益生菌對蝦、貝免疫功能調節作用的研究進展

王筱 吳恒梅 冼健安 魯耀鵬

摘 要：綜述了益生菌對蝦貝抗氧化能力、免疫功能和腸道屏障的調節作用，介紹了常見益生菌對蝦貝生物功能調節的機制，展望了益生菌的研究發展方向。

關鍵詞：益生菌；免疫；蝦；貝；機制

近年來，水產養殖業高速發展，高密度、集約化養殖成為常態，水產養殖病害頻發，嚴重制約了水產養殖業的發展。養殖戶使用抗生素和化學藥物來解決這一問題。由于其對人類的不良影響，抗生素耐藥菌株的發展，反復使用導致抗生素功效降低以及環境污染，許多國家已禁止在魚類和蝦等用作人類食品的水生生物中使用抗生素[1-2]。尋找綠色無污染、無毒副作用的抗生素代替品成為養殖行業的當務之急。益生菌具有無毒副作用、無耐藥性、作用穩定等優點，作為抗生素代替品有廣闊的應用前景。已有大量的研究證明了益生菌對水生動物的生長、消化、免疫以及抗病力有著積極作用[3-6]，但益生菌對蝦類和貝類免疫功能的影響及作用機制的相關報道較少。因此本文旨在綜述益生菌對蝦、貝的免疫功能調節作用及具體機制，以期為益生菌在蝦、貝養殖業中的應用提供理論參考。

1 益生菌的主要功能

益生菌是一種可定植于水產動物腸道或改善養殖水質的有益微生物?；罹膽靡延猩习倌甑臍v史。1908年，俄國生物學家首次提出將活菌應用于疾病治療[7]。20世紀80年代益生菌在日本投入使用，最初使用的益生菌是雙歧桿菌活菌，其在治療腹瀉、抗衰老、抗腫瘤等方面有著不錯的功效[8]。目前，益生菌的制備技術已逐漸成熟，可利用分子生物學和基因工程等技術改造菌種基因，獲得更加優良的菌種。益生菌因其提高動物生長性能、改善腸道健康、提高動物免疫力等作用在蝦、貝養殖業得到了廣泛應用。芽孢桿菌Bacillus aquimaris SH6對凡納濱對蝦的生長、免疫以及體內蝦青素的積累均有著積極作用[9]。此外，芽孢桿菌Bacillus aquimaris SH6的孢子在對蝦腸道定植后，改善了蝦腸道微生物多樣性，增強了蝦的免疫力[10]。鹽紅菌Halorubrum提高了凡納濱對蝦對鹽度的耐受性和對氨氮的耐受性[11]。飼喂乳酸菌改善了凡納濱對蝦腸道菌群，抑制蝦消化道弧菌數量[12]，提高蝦的生長性能和抗逆性[13]。乳酸菌能夠顯著抑制牡蠣體內的副溶血弧菌[14-15]?？莶菅挎邨U菌E20提高了凡納濱對蝦在弧菌脅迫下的存活率，顯著提高了蝦體的抵抗力[16]。益生菌對蝦、貝類的正向調節作用是其廣泛應用于水產養殖調控疾病和提高抵抗力的基礎。

2 益生菌對蝦、貝抗氧化能力的調節作用及機制

2.1 益生菌對蝦、貝抗氧化能力的調節作用

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶在蝦、貝體內發揮著不可或缺的作用，是反應機體抗氧化能力的重要指標。益生菌被蝦、貝攝入后，對于其抗氧化能力有一定的調節作用，能夠提高抗氧化酶活力。樊英等[17]在凡納濱對蝦飼料中分別添加活菌數量為108 CFU/g的地衣芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌，試驗周期為28 d，在第7、14、21、28天分別取樣測定對蝦CAT、GSH-Px、SOD、一氧化氮合酶（NOS）活性和總抗氧化能力（T-AOC）的活性，試驗結果表明，凝結芽孢桿菌組T-AOC活性在試驗第7天最高，地衣芽孢桿菌組在第14天最高；2個試驗組CAT活性在第21天達到最高值，SOD活性在第7天最高，而2個試驗組之間無顯著差異；凝結芽孢桿菌組GSH-Px活性在第28天最高，地衣芽孢桿菌組在第21天最高；凝結芽孢桿菌組NOS活性和NO含量均在第14天最高；地衣芽孢桿菌組NO含量在第28天最高，且試驗組抗氧化酶活性均顯著高于對照組。

