金絲桃甙對百草枯誘導的大鼠急性肺損傷的保護作用

武 卓,陳 樂,王卿語,古春昱,陳新軍 （. 陜西省人民醫院醫學裝備部，陜西 西安 70068；. 陜西省人民醫院急診內科，陜西 西安 70068）

百草枯（paraquat,PQ）是世界上最常用的除草劑之一，然而，全球每年都有大量民眾死于百草枯中毒，肺是百草枯的主要損傷目標[1-2]。百草枯誘導的肺毒性與炎癥、氧化應激、細胞凋亡和纖維化相關的各種機制途徑有關[3]，其中核因子紅細胞2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）途徑[4]、核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）途徑[5]和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad2/3途徑[6]分別在百草枯誘導的氧化應激、炎癥和纖維化中發揮調控作用。金絲桃甙（hyperoside,HYP）是一種存在于金絲桃屬植物中的天然黃酮醇甙，分子量為464.38，分子式為C21H20O12，具有廣譜的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、器官保護等作用[7]，還具有良好的抗心[8]、肝[9]、腎[10]纖維化作用。此外，金絲桃甙可減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化[11]。推測金絲桃甙可能是一種防治百草枯誘導的肺損傷的天然藥物。因此，本研究探討金絲桃甙對百草枯致大鼠急性肺損傷的保護作用以及其可能的分子機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

20%百草枯溶液購自美國Syngenta 公司。金絲桃甙（純度99.56%，批號：HY-N0452-62235）購自美國MedChemExpress 公司。蘇木精-伊紅（HE）染液（批號：20181107）購自南京建成生物工程研究所。Masson三色染色液（批號：20200418）購自北京索萊寶科技有限公司。白細胞介素（interleukin,IL）-1β ELISA 試劑盒（批號：20191016）購自北京普利萊基因技術有限公司。IL-6 ELISA 試劑盒（批號：20210604）購自派普泰克生物科技（蘇州）有限公司。巨噬細胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protin-2,MIP-2）ELISA 試劑盒（批號：20210923）購自上海喬羽生物科技有限公司。丙二醛（malondialdehyde,MDA）試劑盒（批號：0517191107）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒（批號：0625201005）購自碧云天生物技術研究所。E-cadherin（批號：20180503）、α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA；批號：20100822）、Vimentin（批號：20200415）、GAPDH（批號：20190607）一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。Nrf2（批號：190416）、NF-κB p65（批號：201209）、p-NF-κB p65（批號：191106）、TGF-β1（批號：180828）、Smad3（批號：210305）、p-Smad3（批號：210417）一抗及HRP 偶聯的IgG二抗（批號：180624）購自英國Abcam公司。

1.2 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，7 周齡，體質量220～250 g，購自陜西師范大學[生產許可證號：SCXK（陜）2021-002]。飼養環境：溫度（23±2）℃，濕度（55±5）%，12 h 光暗循環。飼養期間不限制飲食。本研究通過我院醫學倫理委員會批準（2021-10-D07）。

1.3 大鼠分組及處理

將大鼠隨機分為對照組、PQ 組、低劑量金絲桃甙組（HYP-L 組）、中劑量金絲桃甙組（HYP-M 組）和高劑量金絲桃甙組（HYP-H組），每組12只。對照組大鼠一次性灌胃蒸餾水1 mL，其他組大鼠分別一次性灌胃1 mL 百草枯（終使用劑量為50 mg/kg）。灌胃30 min后，對照組和PQ 組大鼠灌胃2%二甲基亞砜（DMSO）1 mL；參考文獻[9,12]，HYP-L 組、HYP-M 組和HYP-H組大鼠分別灌胃金絲桃甙100 mg/kg、200 mg/kg 和400 mg/kg，每天1次，共7 d。

1.4 大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中IL-1、IL-6和MIP-2的測定

治療7 d 后，大鼠左氣管插管，PBS 灌洗肺3 次，收集BALF，于4 ℃下以1500 r/min 離心15 min，取上清。通過ELISA 法測定BALF 中IL-1、IL-6 和MIP-2 的水平。

1.5 大鼠肺組織中SOD和MDA的測定

治療7 d 后，采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開胸取兩側肺，右肺研磨制備勻漿，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清。按照試劑盒說明書檢測肺組織中SOD和MDA的水平。

1.6 大鼠肺組織學染色

用4%多聚甲醛固定大鼠左肺，常規制備4 μm 厚的石蠟切片。通過HE 染色觀察肺組織形態，通過Masson 三色染色觀察肺纖維化情況，并進行纖維化評分[13]。

1.7 免疫組織化學染色

大鼠肺組織切片脫蠟和再水化后，用3%過氧化氫室溫孵育15 min，0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）煮沸15 min，5%BSA 和0.03%Triton X-100室溫封閉30 min。將切片在4 °C 下與Nrf2、p-NF-κB p65 和TGF-β1一抗（1∶500）孵育過夜。然后，將切片在37 °C下與HRP 偶聯的IgG 二抗（1∶500）孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染。在Olympus BX51光學顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測積分光密度（integral optical density,IOD）值。

