β‐1，3‐葡聚糖內切酶合成、制備及應用研究進展

方炯浩，劉瑜，吳宇簫，段濤，陳杰，肖湲，周林

（1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省藥物新劑型重點實驗室與廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510006；2.廣東丸美生物技術股份有限公司，廣東 廣州 510700）

β-葡聚糖是一種非淀粉多糖，由D-葡萄糖通過β‐糖苷鍵連接形成。β-葡聚糖包括熱凝膠多糖、裂褶多糖、大麥β-葡聚糖以及酵母β-葡聚糖等，廣泛存在于酵母、真菌、細菌、海藻和谷物中，不同來源的β-葡聚糖的線性結構和分支組成存在差異[1]。β-葡聚糖一般由β‐1，3 糖苷鍵構成，并含有不同數量的β-1，4 和β-1，6 糖苷鍵；而纖維素僅由β-1，4 糖苷鍵形成，因此β-葡聚糖一般不包括纖維素[2]。研究表明，β-葡聚糖能夠改善身體的健康狀況和預防慢性疾病，對糖尿病、肥胖、癌癥、高膽固醇血癥等都具有一定的預防和治療作用[3]，但目前大多數的β-葡聚糖因為分子量過大導致水溶性低，影響其生產工藝和生物活性，限制了β-葡聚糖在食品醫藥健康產業中的應用[4?6]。

β-葡聚糖酶是一類能降解β-葡聚糖的水解酶的總稱，根據其水解多糖中糖苷鍵的位置，可以分為內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。主要包括內切和外切β‐1，3‐葡聚糖酶、β‐1，3（4）-葡聚糖酶、內切和外切β-1，4-葡聚糖酶。其中β‐1，3-葡聚糖酶是負責β-葡聚糖分解的主要酶。內切β‐1，3‐葡聚糖酶隨機對β-1-3糖苷鍵進行切割，最終產物主要為低聚β-葡聚糖，而外切β‐1，3‐葡聚糖酶則從多糖的非還原端進行切割，最終產物主要為葡萄糖[7]。目前已發現的β-葡聚糖主要通過β‐1，3 糖苷鍵構成主鏈，利用β-1，3-葡聚糖內切酶能夠大量制備低分子量葡聚糖，因此β-1-3葡聚糖內切酶是制備低分子量葡聚糖的關鍵酶。β‐1，3-葡聚糖內切酶的生產方法主要有微生物發酵法與提取分離法。提取分離法是直接從動物或植物中提取，但效率較低，且酶學性質不穩定，難以進行分離純化，因此目前較為常用的方法是微生物發酵法。該方法能夠對微生物進行基因修飾，從而提高酶活性及穩定性，且制備的β-葡聚糖酶的純度高，有利于大規模生產[8]。但目前β‐1，3‐葡聚糖內切酶仍存在酶活性不高、表達量低等問題，生產成本居高不下，限制了其大規模的應用。如何通過β-葡聚糖酶高效制備低分子量β-葡聚糖及其生物活性的研究成為解決問題的關鍵。因此，以下主要針對β‐1，3-葡聚糖內切酶的相關研究及其進展進行介紹。

1 β-1,3-葡聚糖內切酶的合成調節

在通常情況下，β-葡聚糖酶的產量受到相應的合成機制的調控，如果要大幅度提高酶產量，可以利用基因改造等手段進行高產菌株的構建，或是在酶的發酵生產過程中，通過添加誘導物、控制阻遏物濃度、添加產酶促進劑等，其中控制阻遏物濃度和添加誘導劑可以通過抑制阻遏蛋白的表達，最終提高β-葡聚糖酶的產量（圖1）。具體來說，研究人員通過對核糖體結合位點（ribosomebinding site，RBS）序列進行優化后，獲得了β‐1，3‐葡聚糖內切酶表達水平較高的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），這是因為RBS 是翻譯起始和蛋白質表達的關鍵控制元件，RBS 序列的優化能夠提高β-葡聚糖酶的產量[9?10]。此外，添加某些碳源或金屬離子作為誘導劑或調節劑能夠調節酶的合成，提高酶的產量[11]，Adeoyo 等[12]研究了鈉、鉀、鋅、錳、鈷等金屬離子對真菌產內切葡聚糖酶的影響，發現添加鈉離子和鉀離子的培養基能有效提高內切葡聚糖酶的分泌，而鈷離子則會顯著降低其分泌，這表明添加金屬離子將對代謝調控的作用機制產生影響，其中部分金屬離子能夠作為提高內切葡聚糖酶分泌的產酶促進劑，但具體的機制尚不明確。

