后橙皮苷會水解轉化為其苷元橙皮素，而致其含量下降。

圖4 佛手生品、制品中3種成分的質量分數測定結果Figure 4 The contents of three components in the raw and processed Citrus Medica（n=30）

2.2 基于機器視覺技術的佛手生品、制品樣品的圖像采集與處理

2.2.1 拍攝參數設置 手動對焦模式，光圈F/8，快門速度1/60 s，IOS 200，圖像色彩為RGB 模式，分辨率為4 000×4 000，圖像保存格式為jpeg格式。在燈箱底部的正中央放置1 張白紙，將飲片置于白紙上，以減少背景顏色的干擾；采用三腳架固定鏡頭角度垂直向下以防止角度偏移或拍攝過程中抖動引起飲片圖像失真。

2.2.2 目標區域選擇 RGB色空間中，純黑色（R=0，G=0，B=0）背景能最大限度地減少背景的干擾，因此對飲片圖像進行前景與背景的分離。采用Matlab 中的Image segmenter 工具箱對佛手生品和制品的飲片圖像進行目標區域選擇，結果如圖5 所示。圖像勾畫前的紅色框為軟件自動識別飲片主體部分，藍色部分是在勾畫前景后計算機通過學習所識別到的前景區域，通過勾畫背景色對背景進行自動識別，然后將背景部分的顏色替換為黑色。

圖5 佛手生品目標區域選擇前后的圖像Figgure 5 The image before and after selecting of Citrus Medica target region

2.2.3 顏色特征的提取和轉化

2.2.3.1 RGB 色空間特征值 RGB 色空間是在數字圖像處理的顏色模型中最基本的一種模型，這個模型中其他顏色都是由紅色、藍色、綠色3種顏色相互疊加而形成。其中，R（red，紅色）、G（green，綠色）、B（blue，藍色）為RGB 色空間3 條坐標軸，在量化后所得的數值范圍為0～255，其中0 值為顏色最暗時的數值，255 為顏色最亮時的數值[12]。本試驗使用Matlab 軟件對圖片顏色特征進行提取，提取使用的代碼參考前期課題組編寫的代碼，最終得讀取的飲片圖像的R、G、B顏色值。

2.2.3.2 L*a*b*色空間特征值 在L*a*b*色空間中通過L*值、a*值和b*值來表示顏色在色空間中的位置。其中L*為顏色的亮度；a*和b*為顏色通道，a*為紅綠軸，正值表示紅色，負值表示綠色；b*為黃藍軸，正值表示黃色，負值表示藍色。由于RGB 顏色空間對顏色認知屬性的表達不直觀，且無法從2 種顏色的空間幾何關系中得到它們的認為知覺差異，而Lab空間所計算處理顏色的偏差程度跟人們的主觀感受相似，所以需要將試驗所得的佛手生品和制品的飲片圖像從RGB 模型轉換成L*a*b*模型。但RGB顏色空間無法直接轉換成L*a*b*顏色空間，所以需要借助三刺激值XYZ 作為過渡，先將RGB 顏色空間轉換成三刺激值XYZ，再轉換為L*a*b*顏色空間[13]。該轉換過程所用的轉換公式參考前期課題組編寫的轉換公式[14]，最終得到L*、a*、b*值。

2.2.3.3 HSV 色空間特征值 HSV 色空間是一種與設備無關的，能將色調（H）、飽和度（S）和亮度（V）分離的顏色空間。其中，色調是色彩的基本屬性，其取值范圍為0°～360°；飽和度為顏色純度，取值范圍為0%～100%；亮度值表示顏色亮度，取值范圍為0%～100%。HSV 模型可由RGB 模型轉換，其轉換是非線性的[15]。該過程的轉換公式參考前期課題組編寫的轉換公式[14]，最終得到H、S、V值。

2.2.4 機器視覺技術的精密度和穩定性考察 取佛手樣品（S3）飲片1 片，按“2.2.1”項下拍攝參數在同一時間點內連續拍攝6次考察機器視覺技術的精密度，連續6 d 在同一時間點拍攝考察機器視覺技術的穩定性，并按“2.2.2”項下圖像預處理和“2.2.3”項下圖像顏色特征提取方法提取顏色特征。9 個顏色特征值的RSD 值均小于3%，表明機器視覺技術的精密度、穩定性良好。

