α-鵝膏蕈堿在大鼠體內的毒代動力學與組織分布特征

盧玉梅，付旭憲，羅芳，朱恩槿，熊根，趙金陽，付廷昊，聶勝潔，王蕊，李樹華

（昆明醫科大學1.法醫學院，3.基礎醫學院，云南昆明 650500；2.昆明市公安局刑偵支隊刑科所，云南昆明 650500）

毒蘑菇因其種類繁多，分布廣泛，且外觀與可食用蘑菇極其相似［1］，誤食導致中毒事件在世界范圍內頻發，引起嚴重的全球性公共衛生問題。在蘑菇中毒事件中，90%由含鵝膏肽類毒素的劇毒鵝膏引起［2］。鵝膏毒肽是鵝膏肽類毒素中的一類，是具有雙環的八肽，易溶于水、甲醇、乙醇和吡啶等溶劑［3］，化學性質穩定，耐熱，一般的烹調加工不會破壞其毒性。鵝膏毒肽主要包括α-鵝膏蕈堿（α-amanitin）、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽等，其中α-鵝膏蕈堿是劇毒鵝膏中最主要的毒性成分［4］。α-鵝膏蕈堿主要通過抑制真核細胞RNA 聚合酶Ⅱ影響mRNA轉錄和蛋白質的合成［5］，進而導致肝、腎及多器官功能衰竭［6-8］。針對誤食劇毒鵝膏引發的中毒事件及產生的社會影響，有研究建立了酶聯免疫吸附測定法［9］、氣相色譜-質譜聯用法［10］、液相色譜法［11-12］、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法［13-14］和毛細管電泳法［15］等多種檢測鵝膏毒肽的方法，但α-鵝膏蕈堿的體內代謝動力學研究只有少量文獻［16-19］報道。本研究采用大鼠單次ip 給予α-鵝膏蕈堿，測定血液和組織中的α-鵝膏蕈堿濃度，研究α-鵝膏蕈堿在大鼠體內的毒代動力學與組織分布特點，為劇毒鵝膏中毒的分析檢測、臨床藥物研發、臨床診療與法醫學鑒定提供實驗資料和科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

SPF 級SD 雄性大鼠，購自昆明醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（滇）LA2020361，體重180～220 g，6～8 周齡，在通風、恒溫的鼠籠中適應性喂養4 d，自由飲食飲水。動物實驗經昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會批準，編號：kmmu20221744。

α-鵝膏蕈堿標準品（含量≥90%，批號：03232123），德國DE 公司；色譜純甲醇、乙腈和乙酸銨，均為美國Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6470三重四級桿串聯質譜儀和ZORBAX RRHD Eclipse-Plus C18 色譜柱，美國Agilent 公司；高速離心機（Beckman Coulter AllegraTM），中國貝克曼庫爾特商貿有限公司；電子天平，美國METTLER TOLEDO公司；Oasis HLB固相萃取柱，中國云南百生科技有限公司；有機微孔濾膜（0.22 μm），中國云南樹森生物科技有限公司。

1.2 α-鵝膏蕈堿標準溶液配制

準確稱取α-鵝膏蕈堿標準品1 mg，加入10%甲醇水溶液1 mL，充分混勻后得到α-鵝膏蕈堿標準儲備液（1 g·L-1），4 ℃保存。取適量α-鵝膏蕈堿標準儲備液，經10%甲醇水溶液梯度稀釋得到1，10 和100 mg·L-1系列標準應用液，用于配制定性定量檢測使用的標準系列溶液和質控溶液。

1.3 樣品的LC-MS/MS分析條件

液相條件：ZORBAX RRHD EclipsePlus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流動相A：2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～1.5 min，10% B；1.5～3 min，30% B；3～6 min，10% B。進樣量：2 μL；流速：0.2 mL·min-1；質譜條件：采用電噴霧離子化正離子模式，多反應監測模式；干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速5 L·min-1；鞘氣溫度250 ℃，鞘氣流速11 L·min-1；毛細管電壓3500 V，噴嘴電壓500 V；噴霧器壓力為45 psi。根據以上條件優化質譜參數，得到α-鵝膏蕈堿的質譜檢測參數（表1）。

1.4 樣品處理

1.4.1 血液樣品

全血200 μL于1.5 mL離心管，加入1 mL甲醇，震蕩1 min，超聲提取15 min，5000×g離心10 min，取上清液過Oasia HLB 固相萃取柱，分別加入2%甲酸甲醇溶液1 mL、甲醇0.5 mL、2%氨水甲醇溶液1 mL洗脫。收集洗脫液于45 ℃氮氣吹干，殘渣用10%甲醇水溶液200 μL定容。振蕩3 min，充分混勻后經有機微孔濾膜（0.22 μm）過濾，濾液置-20 ℃保存，備測。