圖1 提高β‐葡聚糖酶產量的措施Figure 1 Measures for increase of β-glucanase yield

2 β-1,3-葡聚糖內切酶的制備

目前，通過從自然界中大量篩選的方法獲得更多具有高酶活性和穩定性的β-葡聚糖酶以及高產的菌株是一種有效的辦法，但因其低產率、低酶活性等原因，具有一定的局限性，利用基因修飾、異源表達以及固定化方法能夠獲得高穩定性、高酶活性的β-1，3-葡聚糖內切酶，也是目前科研人員較為常用的方法。結合現有研究歸納，圖2 列出了目前β-葡聚糖酶的主要研究方向[13?39]。

圖2 β‐葡聚糖酶的主要研究方向Figure 2 Main research directions of endo-β-1，3 glucanase

2.1 β-1,3葡聚糖內切酶的來源及篩選

通過對大分子葡聚糖的降解或修飾，能夠明顯改善葡聚糖的溶解性和提高生物活性[40]。傳統的低分子量β-葡聚糖生產方法主要是對葡聚糖β-糖苷鍵進行物理、化學和酶降解。通過降解的方法得到的產物，其基本結構單元并未發生改變，只是聚合度發生了變化，因而生物活性也未被破壞[41]。利用β-葡聚糖的酶法生物降解具有較高的專一性，能夠選擇性地切斷糖苷鍵，反應條件較為溫和，是一種較為理想的生產低分子量葡聚糖的方法，具有較高的研究和應用價值。表1列舉了10種不同微生物來源的β-1，3-葡聚糖內切酶，介紹了其分子量大小、切割的糖苷鍵類型、不同底物以及對應的酶活性。目前，通過從自然界中篩選性能優良的生物菌株是獲得具有高產量、高活性和熱穩定性β-1，3-葡聚糖內切酶的一種重要手段。在大自然這種獨特而復雜的進化環境中，野生菌株的篩選始終是不可或缺的。

表1 不同微生物來源的β-葡聚糖酶的酶學特性Table 1 Enzyme properties of β-glucanase from different sources

2.2 β-1,3-葡聚糖內切酶的修飾

基因修飾和化學修飾是目前較為有效的酶改造方法，通過改變β-葡聚糖酶的編碼序列或在蛋白質結構中引入不同的基團，在一定程度上能提高β-葡聚糖酶的活性、pH 穩定性和耐熱性，從而提高其利用率，降低酶的使用成本。Gao 等[23]利用易錯PCR 方法對β‐1，3‐葡聚糖酶基因BGN13.1a進行突變，并將突變后的基因導入宿主菌株。篩選出的突變酶具有更高的pH 穩定性和耐熱性，以熱凝膠多糖為底物時，其酶活性提高了1.15 倍。Miao 等[24]利用從極端嗜熱古細菌（Hyperthermophile）得到的C2模塊插入到內切β-1，4-葡聚糖酶CMCase-I 蛋白的N 端或C 端，產生C2-CMCase-I，CMCase-I-C2 和C2-CMCase-I-C2。研究發現，C2-CMCase-I在50°C時活性減少一半所需時間是野生型CMCase-I 的1.53 倍，這是因為C2-CMCase-I 產生了一個新的β折疊結構，從而增強了酶的耐熱性。Lee JM 等[25]則通過將堿基序列上特定的氨基酸替換為疏水基團，實現β-葡聚糖酶活性和熱穩定性的提高。研究人員將賴氨酸（Lys）和丙氨酸（Ala）或亮氨酸（Leu）進行替換后，經過熱力學和動力學參數的比較，發現突變型酶相比野生型酶在酶活性和熱穩定性都有不同程度的提高（圖2）。

