高壓電擊傷小鼠的血液代謝組學研究

陳思羽,王 徽,羅 燕,陶嘉雯,張文娟,岳 洋,余爭平,皮會豐 （陸軍軍醫大學軍事預防醫學系軍隊勞動衛生學教研室/教育部電磁輻射醫學防護重點實驗室，重慶 400038）

電工作業是通用的特種作業之一，分為高壓電工作業、低壓電工作業和防爆電器作業。高壓電工作業的職業危險因素主要是高壓電擊傷，高壓電擊傷的死亡率高，發生率呈逐年遞增的趨勢[1-2]。生物體遭受電擊是一個復雜的生理過程，高壓電擊傷涉及多系統損傷，包括中樞神經系統、心血管系統、血液系統、內分泌系統、視覺系統、生殖和遺傳效應等[3-6]。高壓電擊傷對血液系統的影響表現為凝血功能異常[7]、血小板相關因子和血小板聚集數改變[8]等，其損害血液代謝活動的機制至今尚無清晰準確的科學論述，本研究通過高壓電擊傷后小鼠的血液代謝組學變化，揭示高壓電擊傷對全身血液代謝活動的潛在危害。

代謝組學是系統生物學的重要組成部分，也是目前組學領域研究熱點之一[9-10]。氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)和液相色譜- 質譜（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS)是目前代謝組學檢測的主流技術，具有靈敏度高、定性能力強、穩定可靠等特點，主要用于分析揮發性和熱穩定性代謝物[11]。LC-MS 具有高通量、高分辨率、高靈敏度等特點，適用于分析難揮發或熱穩定性差的代謝物[12]。GC-MS和LC-MS聯用能相互補充代謝信息，提高代謝組學檢測的覆蓋度，獲取更加全面的代謝物及其豐度信息，增加可靠性[13]。本研究的小鼠血清樣本代謝組學采用GC-MS 和LC-MS 聯合分析，通過非靶向代謝組學，篩選出電擊組和對照組的差異代謝物并分析其對應的代謝通路，揭示可能存在的調控作用與機制，為進一步探索高壓電擊對血液系統代謝活動的損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級C57BL/6J雄性小鼠，6周齡，體質量20 g，購自陸軍軍醫大學實驗動物中心[SCXK(渝)2022-0011]，本研究的實驗設計、實驗過程及動物處死方法均由陸軍軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會審核通過（AMUWEC20226182）。小鼠飼養環境溫度為20～25 ℃，濕度為50%～60%，適應性飼養1 周后隨機分為電擊組（ES）和對照組（Con），每組10只。

電擊組：按1.2 g/kg 烏拉坦的劑量進行腹腔麻醉后，固定小鼠并充分暴露已備皮的顱頂區域，用電擊裝置（型號K98，江蘇柯林，電極片分別對稱置于小鼠頭頂兩側，持續穩定輸出電壓20 kV）持續電擊小鼠頭部5 s，用眼球取血法收集血液至含抗凝劑EDTA 的EP管中，室溫靜置2 h，于4 ℃以3 000 r/min離心15 min，取200 μL上層血清樣品，-80 ℃保存。

對照組：按1.2 g/kg 烏拉坦的劑量進行腹腔麻醉后，固定小鼠并充分暴露已備皮的顱頂區域，用電擊裝置（型號K98，江蘇柯林，電極片分別對稱置于小鼠頭頂兩側，持續穩定輸出電壓20 kV）的聲光刺激小鼠5 s，用眼球取血法收集血液至含抗凝劑EDTA 的EP管中，室溫靜置2 h，于4 ℃以3 000 r/min 離心15 min，取200 μL上層血清樣品，-80 ℃保存。

1.2 主要材料與試劑

葡萄糖測定試劑盒、糖化血清蛋白測定試劑盒、三酰甘油（triglyceride，TG）測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL）測定試劑盒、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）測定試劑盒購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；L-2-氯苯丙氨酸購自上海恒創生物科技有限公司；正己烷購自德國CNW 公司；吡啶購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯仿購自上海泰坦科技股份有限公司；BSTFA 購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；O-甲基羥胺鹽酸鹽購自上海麥克林生化科技股份有限公司；辛酸甲酯標準品、十六烷酸甲酯/棕櫚酸甲酯(C16:0)標準品購自德國DR.Ehrenstorfer 公司；壬酸甲酯(C9:0)標準品、癸酸甲酯(C10:0)標準品、十二烷酸甲酯/月桂酸甲酯(C12:0)標準品、十四烷酸甲酯/肉豆蔻酸甲酯(C14:0)標準品、十八烷酸甲酯/硬脂酸甲酯(C18:0)標準品、二十烷酸甲酯/花生酸甲酯(C20:0)標準品、二十二烷酸甲酯/山俞酸甲酯(C22:0)標準品、二十四烷酸甲酯/木蠟酸甲酯(C24:0)標準品購自美國Nu-chek公司；純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司。

