miR-152-3p表達下調降低紫杉醇耐藥人卵巢癌細胞A2780T對紫杉醇的耐藥性

張洋，趙辰戈，程荔春，呂慧怡，3，吳迪

（1.大連醫科大學附屬第二醫院藥學部，遼寧大連 116023；2.大連醫科大學藥學院，遼寧大連 116044；3.大連科翔生物科技有限公司，遼寧大連 116085）

卵巢癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，長期以來其死亡率位居婦科腫瘤首位［1］?；瘜W療法是治療卵巢癌的首選手段，而化療耐藥是導致治療失敗的主要原因［2］。紫杉醇作為治療卵巢癌的一線藥物，發揮著不可或缺的作用，而耐藥性的產生限制了其臨床應用，其機制尚不明確［3］。

微RNA（microRNA，miRNA）是一組長度為21～25 個核苷酸的非編碼RNA，通過與互補靶向信使RNA 結合而抑制或降解信使RNA 翻譯［4］，在細胞分化、增殖和凋亡中發揮重要作用。研究報道，卵巢癌的發生發展與miRNA表達密切相關，miRNA可通過調控不同靶基因發揮抑癌或促癌作用［5-6］。例如，miR-212 和miR-31 在卵巢癌中低表達，可作為卵巢癌的標志基因［7-8］；miR-142-5p，miR-203 和miR-373通過靶基因影響卵巢癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲以及耐藥性［9-11］。

近幾年，miR-152 被較多關注，其與miR-148a和miR-148b共同構成miR-148/52家族［12］。miR-152功能復雜多樣，與多種癌癥的發生發展有關。據報道，胃癌中miR-152過表達可明顯抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡，抑制胃癌的發生發展［13］。miR-152-3p與卵巢癌發生亦密切相關。Li等［14］報道，miR-152-3p通過抑制酪氨酸激酶受體的編碼基因人表皮生長因子受體3（ERBB3）表達參與卵巢癌細胞增殖和轉移。He等［15］報道，早期生長反應因子1通過與自噬相關基因14（autophagy-related gene 14，ATG14）相互作用上調miR-152-3p 轉錄。ATG14是miR-152-3p調節自噬的功能靶基因，可抑制卵巢癌細胞增殖，并降低癌細胞對順鉑的耐藥性。然而，miR-152-3p 對紫杉醇卵巢癌耐藥細胞的影響尚未見報道。本研究探討miR-152-3p對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞A2780T 耐藥性的影響，以期為卵巢癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器

人卵巢癌A2780和A2780T細胞購自上海美軒生物科技有限公司?？俁NA 提取試劑Trizol、逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（中國TransGen Biotech公司）；MTT 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技公司）；Annexin Ⅴ/PI細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；miR-152-3p抑制物（上海吉瑪制藥有限公司）；兔抗人P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抗體、兔抗人多藥耐藥相關蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）、兔抗人三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2（ATP-binding cassette G2，ABCG2）、兔抗人BCL2關聯X蛋白（Bax）、兔抗人Bcl-2、兔抗人磷酸酯酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（一抗）（美國Abcam公司）；脂質體Lipo2000、胎牛血清、RPMI 1640 和辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔或鼠IgG 抗體（二抗）及miR-152-3p，U6，PTEN和GAPDH引物（表1）（美國Invitrogen 公司）。165-8001 電泳儀（美國BIO-RAD公司）和Countess?ⅡFL全自動細胞計數儀（美國Llfe Technologles 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）；Odyssey Dlx 雙色紅外激光掃描成像系統（美國LICOR公司）。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 細胞培養

A2780 和A2780T 細胞用RPMI 1640 培養基（含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素）于37 ℃，5% CO2和飽和濕度培養。A2780T 細胞用濃度為200 μg·L-1的紫杉醇培養以維持耐藥性。實驗前，A2780T 細胞棄藥培養7 d，以避免藥物毒性對實驗結果的干擾，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