2.3 β-1,3-葡聚糖內切酶的異源表達

天然途徑獲得β-葡聚糖酶，產量通常較低。通過在合適的微生物宿主中進行異源表達β-葡聚糖酶，可以顯著提高其產量，有利于降低生產成本，并推動其工業化應用。 例如，Borshchevskaya 等[26]從短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）提取了一個內切β-l，3（4）-葡聚糖酶的基因bgl1，并以畢赤酵母為宿主進行表達。不僅提高了產量，還使重組蛋白bgl1 的活性和穩定性都有較大提高。Gao 等[27]在綿羊瘤胃微生物群中分離出2 個新的葡聚糖酶基因IDSGluc5-26 和IDSGluc5-37，通過大腸桿菌進行異源表達后，其中IDSGLUC5-26在酸性條件下表現出相當大的穩定性，IDSGLUC5-37 對大麥β-葡聚糖表現出比原菌株更高的活性。Zhou 等[28]同樣以畢赤酵母（Pichia pastoris）為異源宿主，將從炭疽桿菌（Bacillus anthracis）分離得到的β-葡聚糖酶基因CoCel5A進行異源表達。研究發現，內切葡聚糖酶CoCel5A在55°C 溫度下具有更高的熱穩定性。上述研究表明，通過異源宿主的代謝表達后，不僅能夠提高β-葡聚糖的產量，還能在一定程度上提高酶的活性和熱穩定性，因此宿主菌株的選擇也十分重要（圖2）。

目前，常用的異源宿主細胞包括大腸桿菌（Escherichia coli）和畢赤酵母，其中畢赤酵母是目前最為成功的真核蛋白表達系統之一，具備高效啟動子、翻譯后的修飾能力、高分泌效率、低培養成本、成熟的發酵工藝和易于擴大培養等優點，適合用于工業化生產[29]。然而，構建高效的底盤宿主細胞仍存在4 個主要的挑戰，包括基因生產模塊的識別，如何選擇最合適的宿主細胞進行改造，重建和優化復雜的代謝網絡以及如何高效分泌所需產品[30]。因此，今后的研究重點將集中在如何篩選和優化異源表達宿主及其培養條件，構建高效的β-葡聚糖酶表達系統也將會是研究的重點?？傊?，隨著對異源表達機制的研究深入，人們必將找到更加有效的方法來提高β-葡聚糖酶的產量，優化其催化性能，從而實現β-葡聚糖酶產業化應用。

2.4 β-1,3-葡聚糖內切酶的固定化

酶的固定化技術是指通過物理或化學的方法將游離酶束縛在一定空間或固定在不溶性載體上，從而限制游離酶自由流動并使其能長時間發揮催化作用，同時可以進行回收利用的一種生物技術[31]。而酶降解方法具有一些不利的缺點，包括對苛刻的環境條件敏感、再生以及再循環過程中的困難。固定化能夠幫助酶克服惡劣條件，并在工業生物技術領域發揮重要的作用[32?33]。固定化β-葡聚糖酶，可以提高其穩定性、催化效率和可重復使用性。此外，固定化β-葡聚糖酶還能在不同反應條件下的應用，并以高催化活性工作，減少酶促降解過程的預算，從而提高其應用范圍和效率[34?35]。華承偉等[36]利用環氧型SEPABEADS EC 載體對β‐1，3‐葡聚糖酶進行共價固定化后，與游離酶相比，熱穩定性和pH值穩定性均有明顯提高。El-Shora等[37]則使用卡拉膠和殼聚糖進行交聯固定化，不僅穩定性有了提高，而且便于回收重復利用。研究人員還利用固定化的β-葡聚糖酶制備低分子量的大麥β-葡聚糖，而且在重復利用10次之后，其酶活性仍具有初始酶活的42%[38]。以上實驗證明，固定化β-葡聚糖酶在低分子量葡聚糖的生產上有著巨大的優勢，能夠有效解決β-葡聚糖酶的重復利用的問題，產生可觀的經濟效益（圖2）。此外，隨著酶固定化的納米載體、金屬有機骨架材料以及定向修飾固定技術的發展[39]，β-葡聚糖酶的工業化應用獲得了巨大的機會，也成為當前科學家研究的熱點領域。

