基于細胞代謝組學的柴胡皂苷b2對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用研究

李萌，施浩，陳佳俊，呂家樂，秦雪梅，杜冠華，4，周玉枝

（山西大學1.中醫藥現代研究中心，2.化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，3.地產中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室，山西太原 030006；4.中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050）

抑郁癥是一種復雜的精神疾病，臨床癥狀主要表現為抑郁心境、情緒低落、認知障礙甚至自殺傾向，嚴重威脅人類健康［1］。目前臨床常用抗抑郁藥物如選擇性5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑等，存在見效慢、作用靶點單一、且常伴有認知功能損害等不良反應［2-3］。中藥在抑郁癥的治療中具有多成分、多靶點且毒副作用小的獨特優勢［4-6］，因此，從中藥中開發具有良好抗抑郁活性的天然化合物日益得到研究者們的關注。柴胡（Bupleurum chinenseDC.）是傘形科植物柴胡的干燥根，具有解表退熱、疏肝解郁等功效，臨床應用較廣［7］。柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有抗抑郁［8］、抗癲癇［9］、治療神經性疼痛［10］和調節免疫［11-12］等藥理作用。柴胡皂苷的活性成分包括柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）、SSb2 和SSd 等［13］，其中柴胡總皂苷［14］、SSa［15-16］和SSd［17-18］的抗抑郁作用已有文獻報道。李軍等［19］研究發現，SSd 在柴胡煎煮過程中進入煎液幾乎全部轉化為SSb2。同時，本課題組前期研究發現，SSb2 生物利用度的提高與柴胡-白芍藥對的抗抑郁作用增效有關［20］，提示SSb2 有潛在的抗抑郁活性。為此，本研究采用皮質酮（corticosterone，CORT）誘導的PC12 細胞損傷模型探討SSb2的神經保護作用。

CORT 是一種在機體受到應激反應時釋放的糖皮質激素，它能夠引起海馬神經元的凋亡，在抑郁癥的發生過程中發揮重要作用［21］。PC12 細胞具有腦神經元的典型特征，使用高濃度CORT 與其共培養能誘導PC12 細胞損傷，模擬抑郁癥的神經元損傷狀態［22］，該模型已經被廣泛應用于抑郁癥的體外研究［23-25］。代謝組學可以反映機體由病理或生理刺激產生的內源性代謝產物的變化，是系統生物學的重要組成部分［26］。它可基于高通量質譜技術、聚類指數分析和數據處理，篩選和識別與疾病表型相關的差異代謝物，被廣泛應用于抑郁癥生物標志物的研究領域［27］。目前，越來越多研究者通過細胞代謝組學技術研究藥物的作用機制，包括CORT 誘導PC12細胞損傷的代謝組學研究［28-29］。

綜上所述，本研究采用CORT 誘導的PC12 細胞損傷模型，運用細胞藥理學和基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）的代謝組學技術探討SSb2 的神經保護作用，旨在為抗抑郁藥物的研發提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

SSb2（批號：18053005，高效液相色譜純度≥98%），成都普菲德生物技術有限公司；CORT，成都華夏化學試劑有限公司；青霉素、鏈霉素、胰酶、胎牛血清和RPMI 1640 培養基，美國HyClone 公司；二甲亞砜、MTT 和多聚賴氨酸，美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（貨號：A020-2-2）、細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI 雙染試劑盒（貨號：G023-1-1）、谷氨酸檢測試盒（貨號：A074-1-1）和谷氨酰胺酶活性試劑盒（貨號：A124-1-1），南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司；LC-MS 級乙腈和高效液相色譜級甲酸，美國Thermo Fisher Scientific公司。

LC-20AD型超高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；Triple TOF 5600質譜儀，美國ABSciex公司；HF Safe1800 生物安全柜、HF90 CO2培養箱和Neofuge 1600R 臺式高速離心機，中國力康生物醫療科技控股有限公司；Nikon Eclipse Ti-S 熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；SCIENTZ-12N 真空冷凍干燥機和UP-250 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；M200 多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；高速冷凍離心機，上海力新儀器有限公司；FACS CaliburⅡ流式細胞儀，美國BD Biosciences公司。