1.4.2 組織樣品

準確稱取大鼠心、肝、脾、肺、腎、全腦、小腸、胃壁和睪丸組織各0.5 g，加入1 mL蒸餾水充分勻漿，再加入1 mL 甲醇，震蕩1 min，超聲提取15 min，5000×g離心10 min，取上清液，按1.4.1 過Oasia HLB 固相萃取柱，洗脫，吹干，定容和過濾，濾液置-20 ℃保存，備測。利用Excel 軟件制作組織分布圖。

1.5 分析方法學驗證

專屬性：檢測空白基質（尾靜脈血、腎、肝和小腸等）、空白基質添加α-鵝膏蕈堿（500 μg·L-1）及α-鵝膏蕈堿1.5 mg·kg-1單劑量ip 給予大鼠30 min后上述組織和血液樣品中α-鵝膏蕈堿濃度，驗證方法的專屬性。

令Bk表示第k個發送線圈在節點S處產生的磁通密度,θk表示S與xyz軸的極角。當距離d遠大于4倍的線圈半徑時,S處的磁通密度為

線性及靈敏度：取α-鵝膏蕈堿1，10和100 mg·L-1標準應用液，分別添加于空白血樣和空白組織基質（1.4）中，配制濃度為1，2，5，10，20，100，200，500和1000 μg·L-1的校準系列樣品（每個濃度配制2 個平行樣），在1.3 分析條件下檢測，以定量離子對的峰面積（A）平均值為縱坐標，濃度（c，μg·L-1）為橫坐標進行線性回歸，得到各組織和血液基質中α-鵝膏蕈堿的線性方程。取線性最低點逐級稀釋后測定，以信噪比（S/N）＞3 作為檢出限（limit of detection，LOD），以S/N＞10 作為最低定量限（limit of quantitation，LOQ），考察方法的靈敏度。

基質效應：在1.4制備的9種空白組織樣和空白血樣基質中各添加適量α-鵝膏蕈堿標準應用液，分別配制成15，450 和750 μg·L-1空白組織和空白血添加樣品（每個濃度配制5 份），同時配制α-鵝膏蕈堿15，450 和750 μg·L-1標準工作液。分別測得空白組織添加樣和空白血添加樣中目標物定量離子對峰面積B，標準工作液中對應濃度目標物的峰面積A，基質效應（%）=（B/A-1）×100%。

回收率、精密度和準確度：取200 μL 空白血液，添加適量的α-鵝膏蕈堿標準應用液，配制成15，50和750 μg·L-1的空白血添加樣品（每個濃度配制5 份），按1.4.1 進行萃取，得到空白血液添加樣（基質前）。經LC-MS/MS 分析后，分別計算對應濃度的空白血添加樣（基質前）中α-鵝膏蕈堿的定量離子峰面積和空白血添加樣的定量離子峰面積的比值，得到空白血液中α-鵝膏蕈堿的回收率。連續3 d 測定前述樣品，每日早、中、晚各測定1 次，采用相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）來評估日內和日間精密度。將LC-MS/MS 法檢測得到的15，450 和750 μg·L-1的空白血添加樣（基質前）的定量離子峰面積，經校準曲線計算得到實際濃度值，以實際濃度平均值與真實濃度的百分比表示準確度。

穩定性：取200 μL 空白血液，加入不同濃度的α-鵝膏蕈堿標準應用液，配制得到15，450 和750 μg·L-1濃度的空白血液添加樣，分別放置24 h（室溫）、7 d（-20℃）、3 次凍融循環（-20 ℃～室溫）后，按1.4.1 處理，在1.3 分析條件下檢測，每個濃度平行配制5份，計算偏倚值（以測定平均值和參考值的差值與參考值的百分比表示），考察方法的穩定性。

1.6 毒代動力學測定

8 只雄性SD 大鼠，單次ip 給予α-鵝膏蕈堿1.5 mg·kg-1，在給藥前和給藥后5，10，20，30 和45 min及1，1.5，2.5，4和8 h采集尾靜脈血于EDTA抗凝試管中，混勻，置于-20 ℃保存。