3 β-1,3-葡聚糖內切酶在低分子量葡聚糖制備中的應用

目前，β‐1，3‐葡聚糖內切酶已經在食品、農業等領域都有了較為廣泛的應用，包括對果蔬進行抗真菌處理、制備酵母原生質體、清除生物被膜以及制備低分子量葡聚糖[42]。低分子量葡聚糖因其具有抗氧化及抗腫瘤等生物活性，而受到各國科研學者的廣泛關注。

3.1 低分子量β-葡聚糖的研究現狀

目前尚無關于低分子量葡聚糖的明確定義。根據現有文獻報道，與分子量達到十萬、百萬級別的葡聚糖相比，低分子量葡聚糖的分子量通常在幾百或幾千Da之間[43?44]。根據我國2016版《戰略性新興產業重點產品和服務指導目錄》指出，微生物多糖是生物行業中重要的開發產品。低分子量葡聚糖的生物活性目前是研究的熱點，不同分子量的β-葡聚糖具有不同的生物活性，在許多領域有著廣泛的應用。圖3總結了低分子量葡聚糖的多種生物活性及其在不同領域的應用。例如裂褶多糖（schizo‐phyllan，SPG）是一種非離子型的水溶性高聚葡萄糖，以1，3-β-D‐吡喃葡萄糖單元為主鏈，β-1，6 糖苷鍵為支鏈。 在高分子量時，SPG 具有極高的黏度，抑制了其生物活性，而低分子量的SPG 具有明顯的免疫調節活性，相較于高分子量SPG，低分子量的SPG 能更顯著地促進人體特異性免疫反應和相關細胞因子的釋放[45?46]。此外，不同分子量的葡聚糖對人體健康狀態產生不同的影響[47]。例如，不同分子量的燕麥β-葡聚糖會導致糞便中膽汁酸含量的變化，高分子量的燕麥β-葡聚糖會增加糞便中膽汁酸的含量，而低分子量的則相反。糞便中膽汁酸過多是腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）的發病機制之一，顯然，低分子量的燕麥β-葡聚糖對于維護腸道健康具有積極意義[48?49]。此外，低分子量β-葡聚糖還具有抗氧化性、保濕、抗腫瘤、抗菌等[50?51]生物活性，已經逐步應用于日用品、化妝品、生物醫藥、農業肥料等領域，成為研究的熱點領域。通過降解法得到的低分子量β‐1，3‐葡聚糖具有獨特的生理生化活性而吸引了各國研究人員的廣泛關注。

圖3 低分子量葡聚糖在不同領域的應用Figure 3 Application of low molecular weight glucan in different fields

3.2 低分子量葡聚糖的制備方法

目前，國內外制備低分子量葡聚糖的研究主要集中在物理、化學和酶降解方面。物理降解一般通過超聲或其他物理條件對高分子的葡聚糖溶液進行處理，從而獲得低分子量的葡聚糖。例如，Liang等[52]通過超聲的方式獲得了較低分子量的熱凝膠多糖，并顯著提高了其溶解度。但物理降解法產率相對較低，生產成本較高，難以進行大規模生產[4]?；瘜W降解則使用鹽酸、硫酸以及過氧化氫等試劑[53?54]，通過斷裂糖苷鍵的方式得到低分子量葡聚糖。研究人員將酵母β-葡聚糖溶于45%的硫酸溶液中，經過3 h 的酸處理后，得到了低分子量的酵母β-葡聚糖，并提高了其水溶性[55]。由于化學降解通常需加入強酸、強堿或強氧化性的化學溶劑使分子間的糖苷鍵斷裂，在過程中會產生大量的有機廢液，造成環境污染，也不利于工業化生產。在另一項研究中，Duan 等[56]則利用酶降解的方法將海帶多糖進行水解，獲得了分子量在360～900 Dal 的低分子量海帶多糖。酶降解是利用發酵獲得的多糖或直接使用多糖粉末制成水溶液，然后加入β-葡聚糖進行水解，經過分離提純等一系列步驟后，最終完成低分子量葡聚糖的制備（圖4）。酶解法具有溫和高效及低污染的特點，但其制備的工藝還有待進一步優化，產生更大的經濟效益。

