基于生物信息學分析肝纖維化的關鍵基因及相關通路研究

張臘英,何安玲,陳明鍇 （武漢大學人民醫院消化內科，湖北 武漢 430060）

肝纖維化是肝發生廣泛的慢性損傷后引起肝修復愈合失調的過程。在慢性病毒性肝炎、膽源性肝病、乙醇、自身免疫性肝炎和非酒精性肝病等的作用下，肝細胞損傷后激活靜止的肝星狀細胞（hepatic stellate cells,HSC）并轉化為具有增殖、遷移和收縮能力的肌成纖維細胞。纖維化細胞外基質（extracellular matrix,ECM）主要由肌成纖維細胞產生，如Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維、彈性蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖等，這些細胞具有促進纖維化轉錄和分泌的特性，在纖維化和炎癥反應過程中起關鍵作用[1]。肝纖維化進展是增加慢性肝病患病風險的重要因素。然而肝纖維化的發生與進展通常較為隱匿，大部分肝纖維化患者會在15～20年進展為肝硬化[2]。肝硬化是進行性肝纖維化的終末期階段，其并發癥如食管胃底靜脈曲張出血、難治性腹水、肝性腦病和肝癌等疾病會加速肝硬化的進展[3]。在去除致病因子后肝纖維化過程可能發生逆轉，但逆轉過程通常較為緩慢或不明顯[4]。許多抗肝纖維化研究的藥物在動物模型中有較好的抗纖維化效果，但在臨床試驗中效果不甚顯著[5]。當前臨床仍缺乏有效且特異的抗肝纖維化藥物，因此探索肝纖維化機制并尋找潛在藥物治療靶點具有重要的臨床和社會意義。

本研究通過生物信息學分析肝纖維化樣本與健康肝樣本的差異表達基因，以期發現肝纖維化中相關信號通路和關鍵基因，為早期肝纖維化的檢測和診斷提供新的證據支持，為抗肝纖維化的藥物治療提供潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從GEO 數據庫（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）GPL28576平臺中獲得基因表達譜GSE197112，包含4個肝纖維化組織樣本和4個正常肝組織樣本。

1.2 篩選差異表達基因

Limma（linearmodels for microarray data, DOI:10.1093/nar/gkv007）是一種基于廣義線性模型的常用差異表達篩選方法。通過Limma 篩選差異表達基因，將GSE197112 數據集中的數據分為肝纖維化組和非肝纖維化組。設置P值和差異倍數（fold change，FC）進行差異表達基因的篩選。P＜0.01，∣Log2FC∣＞1.5時為差異具有統計學意義。使用R語言繪制火山圖和熱圖。

1.3 功能富集和通路分析

DAVID 是一個公共生物信息學數據庫[6]，其在線分析工具可對大量基因或蛋白快速進行處理并得出綜合性生物功能注釋信息[7]。本研究將差異表達基因中的上調基因和下調基因分別導入DAVID 數據庫，以P＜0.05為標準進行篩選。

1.4 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）網絡分析及關鍵基因篩選

STRING（http://string-db. org/）是一個收集了近百萬種蛋白種類及蛋白之間相互作用信息的數據庫，可以在線分析蛋白相互作用。將獲取的差異表達基因導入STRING 數據庫以評估其PPI 關系，運用Cytoscape(V3.9.1)中MCODE 插件提取PPI 網絡圖中的關鍵蛋白模塊，取前5位基因為關鍵基因，并構建關鍵基因間的PPI 網絡[8]。同時通過Cytoscape 軟件中的插件CytoHubba篩選肝纖維化靶點基因。

2 結果

2.1 篩選差異表達基因

通過R4.2.0軟件對GSE197112進行提取及處理，結果顯示，在該數據集中存在300 個與肝纖維化相關的下調基因和99 個與肝纖維化相關的上調基因。使用R 軟件繪制肝纖維化差異表達基因表達的火山圖（圖1）和熱圖（圖2）。

圖1 差異表達基因火山圖

圖2 聚類熱圖

2.2 功能富集分析和通路分析

利用DAVID 在線分析工具對肝纖維化數據集中差異表達基因的生物過程、基因的分子功能和細胞組分進行富集分析，差異表達基因主要涉及的生物過程包括有絲分裂檢驗點、染色體分離、細胞分裂、適應性免疫應答、有絲分裂紡錘體組織、DNA 復制、細胞凋亡過程、有絲分裂紡錘體微管附著在動粒上、免疫應答、中板集合。細胞組分相關分析顯示，差異表達基因主要參與動粒、染色體著絲粒區、細胞外空間、細胞外區域、網管復合體、濃縮染色體外動粒、中心體、Ndc80復合體、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、網格蛋白介導的胞吞作用。差異表達基因主要參與的基因的分子功能包括蛋白質結合、MHC Ⅱ類受體活性、鈣離子結合、微管結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶激活劑活性、ATP依賴性微管運動活動、模式識別受體活性（圖3）。KEGG分析顯示，差異表達基因主要富集于細胞周期、p53 信號通路、人T 細胞白血病病毒1 感染、孕酮介導的卵母細胞成熟、產生IgA 的腸道免疫網絡、抗原處理和呈遞、癌癥轉錄失調、細胞黏附分子等途徑（圖4）。