1.2 細胞培養

低分化PC12 細胞，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。實驗使用第10～15 代的PC12 細胞，培養于含有10%胎牛血清、青霉素10 kU·L-1和鏈霉素10 kU·L-1的RPMI 1640 培養基，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養，每2～3 d傳代1次。

1.3 PC12細胞CORT損傷模型構建、分組和給藥

為篩選CORT 的最佳造模濃度和SSb2 對正常PC12 細胞的毒性，取對數生長期的PC12 細胞，以2×108L-1的密度接種于經多聚賴氨酸包被的96孔培養板，每孔100 μL。①將細胞分為細胞對照組、CORT 組和SSb2 組。細胞對照組用RPMI 1640 培養基培養24 h；CORT組用CORT 100～800 μmol·L-1孵育24 h；SSb2 組用SSb2 1.5625，3.125，6.25，12.5，25，50 和100 μmol·L-1孵育24 h。MTT 法檢測細胞存活率，篩選出CORT 的最佳造模濃度和SSb2的無毒濃度范圍進行后續實驗。②將細胞分為細胞對照組（RPMI-1640 培養基孵育24 h）、模型組（CORT 400 μmol·L-1孵育24 h）、模型+SSb2 組（SSb2 1.5625，3.125，6.25，12.5 和25 μmol·L-1預處理3 h，去上清，然后加入CORT 400 μmol·L-1及SSb2 1.5625，3.125，6.25，12.5 和25 μmol·L-1共孵育24 h），MTT 法檢測細胞存活率，微板法檢測PC12細胞LDH釋放率。

1.4 MTT法檢測細胞存活率

取對數生長期的PC12 細胞，以2×108L-1的密度接種于經多聚賴氨酸包被過的96孔培養板內，每孔100 μL。CORT損傷模型構建和分組給藥同1.3，每組6 復孔。吸去孔中液體后，每孔加入含MTT 0.5 g·L-1的RPMI 1640培養基100 μL，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 μL 溶解沉淀物，微孔板振蕩器混勻10 min，用酶標儀在波長570 nm 條件下測定吸光度值（A570nm）。細胞存活率（%）=（實驗組A570nm-空白對照組A570nm）/（細胞對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。實驗重復3次。

1.5 微板法檢測PC12細胞LDH釋放率

取對數生長期的PC12 細胞，以2×108L-1的密度接種于24 孔培養板內，每孔500 μL，培養24 h后，將細胞分為細胞對照組、模型組和模型+SSb2組（給藥方式同1.3②），每組6復孔，培養24 h，收集細胞培養液，每孔中加入細胞裂解液（含1% Trition X-100的PBS）500 μL，按照試劑盒說明書進行樣本處理，用酶標儀在波長450 nm 條件下測定各組樣本吸光度值（A450nm）。LDH 釋放率（%）=細胞培養液A450nm/（細胞培養液A450nm+細胞裂解液A450nm）×100%。實驗重復3次。

1.6 Annexin V-FlTC/Pl 流式細胞術檢測PC12 細胞凋亡率

取對數生長期的PC12 細胞，以2×108L-1的密度接種于6孔培養板內，每孔2 mL，培養24 h后，將細胞分為細胞對照組、模型組和模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組（給藥方式同1.3②），每組設3復孔。培養24 h后，吸去細胞培養液。用1×Annexin V-FITC/PI工作液孵育15 min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.7 UPLC-Q-TOF-MS 法檢測PC12 細胞代謝組變化