取對數生長期的A2780和A2780T細胞接種于96 孔板，每孔1×104細胞，加入不同濃度紫杉醇（1.875，3.75，7.5，17 和23 μmol·L-1），同時設空白對照組（無細胞）和細胞對照組（無藥物），每組設3復孔。孵育48 h后加入MTT（5 g·L-1）50 μL繼續孵育4 h，每孔加入二甲亞砜150 μL，于570 nm 處測定吸光度值（A570nm）。細胞存活率（%）=（實驗組A570nm-空白對照組A570nm）/（細胞對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。采用Graphpad Prism 8.2.1 軟件計算IC50值，并計算耐藥指數（resistance index，RI）。RI=A2780T細胞IC50/A2780細胞IC50。

1.4 miR-152-3p抑制物和PTEN siRNA轉染A2780T細胞

用Lipo2000 對對數生長期的A2780T 進行瞬時轉染，miR-152-3p 抑制物、PTEN siRNA 及其相應陰性對照序列見表2。細胞轉染前1 d，細胞聚合度達90%，進行六孔板鋪板。將A2780T 細胞以3.0×108·L-1均勻鋪于六孔板，細胞聚合度達60%～70%時進行轉染。首先，每孔用PBS 1 mL 清洗2 次，加入無雙抗培養基1.5 mL。將miR-152-3p抑制物或PTEN siRNA 10 μL 及其相應陰性對照分別溶于250 μL無血清培養基中混勻，室溫靜置5 min；同時將Lipo2000 5 μL 溶于250 μL 無血清培養基中混勻，室溫靜置5 min。將2 種液體混勻，室溫放置20 min；隨后將混合液加入6 孔板中混勻，6 h 后將培養液換成含10%血清的完全培養基繼續培養24 h 進行蛋白質提取、RNA 提取和流式細胞術測定。

Tab.2 Primer sequences of microRNA and small interfering RNA（siRNA）

1.5 Western 印跡法檢測A2780T 和A2780 細胞多藥耐藥蛋白P-gp，MRP1 和ABCG2 表達水平及A2780T細胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達水平

A2780、A2780T 和轉染miR-152-3p 抑制物或PTEN siRNA 的A2780T 細胞培養24 h，棄培養液，用RIPA 裂解液和PMSF 于冰上充分裂解細胞，收集并離心獲得細胞總蛋白。BCA 法測定蛋白質濃度并定量后予以蛋白變性，隨后進行SDS-PAGE分離、濕法轉膜、5%脫脂牛奶封閉（室溫1 h）和一抗（抗P-gp，MRP1 和ABCG2 抗體：1∶5000；抗Bax和Bcl-2 抗體：1∶1000；抗PTEN 抗體：1∶2000；抗GAPDH 抗體：1∶10 000）4 ℃孵育過夜，次日用二抗（HRP 標記山羊抗兔或鼠IgG 抗體：1∶10 000）室溫避光孵育1 h，Odyssey?Dlx 雙色紅外激光成像系統顯影獲取蛋白條帶。采用Image J 軟件對蛋白條帶進行積分吸光度分析，以待測蛋白與內參蛋白GAPDH 條帶的積分吸光度比值表示待測蛋白相對表達水平。

1.6 RT-qPCR檢測A2780和A2780T細胞miR-152-3p和PTEN mRNA表達水平

待A2780和A2780T細胞聚合度＞90%，Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA進行RT-qPCR，檢測miR-152-3p 和PTENmRNA 水平。反應體系：cDNA 0.4 μL（2 μg），PCR 上下游引物各0.4 μL，SYBR GreenⅠ熒光染料混合物10.0 μL 和DEPC水8.8 μL。反應條件：95 ℃30 s；95℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環。GAPDH或U6作為內參基因，待測基因表達水平用2-△△Ct表示。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

培養轉染miR-152-3p 的A2780T 細胞，待細胞貼壁時用200 μL 的無菌槍頭在細胞貼壁部分劃出一個“十”字型，PBS 洗掉脫落的細胞，倒置顯微鏡下拍照記錄0 h細胞劃痕寬度。繼續培養24和48 h后，用PBS 洗掉漂浮的細胞，倒置顯微鏡下分別拍照，記錄培養24 和48 h 細胞劃痕寬度，計算細胞遷移面積。

1.8 流式細胞術檢測A2780T細胞凋亡

轉染miR-152-3p 抑制物的A2780T 細胞經不含EDTA 的胰蛋白酶消化后，用預冷PBS 洗滌2 次并重懸于500 μL預冷的結合緩沖液中，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）染色，通過流式細胞術分析細胞凋亡率（含早期和晚期凋亡率）。