圖4 KEGG富集通路分析及相關基因

2.3 PPI網絡生成及關鍵基因篩選

利用STRING 數據庫構建肝纖維化中差異表達基因表達產物的PPI 網絡（圖5）。使用Cytoscape 可視化軟件根據Degree 值繪制PPI 網絡可視化圖（圖6）。利用Cytoscape 軟件中MCODE 插件，根據邊和節點的關系，建立關鍵蛋白模塊PPI 網絡（圖7a）。此外，使用CytoHubba 插件利用MCC 算法篩選排名前5 的關鍵基因，分別為：TTK、KIF2C、ASPM、DLGAP5、PBK，其相互作用關系見圖7b。

圖5 PPI網絡分析圖

圖6 通過 Cytoscape軟件可視化PPI網絡的結果

圖7 PPI網絡5個模塊及hub基因

3 討論

肝纖維化是一個重大的全球公共衛生健康問題，肝纖維化進展到肝硬化和/或肝細胞癌是影響患者生活質量及預后的主要因素[9]。本研究運用生物信息學方法分析了肝纖維化患者的差異表達基因，使用GO富集分析和KEGG信號通路分析揭示了差異表達基因主要的生物學功能，發現了差異表達基因在肝纖維化發生發展中可能發揮的作用，有助于探索肝纖維化藥物治療的新靶點。

本研究通過KEGG信號通路分析發現肝纖維化差異表達基因富集在細胞周期信號通路。細胞周期信號通路是發生肝纖維化相關信號通路共同交匯的通路之一。Cyclin E1（CcnE1）是一種E型細胞周期蛋白，其在HSC 中大量表達，使細胞周期活性增加，參與HSC 的活化與增殖，促進細胞外基質合成和肝纖維化[10]。隨后有研究證明，抑制肝細胞和HSC 中CcnE1表達和細胞周期活性可顯著改善肝纖維化[11]。免疫相關途徑可能促進了肝細胞癌的發展，IgA 生成途徑的腸道免疫網絡信號通路參與了肝癌細胞的惡性生物學行為，有助于細胞的增殖和遷移，抑制該信號通路的激活可能是治療肝細胞癌的潛在機制[12]。孕酮介導的卵母細胞成熟信號通路與肝細胞癌的發生發展密切相關[13-14]?？乖幚砗统蔬f信號通路通過影響炎癥反應促進丙型肝炎病毒致癌過程[15]。HOXA9 具有介導細胞分化、凋亡、增殖、侵襲、轉移及代謝等功能[16]。本研究中HOXA9 富集在癌癥轉錄失調信號通路上，可能作為研究肝纖維化的潛在靶點。細胞黏附分子如鈣黏蛋白黏附家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族以及選擇素等形成了細胞-細胞和細胞-基質黏附[17]。在肝纖維化中，整合素是ECM、炎性細胞、成纖維細胞和實質細胞之間連接的主要節點，與組織纖維化的啟動、維持密切相關[18]。細胞黏附分子與肝纖維化相互影響，其能夠通過產生轉化生長因子-β（transforming growth factor beta,TGF-β）或介導白細胞遷移促進纖維化，肝慢性炎癥和纖維化過程中細胞黏附分子的表達水平會上調。整合素和纖維化的ECM 促進TGF-β 的釋放，TGF-β 繼而上調整合素的表達并激活HSC 分化為肌成纖維細胞，合成更多的纖維化ECM，進入組織纖維化的循環。研究發現，整合素抑制劑可在體內下調TGF-β 介導的信號通路，從而減少肝纖維化的發生[19]。大多數研究發現上述通路與肝癌的發生發展有關，而與肝纖維化的研究較少，肝纖維化中上述信號通路及差異表達基因可能成為肝纖維化治療的潛在靶點。

TTK 蛋白激酶由人單極紡錘體1 基因編碼，即單極紡錘體1 激酶，對于有絲分裂檢查點信號傳導和染色體穩定性至關重要。有絲分裂檢查點可控制細胞有絲分裂過程[20]。TTK 以p53 依賴性方式激活AKT 途徑促進細胞增殖和遷移，進而促進肝細胞癌的發生，在肝細胞癌中起著重要作用[21]。TTK 高表達的肝細胞癌患者生存率較低，抑制TTK 高表達能有效抑制肝細胞癌的發展[22-23]。ASPM 即異常紡錘體樣小頭畸形相關基因，其高表達可能與乙型肝炎的惡性進展有關，并且與肝細胞癌的預后不良有關[24]。KIF2C 是一種重要的有絲分裂調節因子，在有絲分裂過程中調節細胞周期[25]。KIF2C 與各種細胞周期相關蛋白相互作用，促進細胞生長。KIF2C過表達上調了細胞增殖和細胞周期的關鍵調節因子PCNA 和CDC20 的表達，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）途徑促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，最終促進肝細胞癌生長和轉移，并與預后不良相關[26-27]。DLGAP5 在肝細胞癌中的發展分子機制研究有限，DLGAP5參與細胞周期調節，與肝細胞癌患者的總生存期顯著相關，可能是肝細胞癌的潛在生物標志物[28]。PBK 是MAPK 家族的絲氨酸-蘇氨酸激酶，可調節細胞生存、增殖、生長、凋亡和炎癥[29]。PBK 在肝細胞癌中的表達與免疫細胞浸潤呈正相關，其高表達與較短生存期相關，有助于預測癌癥預后[30]。本研究確定的關鍵基因更多地集中在肝纖維化領域，而較少集中在肝細胞癌領域，這些基因有望成為肝纖維化藥物治療的新靶點。

綜上，本研究確定了肝纖維化399 個差異表達基因，成功構建了肝纖維化中差異表達基因的PPI網絡，并篩選出可能參與肝纖維化過程的5 個關鍵基因，為尋找肝纖維化新的治療靶點提供了思路，但未來需要通過實驗研究來驗證該結論。