1.8 Western blot檢測

使用RIPA 裂解液和BCA 試劑盒分離和測定大鼠肺組織總蛋白。各組取等量的蛋白質（60 μg）經10%SDS-PAGE 電泳分離并轉移到PVDF 膜。室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，將膜在4 ℃下與E-cadherin（1∶2 000）、α-SMA（1∶2 000）、Vimentin（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶3 000）、p-NF-κB p65（1∶3 000）、TGF-β1（1∶5 000）、Smad3（1∶5 000）、p-Smad3（1∶5 000）和GAPDH（1∶3 000）一抗孵育過夜。隨后在室溫下將膜與HRP 偶聯的IgG 二抗（1∶2 000）孵育1 h。免疫條帶用ECL 試劑盒顯影。用Image J 軟件分析灰度值，GAPDH作為內參蛋白。

1.9 統計學分析

數據使用SPSS 22.0 統計軟件分析處理。計量數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金絲桃甙抑制百草枯誘導的大鼠肺部炎癥反應

與對照組比較，PQ 組大鼠BALF 中IL-1β、IL-6 和MIP-2 水平升高（P＜0.05）；與PQ 組比較，HYP-L 組、HYP-M 組和HYP-H 組大鼠BALF 中IL-1β、IL-6 和MIP-2 水平降低（P＜0.05），變化趨勢具有金絲桃甙劑量依賴性（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠BALF中IL-1β、IL-6和MIP-2水平（，n=12，nmol/L）

表1 大鼠BALF中IL-1β、IL-6和MIP-2水平（，n=12，nmol/L）

*：與對照組比較，P＜0.05；#：與PQ組比較，P＜0.05；△：與HYP-L組比較，P＜0.05；▲：與HYP-M組比較，P＜0.05

?

2.2 金絲桃甙抑制百草枯誘導的大鼠肺部氧化應激反應

與對照組比較，PQ組大鼠肺組織中SOD水平降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05）；與PQ 組比較，HYP-L 組、HYP-M 組和HYP-H 組大鼠肺組織中SOD水平升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05），變化趨勢具有金絲桃甙劑量依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 大鼠肺組織中SOD和MDA水平（，n=12）

表2 大鼠肺組織中SOD和MDA水平（，n=12）

*：與對照組比較，P＜0.05；#：與PQ組比較，P＜0.05；△：與HYP-L組比較，P＜0.05；▲：與HYP-M組比較，P＜0.05

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2.3 金絲桃甙減輕百草枯誘導的大鼠肺損傷和纖維化

HE 染色結果顯示，對照組大鼠肺組織形態正常；PQ組大鼠肺組織出現肺泡出血，肺泡壁斷裂、增厚、間隔水腫，出現明顯炎癥細胞浸潤等病變；HYP-L 組、HYP-M組和HYP-H組大鼠肺組織損傷程度較PQ組減輕，見圖1a。Masson 三色染色結果顯示，對照組大鼠肺組織無纖維化；PQ 組大鼠肺組織出現明顯纖維化；HYP-L組、HYP-M組和HYP-H組大鼠肝組織纖維化程度較PQ 組減輕，見圖1a。各組大鼠肺組織纖維化評分結果顯示，與對照組比較，PQ 組大鼠肺組織纖維化評分升高（P＜0.05）；與PQ 組比較，HYP-L 組、HYP-M組和HYP-H組大鼠肺組織纖維化評分降低（P＜0.05），見圖1b。

圖1 大鼠肺組織HE染色和Masson三色染色

2.4 金絲桃甙抑制百草枯誘導的大鼠肺組織上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程

與對照組比較，PQ 組大鼠肺組織中E-cadherin 的表達水平降低（P＜0.05），α-SMA 和Vimentin 的表達水平升高（P＜0.05）；與PQ 組比較，HYP-L 組、HYP-M 組和HYP-H組大鼠肺組織中E-cadherin的表達水平升高（P＜0.05），α-SMA 和Vimentin 的表達水平降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測大鼠肺組織中E-cadherin、α-SMA和Vimentin的表達水平

2.5 金絲桃甙激活百草枯誘導的大鼠肺組織Nrf2信號通路并抑制NF-κB和TGF-β1/Smad2/3信號通路

與對照組比較，PQ組大鼠肺組織中Nrf2的蛋白表達水平降低（P＜0.05），TGF-β1 的蛋白表達水平以及NF-κB p65 和Smad3 蛋白的磷酸化水平均升高（P＜0.05）；與PQ組比較，HYP-L組、HYP-M組和HYP-H組大鼠肺組織中Nrf2 的蛋白表達水平升高（P＜0.05），TGF-β1 的蛋白表達水平以及NF-κB p65 和Smad3 蛋白的磷酸化水平均降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 Western blot檢測大鼠肺組織中Nrf2、p-NF-κB p65、NF-κB p65、TGF-β1、p-Smad3和Smad3的蛋白表達水平