1.9 在線數據庫預測miR-152-3p的靶基因

利用基因數據庫miRDB（V6.0，http：//www.mirdb.org），Targetscan（V7.2，http：//www.targetscan.org），miRWalk（V3.0，http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）和Starbase（V3.0，http：//starbase.sysu.edu.cn）4 個在線預測工具，以“hsamiR-152-3p”為搜索詞進行檢索并進行數據處理，分別獲取各軟件預測到的靶基因；利用在線集合統計軟件VENNY2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），取4 個預測軟件預測得到的靶基因的交集。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 A2780T細胞紫杉醇耐藥性的鑒定

MTT 法檢測結果（圖1A）表明，紫杉醇處理后A2780T 細胞存活率明顯高于A2780 細胞（P＜0.01）；A2780T 細胞的IC50值為（3.4±0.6）mg·L-1，A2780細胞為（1.20±0.04）mg·L-1（P＜0.01）；A2780T細胞的耐藥指數為2.8。Western 印跡法檢測結果（圖1B）表明，A2780T 細胞多藥耐藥蛋白P-gp，MDR1 和ABCG2 表達明顯高于A2780 細胞（P＜0.01）；表明A2780T細胞對紫杉醇具有耐藥性。

2.2 轉染miR-152-3p抑制物對A2780T細胞增殖、遷移、凋亡及紫杉醇耐藥的影響

RT-qPCR 檢測結果表明，A2780T 細胞中miR-152-3p表達水平比A2780細胞高（43.0±6.3）倍（P＜0.01，圖2A）。轉染miR-152-3p 抑制物后，A2780T中miR-152-3p表達抑制率達97%（P＜0.01，圖2B）。

劃痕實驗結果表明，轉染miR-152-3p抑制物組A2780T 細胞培養24 和48 h 細胞遷移面積明顯小于轉染miR-152-3p 陰性對照組（P＜0.05，圖2C），表明miR-152-3p 低表達可抑制A2780T 細胞的遷移能力。

MTT 法結果表明，轉染miR-152-3p 抑制物組A2780T 細胞與紫杉醇1.875，3.75，7.5，17 和23 μmol·L-1孵育48 h，細胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，圖2D1）和IC50值（P＜0.05，圖2D2）均明顯低于轉染miR-152-3p 陰性對照組，表明抑制miR-152-3p表達可降低A2780T細胞對紫杉醇的耐藥性。

Fig.1 ldentification of paclitaxel（PTX）resistant cells A2780T.A：A2780 and A2780T cells were incubated with PTX 1.875，3.75，7.5，17 or 23 μmol·L-1 for 48 h.The cell viability was detected by MTT assay.Cell viability（%）=（A570 nm of experimental group-A570 nm of blank control group）/（A570 nm of cell control group-A570 nm of blank control group）×100%.B：the protein expressions of P-glycoprotein（P-gp），multidrug resistance gene 1（MDR1）and ATP-binding cassette G2（ABCG2）measured by Western blotting，B2 was the semi-quantitative result of B1.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.

Fig.2 Effect of transfecting miR-152-3p inhibitor on proliferation，migration and drug resistance in A2780T cells.A：expression level of miR-152-3p in A2780 and A2780T cells detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.B：verification of knockdown efficiency of miR-152-3p in A2780T cells using RT-qPCR after transfecting miR-152-3p inhibitor for 24 h.The miR-152-3p inhibitor was transfected using a lipid-mediated transient transfection technique，while miR-152-3p negative control（miR-152-3p NC）group was simultaneously established.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.C：the migration ability of A2780T cells detected by scratch after transfecting for 24 h，C2 was the quantitative result of C1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with miR-152-3p NC group at the same time.D：the cell viability（D1）and IC50（D2）of transfected A2780T cells incubated with PTX for 48 h detected by MTT assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.