1.7.1 細胞藥物處理和UPLC-Q-TOF-MS樣本制備

取對數生長期的PC12細胞，以2×108L-1的密度接種于10 cm 培養皿內，每皿10 mL，培養24 h 后，將細胞分為細胞對照組、模型組和模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組（給藥方式同1.3②），每組6皿。各組分別培養24 h 后，去除細胞培養液；PBS 洗細胞2次，培養皿放置在冰上并加2 mL甲醇水（4∶1），用細胞刮板刮下細胞，置于-80 ℃冰箱過夜，取出后于冰上超聲破碎，以18 000×g4 ℃離心20 min，取上清；在細胞沉淀物添加500 μL 甲醇水（4∶1），渦旋1 min，以18 000×g4 ℃離心5 min，取上清液；合并2 次上清液并凍干。凍干的樣品用100 μL 甲醇水（4∶1）復溶，旋渦2 min，超聲10 min，4 ℃，18 000×g離心10 min，將上清液收集于液相小瓶中。另各取上述3組樣本20 μL，混合后作為質量控制樣本。

1.7.2 UPLC-Q-TOF-MS測試分析條件

流動相：A（水，含0.1%甲酸），B（乙腈，含0.1%甲酸）；流動相梯度：0～2 min，0%～2%B；2～3 min，2%～35%B；3～10 min，35%～70%B；10～29 min，70%～98% B；29～31 min，98% B；31～33 min，98%～2%B；33～35 min，2%B。流速為0.2 mL·min-1，總色譜運行時間35 min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，使用Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）。

電噴霧離子源（ESI），正（+）、負（-）離子模式下分別掃描。離子噴霧電壓為3.5 kV（+）和4.5 kV（-）；離子源溫度450 ℃，輔助氣為N2；氣簾氣、霧化氣和輔助氣壓力分別為30，55 和55 psi；氣流速：35 arb，輔助氣流速：10 arb；碰撞能量（CE）采用45 eV（+）和-45 eV（-）；去簇電壓（DP）為60 V（+）和60 V（-）V。選擇數據依賴性采集（IDA）模式，選取響應值超過100 cps 的4 個最高峰進行二級質譜掃描并開啟動態背景扣除（DBS）以減少干擾，m/z采集范圍100～1500。

1.7.3 UPLC-Q-TOF-MS數據處理

將采集得到的UPLC-Q-TOF-MS 數據原始文件導入One-MAP（http：//www.5omics.com）在線軟件進行數據格式、電離模式設置，獲取匹配和對齊的峰值數據，將得到的峰面積進行總峰面積歸一化，再將歸一化后的數據導入SIMCA-P13.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和正交投影偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。用OPLS-DA模型變量的變量權重值（variable important in projection，VIP）＞1以及獨立樣本t檢驗（studentttest）P＜0.05 為標準，篩選差異代謝物。通過HMDB（http：//www.hmdb.ca），Mass bank（http：//massbank.eu）和Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）在線數據庫并結合二級離子碎片對篩選出的差異代謝物進行鑒定指認。使用MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca）對差異代謝物所涉及代謝通路進行富集分析。

1.8 比色法檢測PC12 細胞谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活力

取對數生長期的PC12細胞，以2×108L-1的密度接種于6孔培養板內，每孔2 mL，培養24 h后，將細胞分為細胞對照組、模型組和模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組（給藥方式同1.3②）。各組加藥后繼續培養24 h，收集細胞，采用比色法按照試劑盒說明進行操作，使用分光光度計在420 nm 處檢測吸光度（A420nm）值，計算各組谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活力。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度CORT 和SSb2 對PC12 細胞存活率的影響

CORT 造模濃度篩選結果顯示，與細胞對照組相比，當CORT 濃度為400 μmol·L-1時細胞存活率降低至（55±6）%（P＜0.01）（圖1A）。因此，選擇CORT 400 μmol·L-1作為造模濃度。SSb2 細胞毒性實驗結果顯示，與細胞對照組相比，SSb2 濃度高于50 μmol·L-1時，PC12 細胞存活率顯著降低（P＜0.01）（圖1B）。因此，選擇SSb2 1.5625～25 μmol·L-1進行后續研究。