1.3 血清生化指標分析

測定高壓電擊后小鼠的HDL、LDL、血糖（blood glucose，GLU）、糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）、膽固醇（cholesterol，CHO）、TG 等血清生化指標。

1.4 代謝組學分析

本研究的代謝組學方法主要參考文獻[14]，具體流程見圖1。采用無監督的主成分分析法（principal components analysis，PCA）反映數據的原始情況，采用有監督的正交偏最小二乘法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）分析模型內部不同組別之間的差異，并對模型進行驗證，隨后通過數據庫進行差異代謝物篩選，最后進行相關性分析和代謝通路富集。

圖1 代謝組學流程圖

1.5 數據分析及統計學處理

首先將采集到的質譜原始數據用AbfConverter 軟件進行數據轉換，然后用MS-DIAL 和Progenesis QI 軟件進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化處理，R 軟件分析。本研究的小鼠血液代謝組學采用無監督的PCA 模型觀察各樣本之間的總體分布，電擊組和對照組代謝輪廓的總體差異采用有監督的OPLS-DA 模型進行分析，差異代謝物的檢索數據庫為LUG 數據庫、EMBD 數據庫和KEGG 數據庫。血清生化指標運用SPSS 22.0 軟件進行獨立樣本t檢驗，所有數據以均數±標準差（）表示，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高壓電擊小鼠的表現

小鼠電擊前處于麻醉狀態，高壓電擊時小鼠全身肌肉緊張，四肢強直甚至站立，眼球突出、充血，部分小鼠出現甩尾動作；電擊結束后，小鼠全身肌肉松弛，尾柔軟，開始張口，深快喘氣，出現非自主的凝視、頻繁點頭、咀嚼、嘴和面部節律性抽動，部分小鼠頭皮點狀出血。

2.2 血清生化指標結果

電擊組與對照組小鼠的HDL、LDL、GLU、GSP、CHO、TG比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 血清生化指標圖

2.3 GC-MS和LC-MS檢測電擊后的血液代謝譜分析

無監督的PCA 和有監督的OPLS-DA 分析結果顯示，在無監督和有監督狀態下電擊組和對照組均能區分。在無監督狀態下，運用GC-MS 技術分析的第一主成分和第二主成分分別為36.3%和15.3%（圖3a），對照組的其中一個樣本與電擊組區分不太明顯；運用LC-MS 技術分析的第一主成分和第二主成分分別為30.7%和8.6%（圖3b），電擊組有兩個樣本與對照組差異不太明顯。為了更好地確立樣本關系，消除隨機誤差和組內誤差，本研究采用有監督的OPLS-DA 分析，結果顯示，GC-MS的代謝譜第一主成分和第二主成分分別為34.7%和17.9%（圖3c），電擊組和對照組區分明顯，LC-MS 的代謝譜第一主成分和第二主成分分別為31.2%和24.1%（圖3d），電擊組和對照組區分明顯。

圖3 GC-MS和LC-MS的PCA、OPLS-DA模型圖

2.4 OPLS-DA模型驗證

為了考察OPLS-DA 模型的質量，本研究采用7 次循環交互驗證和200 次響應排序檢驗的方法來驗證，見圖4。GC-MS 代謝組學和LC-MS 代謝組學的R2 和Q2 值見圖4a、b。Splot 圖結果表明，GC-MS 和LC-MS電擊組和對照組的差異程度較大，可靠程度較高。綜合分析Permutation和Splot結果，本研究的OPLS-DA模型不存在過度擬合的情況，此模型計算的數據可靠。

圖4 GC-MS和LC-MS模型驗證和Splot圖

2.5 差異代謝物分析

本研究基于OPLS-DA 模型，篩選出與高壓電擊密切相關的差異代謝物（圖5）。GC-MS 篩選的差異代謝物主要有羧酸及其衍生物（22.71%）、二氮雜苯類（2.79%）、脂肪?；?3.55%）、羥基酸及其衍生物（3.98%）、吲哚及其衍生物（2.39%）、酮酸及其衍生物（2.79%）、有機氮化合物（2.79%）、有機氧化合物（25.50%）、類固醇和類固醇衍生物（3.19%）、其他類（20.32%），見圖5a；LC-MS 篩選的差異代謝物有苯及其取代衍生物（5.95%）、羥基酸及其衍生物（13.98%）、脂肪?；?6.62%）、甘油磷脂（6.24%）、有機氮化合物（1.90%）、有機氧化合物（7.53%）、丙烯酰酯類（4.66%）、類固醇和類固醇衍生物（3.56%）、其他類（39.56%），見圖5b。