流式細胞術檢測結果顯示，轉染miR-152-3p 抑制物組A2780T細胞凋亡率明顯高于轉染miR-152-3p 陰性對照組（P＜0.05，圖3A）。Western 印跡法結果表明，與轉染miR-152-3p陰性對照組相比，轉染miR-152-3p 抑制物組凋亡蛋白Bax 表達升高（P＜0.01），Bcl-2 表達降低（P＜0.05，圖3B）；提示miR-152-3p低表達可促進A2780T細胞凋亡。

Fig.3 Effect of transfecting miR-152-3p inhibitor on apoptosis of A2780T cells.See Fig.2B for transfecting miR-152-3p inhibitor.A：apoptosis rate detected by flow cytometry，A2 was the quantitative result of A1.B：protein expressions of Bax and Bcl-2 measured by Western blotting，B2 was the semiquantitative result of B1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.

2.3 miR-152-3p 調控PTEN 參與A2780T 細胞對紫杉醇的耐藥性

2.3.1 生物信息學預測miR-152-3p的靶向基因

利用基因數據庫miRDB，Targetscan，miRWalk和Starbase 等4 個在線預測工具預測miR-152-3p的靶基因，共篩選出308 個基因（圖4A）。結合PubMed 文獻查閱，最終得到與卵巢癌相關的靶向基因PTEN。數據庫分析顯示，在卵巢癌中miR-152-3p 與PTEN的關系呈正相關（圖4B），并且PTEN與miR-152-3p 有多個不同結合位點（圖4C）。

Fig.4 Targeted genes for miR-152-3p predicted by bioinformatics.A：venn diagram intersection of prediction results of miR-152-3p in TargetScan，miRDB，miRWalk，and Starbase databases；B：PTEN was positively correlated with miR-152-3p showed by StarBase database；C：displayed consequential pairing of target region（top）and miRNA（bottom）and the binding site of the target sequence displayed through the TargetScan database.

2.3.2 miR-152-3p靶基因的驗證

Western 印跡法進一步驗證結果顯示，轉染miR-152-3p 抑制物后，與其陰性對照組相比，A2780T 細胞PTEN 表達顯著降低（P＜0.05，圖5A），表明A2780T細胞miR-152-3p表達下調的同時，PTEN 蛋白表達亦顯著降低。用RT-qPCR 檢測PTENmRNA 在A2780 和A2780T 細胞中的表達。結果顯示，A2780T 細胞中PTENmRNA 表達亦明顯高于A2780細胞（P＜0.01，圖5B）。

Fig.5 Verification of target gene of miR-152-3p.A：the expression level of PTEN protein in transfected A2780T cells by Western blotting.See Fig.2B for transfecting miR-152-3p inhibitor.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with miR-152-3p NC group.B：the expression level of PTEN mRNA in A2780 and A2780T cells detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.

2.3.3 下調PTEN 表達降低A2780T 細胞對紫杉醇的耐藥性

通過脂質體轉染技術轉染PTEN siRNA，沉默A2780T細胞中PTEN表達。結果顯示，與轉染siRNA陰性對照組相比，轉染PTEN siRNA 組A2780T 細胞PTENmRNA 降低60%（P＜0.05，圖6A）。MTT結果顯示，轉染PTEN siRNA組A2780T細胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，圖6B1）和IC50值（P＜0.01，圖6B2）均降低。Western 印跡法檢測結果顯示，與轉染siRNA陰性對照組相比，轉染PTEN siRNA組A2780T細胞P-gp，MRP1 和ABCG2 蛋白表達水平均降低（P＜0.05，P＜0.01，圖6C）。由此表明，下調PTEN表達可降低A2780T細胞對紫杉醇的耐藥性。

Fig.6 Effect of transfecting PTEN siRNA on proliferation and drug resistance in A2780T cells.See Fig.2B for transfecting PTEN siRNA.A：transfection efficiency assessed using RT-qPCR after transfecting A2780T cells with PTEN siRNA for 24 h.B：the cell viability（B1）and IC50（B2）of transfected A2780T cells incubated with PTX for 48 h detected by MTT assay.C：protein expressions of P-gp，MRP1 and ABCG2 measured by Western blotting，C2 was the semi-quantitative result of C1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA NC group.