按1.4.1 處理血液樣品，1.3 分析血藥濃度。采用DAS 2.0 藥動學軟件對測得的血藥濃度進行處理，以非房室模型法計算統計矩參數，繪制濃度-時間曲線，擬合毒代動力學參數：全血峰濃度（Cmax），消除半衰期（T1/2），達峰時間（Tmax），體內總清除率（CLz），曲線下面積（AUC0-t），平均滯留時間（MRT0-t），表觀分布容積（Vz）。

1.7 組織分布測定

24只雄性SD大鼠，隨機分為4組（15和40 min組及2.5 h 組和空白對照組），前3 組大鼠ip 給予α-鵝膏蕈堿1.5 mg·kg-1，空白組ip 給予同體積蒸餾水，分別于給藥后15 和40 min 及2.5 h 將大鼠安樂死，采集心、肝、脾、肺、腎、全腦、小腸、胃壁和睪丸9 種組織和左心室動脈血。蒸餾水沖洗臟器，去除雜質及血液，濾紙吸干水分，置于-20 ℃保存。按1.4 處理，按1.3 分析組織藥物濃度，左心室動脈血藥物濃度參考血藥濃度分析方法測定。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 樣品分析方法學驗證

專屬性：在1.3 分析條件下，檢測空白基質（尾靜脈血、腎、肝和小腸等）、空白基質添加α-鵝膏蕈堿及α-鵝膏蕈堿1.5 mg·kg-1單劑量ip給藥大鼠30 min后上述組織及血樣的色譜圖見圖1，表明空白基質對α-鵝膏蕈堿的檢測無干擾，方法專屬性良好。

線性及靈敏度：不同基質中α-鵝膏蕈堿質量濃度在10～1000 μg·L-1范圍內線性關系良好，R2＞0.9914。α-鵝膏蕈堿在大鼠尾靜脈血、左心室動脈血及各組織臟器中的檢出限和定量限較低（表2），方法靈敏度高。

Fig.1 Representative multiple reaction monitoring ion mass specrometry of tail vein blood（A），kidney（B），liver（C）and small intestine（D）samples of rats.1：blank matrix；2：blank matrix spiked with alpha-amanitin at a concentration of 500 μg·L-1；3：samples of rats 30 min after single-dose intraperitoneal injection of alpha-amanitin（1.5 mg·kg-1）.

基質效應：α-鵝膏蕈堿在9 種組織及血液基質中的基質效應為-13.93%～8.62%，RSD＜13%，說明9種組織及血液基質對α-鵝膏蕈堿的定性定量測定結果的影響均較小。

精密度、準確度與回收率：血液基質中α-鵝膏蕈堿的回收率為90.26%～102.59%，日內和日間精密度均在8.0% 以內，準確度為85.21%～110.83%，表明方法的提取回收率高，精密度好、準確度高，能滿足生物樣品中α-鵝膏蕈堿的檢測要求。

穩定性：α-鵝膏蕈堿在血液中的偏倚值為-13.82%～7.37%，在規范要求的15%以內，說明在前述3種環境下，α-鵝膏蕈堿穩定性良好。

2.2 單劑量ip 給予α-鵝膏蕈堿在大鼠體內的毒代動力學參數

采用DAS 2.0 軟件計算α-鵝膏蕈堿的主要毒代動力學參數并繪制濃度-時間曲線（圖2 和表3）。α-鵝膏蕈堿在大鼠體內吸收消除均較快，給藥5 min 后血液中即可檢測出α-鵝膏蕈堿，在（0.52±0.16）h 達峰，約4 h 后無法檢出。α-鵝膏蕈堿的T1/2為（0.72±0.37）h，CLz為（1.62±0.26）L·h·kg-1，AUC0-t為（946±183）μg·h·L-1，MRT0-t為（1.18±0.17）h，Vz為（1.65±0.86）L·kg-1。

Fig.2 Blood concentration-time curve of alpha-amanitin in male SD rats after single intraperitoneal injection.Before and after SD rats were intraperitoneally injected with alpha-amanitin 1.5 mg·kg-1，the tail venous blood was collected and detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）.±s，n=8.