圖5 GC-MS和LC-MS差異代謝物

本研究采用多維分析和單維分析相結合的方法篩選差異代謝物，篩選標準為第一主成分的變量權重值＞1，且t檢驗的P＜0.05，結果顯示，差異代謝物共415種，其中GC-MS平臺篩選出91種：上調57種，下調34種（圖5c）；LC-MS平臺篩選出324種：上調130種，下調194種（圖5d）。為了展示樣本之間的關系及代謝物在不同樣本之間的表達差異，本研究對所有顯著差異代謝物按照VIP排序前50進行了層次聚類分析，見圖5e、f。

2.6 相關性分析和代謝通路富集

結合GC-MS 和LC-MS 差異代謝物結果，按照第一主成分的變量權重值排序的前20 對顯著差異代謝物進行相關性分析（圖6a），并基于KEGG 數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析（圖6b、c）。排名前20的代謝通路分別是癌癥中心碳代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，檸檬酸鹽循環，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，不飽和脂肪酸的生物合成，胰高血糖素信號通路，丁酸鹽代謝，近端小管碳酸鹽回收通路，賴氨酸降解，氨酰-tRNA生物合成，腎細胞癌，味覺傳導通路，組氨酸代謝，鞘磷脂信號通路，泛酸鹽和輔酶A生物合成，氧化磷酸化，ABC轉運蛋白，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，戊糖磷酸途徑。

圖6 相關性分析和代謝通路富集圖

3 討論

近年來高壓電擊傷頻發，主要好發于高壓電工、鐵道工人、建筑工人等人群，高壓電擊可引起肢體損傷[14]、腹壁損傷[15]、電擊部位局部和全身性損傷[16]等，高壓電擊傷的血液損害包括局部血液流變學改變[17]、血小板流變學變化[18]，其對血液代謝活動的影響尚不清楚，因此，研究高壓電擊傷的血液代謝組學具有重要的臨床意義。本研究的高壓電擊小鼠模型與文獻報道的電擊動物模型方法類似[19-20]，小鼠高壓電擊后的表現與大鼠電擊后的表現相仿[21]，本研究的小鼠高壓電擊模型可成功應用于血液代謝組學研究。

既往研究表明，高壓電擊傷后血清肌酸激酶和肌紅蛋白水平明顯升高，血清中腦鈉素前體水平與高壓電擊傷后死亡率密切相關[22]；也有研究表明，高壓電擊后血清肌酸激酶的升高對組織損傷程度具有一定的預測價值[23]；本研究中高壓電擊小鼠血清GLU、GSP、CHO、TG、HDL、LDL 等生化指標無明顯變化，表明高壓電擊對小鼠的此類血清生化指標沒有影響或影響是可逆性的。本研究通過非靶向代謝組學對小鼠高壓電擊模型血清進行差異代謝物及相關代謝通路分析，從代謝組學角度研究高壓電擊引起小鼠血液中的代謝物變化，通過GC-MS平臺篩選出了91種差異代謝物，通過LC-MS 平臺篩選出了324 種差異代謝物。將各自的差異代謝物分別進行KEGG 分析發現，差異代謝物均富集到的代謝通路有癌癥中心碳代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，檸檬酸鹽循環。癌癥中心碳代謝是生物體所需能量的主要來源，并為體內其他代謝提供前體物質，傳統意義上包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑以及三羧酸循環。三羧酸循環是糖、蛋白質和脂肪徹底氧化分解的共同途徑，蛋白質的水解產物（如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等脫氨后或轉氨后的碳架）要通過三羧酸循環才能被徹底氧化，產生大量能量[24-25]，這可能與高壓電擊后機體的應激反應有關。本研究中血液代謝組學富集到的代謝通路揭示高壓電擊傷會引起血液中碳代謝出現顯著改變。有研究表明，兔脛骨前肌受到28 d 的慢性電刺激后，肌肉淺表中檸檬酸循環和脂肪酸氧化的酶活性增加了5～6 倍[26]。進一步說明高壓電擊傷可能通過引起肌肉損傷造成血液中檸檬酸循環的改變。在GC-MS 中篩選到的差異代謝物會顯著富集到胰高血糖素信號通路。既往報道顯示，電擊傷可以引起機體產生高鉀血癥，當血液中K+濃度上升到1 mmol/L 以上時會直接刺激胰島素釋放，胰島素增多可以促進骨骼肌攝取細胞外液中的K+，因而在高鉀血癥時有代償意義[27]。研究表明，高鉀血癥可以直接刺激胰高血糖素的分泌，而胰高血糖素與胰島素共同維持血糖的調節[28]。所以，高壓電擊傷可能會通過引起高鉀血癥間接刺激胰高血糖素分泌。

綜上所述，高壓電擊傷引起的血液代謝活動變化可能與癌癥中心碳代謝、胰高血糖素信號通路等有關。本實驗僅對代謝物的改變進行通路富集分析，未涉及高壓電擊引起的代謝物改變機制，其具體機制還有待進一步探究。