Fig.1 Effects of different concentrations of corticosterone（CORT，A）and saikosaponin b2（SSb2，B）on viability of PC12 cells by MTT assay.PC12 cells were treated with different concentrations of CORT or SSb2 for 24 h.Cell viability（%）=（A570 nm of experimental group-A570 nm of blank control group）/（A570 nm of cell control group-A570 nm of blank control group）×100%.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

2.2 SSb2 對CORT 損傷PC12 細胞的存活率和LDH釋放率的影響

MTT 實驗結果（圖2A）顯示，與細胞對照組相比，模型組細胞存活率顯著減少（P＜0.01），與模型組相比，模型+SSb2（3.125，6.25 和12.5 μmol·L-1）組細胞存活率均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），其中SSb2濃度為12.5 μmol·L-1時作用最強。LDH釋放率實驗結果（圖2B）顯示，與細胞對照組相比，模型組LDH釋放率顯著增加（P＜0.01）；而與模型組相比，模型+SSb2組（3.125，6.25 和12.5 μmol·L-1）的LDH 釋放率均顯著降低（P＜0.01），其中SSb2 濃度為12.5 μmol·L-1時的作用最強。結合細胞存活率及LDH 釋放率的結果，選擇SSb2 12.5 μmol·L-1進行后續研究。

Fig.2 Effects of SSb2 on cell viability（A）and lactate dehydrogenase（LDH）leakage（B）in CORT injured PC12 cells by MTT and LDH assays.PC12 cells were divided into cell control，model and model+SSb2 groups.The cell control group and model group were cultured with RPMI-1640 medium or CORT 400 μmol·L-1 for 24 h，respectively.The model+SSb2 group was co-incubated with CORT 400 μmol·L-1 and SSb2（3.125，6.25 and 12.5 μmol·L-）for 24 h after the pretreatment with SSb2 for 3 h.LDH leakage（%）=A450 nm of cell culture supernatant/（A450 nm of cell culture supernatant+A450 nm of cell lysis solution）×100%.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 SSb2對CORT損傷PC12細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結果顯示（圖3），與細胞對照組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effects of SSb2 on cell apoptosis in CORT-injured PC12 cells by flow cytometry assay.See Fig.2 for the PC12 cell treatment except that the dose of SSb2 was 12.5 μmol·L-1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.4 SSb2對CORT損傷PC12細胞代謝的影響

2.4.1 代謝輪廓分析

將細胞對照組、模型組和模型+SSb2 組細胞UPLC-Q-TOF-MS 代謝輪廓數據進行多元統計分析。無監督的PCA 分析結果顯示（圖4A），在正、負離子模式下，細胞對照組和模型組細胞樣本各自聚為一類，且能完全分離，表明在CORT 作用下PC12細胞的代謝輪廓發生改變。模型+SSb2 組與模型組明顯分開，并與細胞對照組靠近，表明SSb2 能調節CORT損傷PC12細胞的代謝紊亂。進一步構建有監督的PLS-DA模型驗證實驗對各組進行代謝輪廓分析，通過參數R2和Q2來檢驗模型的可靠性和過度擬合程度。PLS-DA 模型驗證分析結果表明，正離子模式下的R2=0.816，Q2=0.464，負離子模式下R2=0.935，Q2=0.485，且正、負離子模式下的Q2所在的回歸線都交于y 軸的負半軸（圖4B），表明模型穩定性良好，不存在過度擬合現象，有良好的預測能力和可靠性。

Fig.4 Multivariate data analysis from ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS).See Fig.3 for the PC12 cell treatment.A：principal component analysis（PCA）score plots；B：validation plot obtained from 200 permutation tests for the partial least squares discrimination analysis（PLS-DA）models.A1 and B1：positive ion mode，A2 and B2：negative ion mode.