Tab.2 Linear range of alpha-amanitin in tissues of rats

2.3 單劑量ip給予α-鵝膏蕈堿在大鼠體內組織分布

SD 大鼠ip給予α-鵝膏蕈堿后，不同時間點各組織和左心室動脈血中分布見圖3。結果顯示，α-鵝膏蕈堿在各組織臟器中吸收消除快，在給藥15 min 即可檢出，均約在40 min 達峰，2.5 h 濃度降至最低。α-鵝膏蕈堿在腎中的濃度最高，在心、脾、睪丸等組織含量較低，在腦中含量極低。在給藥后15 min，α-鵝膏蕈堿在各組織和左心室動脈血中的濃度順序為腎＞肺＞小腸＞胃壁＞肝＞心＞脾＞睪丸＞左心室動脈血＞腦；給藥后40 min，腎＞肺＞小腸＞胃壁＞脾＞左心室動脈血＞肝＞心＞睪丸＞腦；給藥后2.5 h，腎＞左心室動脈血＞肝＞睪丸＞胃壁＞肺＞脾＞腦＞小腸＞心。

Fig.3 Tissue distribution of alpha-amanitin in SD rats after intraperitoneal injection.SD rats were intraperitoneally injected with alpha-amanitin 1.5 mg·kg-1.The different tissue samples and left ventricular arterial（LVA）blood were respectively collected after intraperitoneal injection of 15 min，40 min and 2.5 h.The concentration of alpha-amanitin was detected by LC-MS/MS.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 15 min group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with 40 min group.

Tab.3 Toxicokinetic parameters of alpha-amanitin in rats after single intraperitoneal injection

3 討論

α-鵝膏蕈堿等蘑菇毒素相對分子質量大，水溶性強，LC-MS/MS 法是目前檢測鵝膏毒素較適宜的方法。以往研究建立的檢測方法主要是針對血漿中α-鵝膏蕈堿的檢測［18］，然而在實際毒蘑菇中毒死亡相關案例鑒定中，血液檢材/樣本大多為溶血或腐敗的全血，基質干擾較大。故本研究對大鼠全血樣品的前處理方法進行了優化，首先采用甲醇沉淀蛋白后經Oasia HLB 固相柱萃取，并結合α-鵝膏蕈堿的溶解性采用不同極性的洗脫劑洗脫，提高了萃取效率，降低了基質效應。建立的9 種大鼠組織和血液基質中α-鵝膏蕈堿的液相色譜串聯質譜法萃取效率高、基質效應小、精密度好、靈敏度和準確度高，確保α-鵝膏蕈堿的體內代謝規律研究結果的科學可靠。

本研究毒代動力學結果顯示，ip 給予α-鵝膏蕈堿后，α-鵝膏蕈堿在SD 大鼠體內吸收消除較快，給藥后約31 min達全血濃度峰值，4 h后未檢出，該結果與文獻報道［18-20］基本相符。依據毒代動力學結果，研究了α-鵝膏蕈堿在吸收相（15 min）、分布相（40 min）、代謝相（2.5 h）3 個時間點的組織分布特點。結果表明，3 個時間點α-鵝膏蕈堿在腎分布濃度均明顯高于其他組織，其次分布于血流豐富的組織及代謝器官，如肺、小腸、胃壁和肝等，在心、脾和睪丸等組織及左心室動脈血中分布較少，在腦中的分布極少；各組織和左心室動脈血α-鵝膏蕈堿濃度均在40 min 達最高，2.5 h 濃度明顯下降，提示α-鵝膏蕈堿的組織分布廣泛，腎可能為α-鵝膏蕈堿毒性作用的靶器官，α-鵝膏蕈堿不易透過血腦屏障。Garcia 等［21］建立了串聯二極管陣列和電化學高效液相色譜方法，分別測定了單次ip給予α-鵝膏蕈堿（10和21.4 mg·kg-1）2 和4 h 后Wistar 大鼠血漿、肝和腎組織中的α-鵝膏蕈堿濃度，發現在2 和4 h 腎中藥物濃度均明顯高于肝，且2 h 肝中未檢出，4 h 檢出微量α-鵝膏蕈堿；2 和4 h 的血漿中均未檢出，該結果與本研究結果基本符合。雖然染毒方式相同，但本研究建立的樣品前處理方法和檢測方法的回收率和靈敏度更高，檢出限低，且采樣時間點多，采集樣本類型豐富，更系統完整地研究了α-鵝膏蕈堿在大鼠體內多組織臟器中的代謝分布規律。

本研究建立的固相萃取-LC-MS/MS 檢測方法，具有回收率高、基質效應小，靈敏度和準確度高等特點，為α-鵝膏蕈堿的毒代動力學及組織分布研究提供了技術手段，此方法也可推廣應用于毒蘑菇中毒案件的法醫學鑒定。同時，本研究結果提示，涉及蘑菇毒素中毒的案件，應盡早采集血液檢材，重點采集腎、肝、肺和胃腸等臟器檢材進行檢測分析，明確中毒目標物，為臨床診療、案件偵破提供方向。