與對照組比較，PQ 組大鼠肺組織中Nrf2的IOD 值降低（P＜0.05），p-NF-κB p65 和TGF-β1 的IOD 值均升高（P＜0.05）。與PQ 組比較，HYP-L 組、HYP-M 組和HYP-H 組大鼠肺組織中Nrf2 的IOD 值升高（P＜0.05），p-NF-κB p65 和TGF-β1 的IOD 值均降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 免疫組化染色檢測大鼠肺組織中Nrf2、p-NF-κB p65和TGF-β1的蛋白表達

3 討論

本研究使用3個劑量（100、200、400 mg/kg）的金絲桃甙治療百草枯誘導的肺纖維化大鼠模型，結果顯示，金絲桃甙呈劑量依賴性地減輕了百草枯誘導的大鼠肺損傷和纖維化，提示金絲桃甙可能是一種治療百草枯中毒的天然藥物。有研究報道，金絲桃甙具有對心肌[8]、肝[9]、腎[10]和肺[11]的抗纖維化作用。結合本研究結果可知，金絲桃甙可能是一種良好的抗纖維化天然藥物，具有較高的研究開發價值。

過度的氧化應激和炎癥反應是百草枯誘導肺損傷和纖維化的重要病理過程[14-15]。本研究結果顯示，金絲桃甙上調了大鼠肺組織中抗氧化酶SOD 水平，下調了膜脂質氧化產物MDA水平，有效緩解了百草枯誘導的肺氧化應激。此外，金絲桃甙下調了大鼠BALF中炎癥細胞因子IL-1β[16]和IL-6[17]以及炎癥細胞趨化因子MIP-2[18]水平，抑制了炎癥反應。因此，金絲桃甙可能通過抑制氧化應激和炎癥反應減輕百草枯誘導的肺損傷和纖維化。

EMT 在百草枯誘導的肺纖維化中起著至關重要的作用[19]。百草枯可增強大鼠肺組織中EMT 標志物的表達，包括α-SMA 和Vimentin[19]。有研究報道，金絲桃甙可抑制EMT 過程[11]。本研究結果顯示，金絲桃甙上調了大鼠肺組織中E-cadherin 的表達水平，下調了α-SMA 和Vimentin 的表達水平，有效抑制了肺組織EMT。

Nrf2是一種可調節抗氧化系統組成成分的轉錄因子，在活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除中起著關鍵作用。雖然百草枯可誘導Nrf2 的激活和抗氧化相關基因的轉錄，但內源性Nrf2 的激活不足以消除百草枯誘導的細胞損傷[14]，并且百草枯僅在3 h 內誘導Nrf2 的表達，隨著中毒時間的延長，Nrf2 的活性降低[20]。因此，尋找新的依賴于Nrf2 的抗氧化劑是百草枯新藥研發的關鍵。本研究結果顯示，金絲桃甙誘導了大鼠肺組織中Nrf2 的表達，提示金絲桃甙可能通過激活Nrf2 信號通路清除ROS，從而減輕百草枯誘導的氧化應激。目前，金絲桃甙激活Nrf2 信號通路的作用已被廣泛報道，本研究觀點與之一致[21-23]。

NF-κB信號通路在百草枯誘導的肺損傷和炎癥中起重要作用。據報道，百草枯誘導IκB 家族的抑制蛋白IκBα 降解和磷酸化，從而增加肺組織中NF-κB p65的水平[24]。此外，NF-κB 信號通路的激活與百草枯觸發的ROS 的產生有關[15]。本研究結果顯示，金絲桃甙抑制了大鼠肺組織NF-κB 信號通路的活化，進而減輕了炎癥反應。目前，金絲桃甙抑制NF-κB 信號通路的作用也已被廣泛報道[25-26]。

TGF-β/Smad 信號通路是抗肺纖維化治療的有效靶點，已被證明在體內和體外參與百草枯誘導的EMT[19]，其通過調節EMT 誘導纖維化[27]。有研究表明，金絲桃甙通過抑制TGF-β1/Smad通路減輕大鼠肝纖維化[9]。本研究結果顯示，金絲桃甙抑制了大鼠肺組織TGF-β1/Smad2/3 信號通路的激活，從而抑制了百草枯誘導的大鼠肺纖維化。

綜上，金絲桃甙可有效減輕百草枯誘導的大鼠急性肺損傷，其可能是通過調節Nrf2、NF-κB 和TGF-β1/Smad2/3信號通路減輕肺部氧化應激、炎癥和纖維化。