2.2.5 佛手炮制前后樣品的顏色測定 為保證樣品的代表性和均勻性，在對佛手生品和佛手制品進行顏色測量時，選擇在每批次中隨機抽取24片飲片按“2.2.1”項的拍攝參數進行拍攝，共獲取1 440 張樣品圖像。將獲得的飲片圖像按照“2.2.2”項下圖像預處理和“2.2.3”項下方法提取其顏色特征值，結果見表2。在RGB 顏色空間中，佛手在經過炮制后R、G、B3 個特征值均降低，這也造成了佛手炮制后外觀明亮度的降低，即在L*a*b*顏色空間中L*和b*的值也相應降低，這與佛手炮制后外觀顏色從淺黃色或淺棕色變成深褐色或黑色相吻合。a*值相對變化較小，說明紅綠色有輕微變化，顏色向少綠多紅的方向輕微偏移，而b*值減小量較大，說明黃藍色的組成發生較大的變化，顏色向少黃多藍的方向偏移，說明佛手在炮制后受黃藍色的變化影響較大。在HSV 顏色空間中，佛手炮制后H值降低的變化較大，說明圖像中的色調變化較大，佛手在炮制后由淺棕色變為深褐色甚至黑色，變化較大，也因為這個原因，S值即飽和度也隨著顏色的加深而增大。與S值的變化趨勢相反，明亮度V隨著顏色的加深而減小，這可能是顏色加深使得樣品黑色面積增大而導致。

表2 佛手炮制前后的顏色特征值測定結果Table 2 Results of color characteristic values before and after processing of Citrus medica（n=720）

2.3 基于機器學習的佛手生品與佛手制品的顏色定性判別分析

2.3.1 PCA 模型的判別分析 將佛手生品和制品的顏色特征值進行歸一化處理作為輸入變量，建立基于顏色特征的PCA 模型判別。獲得2 個主成分因子：分別從數據差異性最大和次大的方向提取出來，稱為主成分1（principal component 1, PC1）和主成分2（principal component 2, PC2），PC1 的解釋程度達到98.6%，模型穩定良好。該PCA 模型的2 種主成分的累計解釋變量達到99.43%，見圖6。即這2種主成分數能夠解釋佛手生品和制品樣品99.43%的顏色特征，提取的信息具有較好的特征性和代表性。圖7為PCA模型得分圖，由圖可知，佛手的顏色特征在炮制前后具有高度分離的趨勢，沒有重合的部分。同時發現制品較生品的顏色特征分散，代表制品的類趨（class potential）跨度較大，可能是制品顏色較深，不同樣品的個體之間的炮制程度存在差異，顏色差距也相對較大而導致；而生品的點較為集中，部分點存在重合現象，可能是生品顏色較淺，為淺黃色或淺棕色，不同樣品的個體之間顏色特征差別不大的原因。PCA模型得分圖表明將顏色特征數值化客觀化來鑒別佛手生品和制品具有一定的可行性，但仍存在一定的誤差，后續實驗將采用有監督模式識別方法提高判別的準確率。

圖6 PCA模型前6個主成分的解釋變量與累計解釋變量圖Figure 6 Explanatory variables and cumulative explanatory variables of the first 6 principal components of PCA model

圖7 佛手與制佛手PCA模型得分結果Figgure 7 Score results of PCA model of Citrus Medica and Steamed Citrus Medica

2.3.2 有監督模式識別的佛手炮制前后的判別 為提高模型對佛手炮制前后的判別效果，基于樣品圖像提取的顏色特征值，采用有監督模式識別方法，包括LDA、PLS-DA、SVM3 種有監督的模式識別方法。以佛手生品和制品樣品的9 個顏色特征數值（R、G、B、L*、a*、b*、H、S、V）作為自變量。以佛手的生品、制品作為因變量建立判別模型，使用10 折交叉驗證法評價判別模型的性能。10 折交叉驗證法是將原始數據集隨機劃分為樣品數量近乎相近的10個子集，輪流將其中的9個子集合并成訓練集，而剩余的1 個子集作為測試集，在每次試驗中計算正確率等評價指標，最終通過10次試驗后取試驗所得的評價指標的平均值來評估該模型的泛化能力的驗證方法[16]。本次試驗共有佛手生制樣品60 批，按2∶1 的比例隨機劃分訓練集和驗證集，得到訓練集40 批（生品的17 批和制品的23 批）與驗證集20 批（生品的13批和制品的7批），訓練集用來訓練模型，從而選出模型的最佳參數；驗證集用于測試模型的應用效果。本實驗所用的3個判別模型的驗證結果如表3 所示，從識別結果可以看出其對樣品的識別效果均良好，訓練集在訓練時對學習佛手生品和制品之間顏色特征值的規律效果較好，正確判別率均為100%，且驗證集的正確判別率也為100%。由此可見，LDA、PLS-DA、SVM3個模型均可以對佛手生品和制品的顏色特征值進行快速且準確的鑒別。