2.4.2 差異代謝物分析

為篩選出CORT 損傷PC12細胞前后的差異變量，使用模型組和細胞對照組構建有監督的OPLSDA 模型。并結合OPLS-DA 模型中VIP＞1 和獨立樣本t檢驗P＜0.05 為標準篩選細胞對照組與模型組之間潛在的差異代謝物。進一步根據細胞代謝物的m/z、分子式、保留時間、二級碎片離子并通過在線數據庫（HMDB，Massbank 和Pubchem）對細胞對照組與模型組之間顯著變化的差異代謝物進行指認，最終獲得19 個潛在差異代謝物（表1），其中膽堿、谷氨酰胺、D-蛋氨酸、脯氨酸、乳酸和鳥氨酸的含量增加，谷氨酸、酪氨酸、肌酸、異亮氨酸、L-色氨酸、N-甲基煙酰胺、煙酰胺、3-氨基苯甲酸、檸檬酸、N-乙酰天冬氨酸、2-氧代己酸、苯丙氨酸和葡萄糖的含量減少。與模型組相比，模型+SSb2 組谷氨酸、肌酸、N-乙酰天冬氨酸、L-酪氨酸、檸檬酸、L-異亮氨酸的含量顯著減少，乳酸、谷氨酰胺和膽堿的含量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

Tab.1 Differential metabolites associated with CORT-injured PC12 cells detected by UPLC-Q-TOF-MS.

Fig.5 Comparison of relative peak areas of potential biomarkers in UPLC-Q-TOF-MS in PC12 cells.See Fig.3 for the PC12 cell treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.4.3 差異代謝物的代謝通路分析

使用在線軟件MetaboAnalyst 4.0 對差異代謝物進行代謝通路分析（圖6），代謝通路影響值（pathway impact）由拓撲分析計算得到，影響值和-lgP分別表示代謝通路的重要性和通路富集分析的顯著性水平。將影響值大于0.1作為篩選條件，最終篩選出5條代謝通路，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；酪氨酸代謝；精氨酸生物合成。

Fig.6 Summary of metabolic pathway analysis of SSb2 on CORT-injured PC12 cells.See Fig.3 for the PC12 cell treatment.Each point represents one metabolic pathway；the size of dot and shades of color represnt correlations with the impact on the metabolic pathway.

2.4.4 SSb2 對CORT 損傷PC12 細胞谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活性的影響

比色法檢測結果（圖7）顯示，與細胞對照組相比，模型組谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活性顯著降低（P＜0.01）；而與模型組相比，模型+SSb2 組谷氨酸含量（P＜0.01）和谷氨酰胺酶活性均顯著增加（P＜0.05）。

Fig.7 Effects of SSb2 on glutamic acid contents（A）and glutaminase activity（B）in CORT-injured PC12 cells by ultraviolet colorimetry.See Fig.3 for the PC12 cell treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究采用PC12 細胞建立CORT 損傷模型，以CORT 400 μmol·L-1作為造模劑量。與模型組相比，模型+SSb2 組細胞存活率顯著升高，LDH 釋放率顯著降低，說明SSb2對CORT誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，且SSb2濃度為12.5 μmol·L-1時具有最佳保護作用。細胞代謝組學研究結果表明，SSb2 顯著改善CORT 誘導PC12 細胞代謝紊亂，主要涉及5 條代謝通路，分別為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，酪氨酸代謝，以及精氨酸生物合成。