3 討論

卵巢癌是預后最為不良的婦科腫瘤，高死亡率是卵巢癌的標志性特征，主要原因是疾病復發和化療耐藥［16］。已有大量研究表明，miRNA是卵巢癌的標志性分子，可以通過調節多種信號通路影響卵巢癌細胞增殖、凋亡、遷移及耐藥［17］，如miR-136 與人上皮卵巢癌的原發性順鉑耐藥相關，miR-200c 和miR-141也被證實為卵巢癌的潛在診斷和預后生物標志物［18-20］。然而，miR-152-3p在紫杉醇耐藥卵巢癌中的生物學功能和分子機制仍不清楚。

本研究觀察了miR-152-3p 對A2780T 細胞紫杉醇耐藥的作用。首先對A2780T細胞的紫杉醇耐藥性進行了驗證。結果表明，A2780T細胞耐藥指數為2.8；且P-gp，MRP1和ABCG2蛋白表達均高于紫杉醇敏感細胞A2780，表明A2780T細胞對紫杉醇具有耐藥性。隨后用RT-qPCR 法檢測了miR-152-3p在A2780T 和A2780 細胞中的表達。結果表明，A2780T細胞中miR-152-3p表達明顯高于A2780 細胞，提示miR-152-3p 對A2780T 細胞耐藥發揮作用。用脂質體瞬時轉染技術轉染miR-152-3p 抑制物降低A2780T 細胞中miR-152-3p 表達，結果發現，與轉染miR-152-3p 陰性對照組比較，轉染miR-152-3p抑制物后A2780T細胞存活率和細胞遷移能力明顯降低，細胞凋亡率升高，且Bax 蛋白表達增加，Bcl-2 蛋白表達降低。上述結果表明，抑制miR-152-3p表達可抑制A2780T細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡，降低A2780T細胞對紫杉醇的耐藥性。

已有研究表明，miRNA 可與目的蛋白信使RNA 的3′UTR 端結合，導致目的基因信使RNA 裂解或降解，從而對目的基因進行轉錄后調控，抑制其表達［21］。雖然miRNA 被廣泛認為負向調控下游靶基因，但也有來自體外實驗的證據表明，miRNA也可以激活基因表達，如miR-93-5p 正向調控絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（MAP3K2）水平抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移［22］；以鳥嘌呤序列結合因子1 介導的miR-G-10 正向調控磷脂酰肌醇-3-激酶調控亞基3水平激活蛋白激酶B/NF-κB信號通路抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲［23］。據報道，心臟疾病、糖尿病和非小細胞肺癌等miR-152-3p 與PTEN 呈負向調控關系［24-26］。然而，在紫杉醇耐藥卵巢癌細胞中miR-152-3p 與PTEN 的靶向關系未見報道。本研究用miRDB，Targetscan，miRWalk 和Starbase數據庫預測miR-152-3p的靶基因。結果表明，PTEN是miR-152-3p的一個靶基因。用Western印跡法檢測轉染miR-152-3p 抑制物后A2780T 細胞PTEN 蛋白表達的變化及RT-PCR 檢測A2780 和A2780T 細胞PTENmRNA 表達水平予以驗證。結果表明，轉染miR-152-3p 抑制物后A2780T 細胞PTEN 蛋白表達低于轉染miR-152-3p陰性對照組，且A2780T細胞PTENmRNA表達水平高于A2780細胞。為此，用脂質體瞬時轉染技術轉染PTEN siRNA沉默A2780T細胞中PTEN表達。結果表明，與轉染siRNA 陰性對照組相比，轉染PTEN siRNA沉默PTEN表達后A2780T 細胞存活率和IC50值顯著減低，P-gp，MRP1 和ABCG2 蛋白表達降低。由此提示，PTEN作為miR-152-3p 的靶基因，可能受miR-152-3p的正向調控，影響A2780T 細胞對紫杉醇的耐藥性，其潛在機制還需進一步研究。

本研究的局限性在于僅用A2780T 細胞進行了相關的實驗，若進一步探討具體的分子機制，尚需用其他卵巢癌紫杉醇耐藥細胞如紫杉醇耐藥細胞SKOV-3/Taxol等進行深入研究。

綜上所述，miR-152-3p 在A2780T 細胞中高表達，其表達下調可抑制A2780T 細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡，降低A2780T 細胞對紫杉醇的耐藥性，該作用可能是通過降低其靶基因PTEN表達發揮的。本研究或將為尋找并分析卵巢癌紫杉醇耐藥的治療靶點提供新方向，并為臨床逆轉卵巢癌耐藥、提高卵巢癌治療效果提供參考。