圖4 低分子量葡聚糖制備的一般流程Figure 4 General procedures for the preparation of low molecular weight glucan

3.3 低分子量葡聚糖的酶解法制備工藝優化

酶解反應是現階段制備低分子量葡聚糖的較為理想方法。但通過單一菌株發酵產生多糖后，再利用β-葡聚糖解進行酶解制備寡糖的方法往往效率低。由于葡聚糖的水不溶性，水解酶無法充分發揮作用然而，微生物共培養的出現很大程度上為這些問題提供了解決方案。共培養是指2 個或2 個以上不同有機體在自然或合成培養基中共同生長的一種生物系統[58]。通過共培養發酵，能在產生高分子β-葡聚糖的體系中，同時由另一種微生物產生β-葡聚糖酶來對前者進行酶解，這既能夠有效克服直接利用酶水解多糖時效率不高的問題，同時還能在一定程度上降低生產成本、簡化操作和縮短生產周期等。 例如，Wu 等[59]將能夠分泌內切β‐1，3-葡聚糖酶的哈茨木霉（Trichoderma ha.zianum）分別與分泌硬葡聚糖的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）以及分泌裂褶多糖的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）進行共培養，成功建立了利用哈茨木霉的共培養體系，最終得到了分子量為850～2 000 Da 的低分子量硬葡聚糖和分子量為850～2 500 Dal 的低分子量裂褶多糖。Gao 等[60]則將來自哈茨木霉的內切β‐1，3‐葡聚糖酶基因通過畢赤酵母進行表達，然后與能產生熱凝膠多糖的農桿菌（Agrobacterium）建立共培養體系，當畢赤酵母和農桿菌的接種比（菌種含量或濃度）為2∶1 時，在7 L 發酵罐中達到的最高產率達到了18.77 g/L，并且得到了分子量為500～1 700 Da的低分子量熱凝膠多糖。

與傳統生產工藝相比，共培養發酵步驟相對簡單且效率更高，有望能夠取代傳統的生產步驟。然而，目前共培養發酵還存在一些問題，例如兩種微生物的接種比例、接種時間以及底物是否適合多種微生物的生長共培養等[61?62]。而且系統的微小變化可能會改變整個微生物系統的行為，破壞協同平衡的穩定狀態，導致產品損失[63]。這需要更加靈敏的實時監控設備，例如嘗試使用拉曼光譜生物過程分析系統監控發酵進程。另外，可以利用合成生物學和代謝工程的方法對所需要的共培養菌株進行修飾，以提高它們個體的能力以及對底物的利用[61]。

4 展望

綜上所述，低分子量的β-葡聚糖因其獨特的生理活性，受到了越來越多科研人員的關注。然而，生產過程中存在的各種問題嚴重限制了其工業化生產和商業化。在低分子量葡聚糖的工業化生產中，酶解法具有溫和、高效以及不污染環境等特點，展現出獨特的優勢。因此，開發具有高酶活性、高熱穩定性和高pH 耐受性的β-葡聚糖酶成為解決問題的關鍵。目前，β-葡聚糖酶的產酶菌株的篩選和β-葡聚糖酶基因的修飾和異源表達都取得了一定的進展。采用酶的理性設計和定向進化能夠為高活性的β‐1，3-葡聚糖酶的制備奠定基礎，因為催化口袋中氨基酸的結構改變可能增強酶與底物的相互作用，從而間接提高了β‐1，3‐葡聚糖酶的活性。此外，Cas9 技術與合成生物學的結合為β‐1，3-葡聚糖酶在宿主菌中增強表達提供了強大的助力。由于酵母、枯草芽孢桿菌等表達系統可使β‐1，3-葡聚糖酶胞外分泌，將更利于β‐1，3-葡聚糖酶分離純化，提高葡聚糖酶的產量。然而，這仍然不能滿足醫藥化工等多個領域應用的需求?？梢灶A期，隨著合成生物學、系統生物學、基因組學以及代謝工程等技術的發展，對β-葡聚糖酶代謝調控機制的研究將進一步深入，低分子量葡聚糖的生產技術將取得實質性突破。