表3 LDA、PLS-DA和SVM判別模型識別結果Table 3 Identification results of LDA，PLS-DA and SVM discriminant models

2.4 基于機器學習的佛手炮制前后的顏色-成分相關性分析

使用SPSS 軟件機器視覺所測定得到的9 個顏色特征值與佛手生品和制品的3種成分質量分數進行Pearson 相關性分析，結果見表4。結果顯示橙皮苷和6，7 二甲氧基香豆素與9 個顏色特征值間的Pearson 相關性均大于0.4，相關性良好，而莨菪亭與9個顏色特征值間的Pearson相關性均小于0.4，說明其相關性較弱。其中，橙皮苷質量分數與R、G、B、L*、b*、H、V這7 個特征值均具有顯著差異性，除與a*、S這2個特征值呈負相關外，其余均為正相關，說明一定程度上R、G、B、L*、b*、H、V值減小，橙皮苷質量分數降低，而a*、S值減小，橙皮苷質量分數反而升高；6，7-二甲氧基香豆素的質量分數與R、G、B、L*、b*、H、V這7 個特征值呈負相關，說明一定程度上R、G、B、L*、b*、H、V值減小，6，7-二甲氧基香豆素質量分數升高。Pearson 相關性分析說明炮制前后佛手飲片的顏色變化與上述3種成分的質量分數變化有關，揭示了佛手炮制前后化學成分質量分數與其顏色的動態變化過程。

表4 佛手炮制前后的圖像顏色特征值與有效成分的Pearson相關性分析結果Table 4 Results of Pearson correlation analysis between color characteristic values and active components of the image before and after processing of Citrus Medica

3 討論

根據藥材的外觀性狀特征來綜合判斷藥材的真偽優劣是一種具有中醫藥特色的質量評價體系，這種質量評價體系被著名中藥學家謝宗明先生概括為“辨狀論質”，是中藥傳統質量評價的精髓[17]，說明了中藥外觀性狀特征評價在中藥質量評價方法中的重要性。而機器視覺和傳統經驗比較，其在客觀量化形色方面有一定優勢，是對傳統經驗鑒別的一種有益補充[18]。本文以佛手生品與佛手制品為研究對象，通過圖像處理技術實現對飲片外觀顏色的客觀量化，通過研究確定佛手炮制前后的顏色特征及其顏色特征值范圍。其中符合傳統經驗鑒別的佛手生品的顏色特征范圍為：R（187.047～209.077）、G（152.648～183.082）、B（113.791～150.143）、L*（65.768～76.067）、a*（2.932～9.969）、b*（13.799～26.313）、H（30.630～34.890）、S（20.737～40.416）、V（73.352～82.265）；符合《廣東省中藥飲片炮制規范》的佛手制品顏色特征值范圍為R（43.642～136.578）、G（30.153～92.509）、B（27.235～64.834）、L*（12.923～43.443）、a*（6.102～15.724）、b*（4.642～23.341）、H（10.246～22.856）、S（34.491～58.781）、V（17.115～53.560）。并通過HPLC 法測定3 種成分的質量分數，探究佛手與蒸佛手外觀顏色與有效成分的相關性。結果表明LDA、PLS-DA 和SVM 模型在外部驗證中正判率均達100%，可以實現對佛手生品和佛手制品的快速、準確鑒別。通過顏色與質量分數之間的相關性分析，發現橙皮苷質量分數與R、G、B、L*、b*、H、V值呈顯著正相關性，與a*、S值呈顯著負相關；6，7-二甲氧基香豆素的質量分數與R、G、B、L*、b*、H、V值呈顯著的負相關性。初步證明了佛手炮制前后化學成分質量分數與其顏色的動態變化過程，確定了佛手中有效物質成分的質量分數與外觀顏色存在相關性。綜上所述，機器視覺系統可為佛手及其他中藥飲片的質量鑒別及炮制程度的控制提供一種快速、簡單、高效的質量檢測方法，可為批量大生產和智能化生產提供科學分析依據。