氨基酸作為神經遞質、代謝調節劑和神經調節劑在中樞神經系統中發揮重要作用，與神經遞質有關的氨基酸代謝物有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺等［30］。谷氨酸是一種分布于中樞神經系統的興奮性神經遞質，與抑郁癥的發生密切相關［31］。它由神經元中的谷氨酰胺在磷酸鹽活化的谷氨酰胺酶作用下合成，然后釋放到突觸間隙以發揮生物效應。丙氨酸也可在丙氨酸轉移酶的作用下轉化為谷氨酸，釋放的谷氨酸通過谷氨酸轉運體被吸收到星形膠質細胞后，在谷氨酰胺酶的作用下轉化為谷氨酰胺，從而完成谷氨酰胺-谷氨酸循環［32］。谷氨酰胺-谷氨酸循環作為膠質細胞-神經元通信的一部分，是維持中樞神經系統谷氨酸穩態的關鍵［33］。大量動物和臨床研究都表明，谷氨酰胺-谷氨酸循環系統參與了抑郁癥發生的病理生理學過程［34-36］。有文獻報道，阻斷正常大鼠星形膠質細胞谷氨酸的攝取后會導致認知障礙和快感缺失等抑郁癥狀［37］；與正常大鼠相比，習得性無助抑郁模型大鼠大腦皮質、紋狀體、海馬體切片中谷氨酸攝取量明顯減少［38］，杏仁核中的谷氨酰胺合成酶活性降低［39］。Son 等［40］在慢性束縛應激誘導的抑郁小鼠模型中發現，菠菜提取物后能通過降低模型組小鼠血液CORT 水平和增加前額葉皮質中的谷氨酸水平發揮抗應激和抗抑郁特性。Gruenbaum 等［41］也在綜述中提出，抑郁癥是一種與谷氨酸系統相關的精神疾病，并建議治療應指向通過恢復谷氨酰胺-谷氨酸循環系統來穩定谷氨酸系統。本研究代謝組學和紫外比色法檢測結果均顯示，CORT 處理PC12 細胞后，谷氨酸和谷氨酰胺水平降低；給予SSb2 治療后，2 種指標均得到升高。提示SSb2 可能通過調節谷氨酸-谷氨酰胺循環的穩態發揮對PC12細胞的神經保護作用。

代謝組學研究結果表明，除D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路外，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝通路也與SSb2 的神經保護作用存在聯系。在該通路中，酪氨酸含量變化與SSb2 神經保護作用有關。酪氨酸經酪氨酸羥化酶催化可生成3，4 二羥苯丙氨酸（多巴），多巴經多巴脫羧酶催化生成多巴胺（dopamine，DA），而DA 與抑郁癥的發生、發展密切相關［42］。因此，作為DA 的重要合成前體，酪氨酸的含量變化也被認為與抑郁癥發生相關［43-44］。本研究發現，CORT 作用于PC12 細胞使酪氨酸含量降低，給予SSb2 治療后酪氨酸水平顯著回調，提示SSb2 可能通過調節酪氨酸的生物合成影響神經遞質DA的產生，從而發揮對PC12細胞的神經細胞保護作用。

抑郁癥的發生發展與能量代謝障礙、線粒體功能障礙密切相關，三羧酸循環和糖酵解是能量代謝的2 個重要途徑［45］。研究表明，抑郁癥患者腦內葡萄糖代謝顯著降低，神經元活動被抑制，產能減少［46］。本研究中模型組細胞乳酸含量顯著升高，檸檬酸含量顯著降低，表明CORT 損傷的PC12 細胞中三羧酸循環和糖酵解代謝的紊亂。而給與SSb2后三羧酸循環和糖部分代謝產物均恢復至細胞對照組水平。

需要注意的是，本研究采用CORT 誘導PC12細胞損傷模型在體外狀態下研究SSb2 的神經保護作用是局限的，后續需要進一步建立抑郁動物模型探究SSb2 的體內藥效以及潛在作用機制。另外，本研究用于評價SSb2藥效的生化指標為LDH釋放率和細胞凋亡率，后續還需進行多細胞模型、多藥效指標的綜合評估，進一步考察SSb2 的神經保護作用及量效關系。不僅如此，本研究采用的UPLCQ-TOF-MS 非靶向代謝組學技術只限于對差異代謝物進行定性分析，不能準確反映代謝物的含量變化。因此，之后還需使用代謝物標品通過靶向定量分析對SSb2 調節的差異代謝物進行定量，進一步明確SSb2發揮神經保護作用的機制。