2.2 調節機制

在機體代謝過程中會產生活性氧（ROS）物質，如超氧陰離子（O-2）、過氧化氫（H2O2）、氫氧離子（OH-）、單線態氧（O2）和活性氧中間體（ROI）等，ROS會使微生物產生損傷，需要在抗氧化酶的作用下被清除[18]，因此抗氧化酶能夠抑制機體的免疫應激反應。益生菌細胞內含有氧化還原系統，氧化還原系統主要由GSH系統、硫氧還蛋白系統和“NADH氧化酶/NADH過氧化酶”系統構成，能通過氧化還原作用產生谷胱甘肽，為動物體吸收后有效提高機體的抗氧化能力[19]。益生菌細胞膜對電荷有吸附作用，能夠消除陽離子電荷，從而達到清除生物體內活性氧和自由基的目的，保護機體免受傷害[20]。

2.2 益生菌對蝦、貝免疫功能的調節作用

2.2.1 免疫酶活力 在蝦、貝類免疫系統中堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）、酚氧化酶（PO）等免疫酶發揮了重要的防御作用。米銳等[21]配置四種飼料：基礎飼料、桑葉提取物飼料、地衣芽孢桿菌飼料、地衣芽孢桿菌桑葉提取物復合飼料，進行為期30 d的蝦夷扇貝養殖實驗，分別于第0、10、20、30天取樣測定蝦夷扇貝的免疫酶活性，實驗結果表明，隨著時間的增加，各組AKP、ACP活性呈逐漸升高趨勢，實驗組AKP、ACP活性顯著高于對照組，其中復合組和地衣芽孢桿菌組效果最佳；溶菌酶活性呈上升趨勢，實驗組活性均高于對照組，復合組活性顯著高于其他組。王振剛[22]在凡納濱對蝦飼料中添加枯草芽孢桿菌、海洋紅酵母及枯草芽孢桿菌和海洋紅酵母混合菌，飼養56 d后檢測相關免疫酶活力，實驗結果顯示，添加益生菌的實驗組與對照組相比ACP活性有所提高，其中混合菌組和海洋紅酵母組顯著高于對照組和枯草芽孢桿菌組，枯草芽孢桿菌組較對照組ACP活性有所提高但不顯著；與對照組相比，各實驗組AKP活性均顯著提高。

2.2.2 免疫基因表達 過度開發、高密度養殖及其他人為因素引起了養殖動物化學或生物應激反應，導致某些細胞基因上調[23]。在可持續水產養殖中，確定免疫基因表達等其他參數能夠在一定程度上反應某種化學因素或其他因素對生物體的影響。最常測定的蝦、貝免疫基因有熱休克蛋白、酚氧化酶原、血藍蛋白。熱休克蛋白（HSPs）是生物體中廣泛存在的一種應激蛋白質。當機體受到如高溫、酸、氧化劑或者機械損傷等外部刺激時，能夠激活熱休克蛋白基因的表達，來保護機體。HSPs對于動物體至關重要，能夠提高機體細胞的熱耐受能力，參與一些蛋白分子的合成與分解。酚氧化酶（PO）在蝦、貝非特異性免疫中尤為重要，機體損傷時，PO與黑色素一起抵御和殺滅外來病原菌，促進傷口愈合[24-25]。PO一般以無活性的酚氧化酶原（proPO）的形式存在，proPO主要存在于成熟的血細胞中，特異性受體識別到微生物后會被激活，水解為PO[26]。血藍蛋白是一種含銅呼吸蛋白，存在于某些軟體動物和節肢動物的血淋巴中。氧氣與血藍蛋白的銅離子結合后呈藍色，被運輸到機體各處。此外，血藍蛋白還是蝦、貝重要的免疫物質。許多研究表明，血藍蛋白具有抗病毒、抑菌作用[27]。Zhang等[28]證明了凡納濱對蝦中的血藍蛋白對白斑桿狀病毒（WSSV）和石斑魚虹彩病毒（SGIV）有抑制作用。Nesterova等[29]研究了脈紅螺血藍蛋白對皰疹病毒（EBV）的免疫活性。Tadese等[30]配制3種大黃素水平（0、25和50 mg/kg）和3種丁酸梭菌水平（0、250和500 mg/kg，2×107 CFU/g）的實驗飼料，在氨氮水平0.2 mg/L下飼喂羅氏沼蝦56 d，單用大黃素與丁酸梭菌互作對HSP70表達均有顯著影響，單用丁酸梭菌對應激前HSP70表達影響不顯著。氨刺激后，HSP70的表達被大黃素和丁酸梭菌的單獨和協同作用下調。Casillas-Hernndez等[31]研究表明飼料添加解淀粉芽孢桿菌可誘導凡納濱對蝦血藍蛋白、多酚氧化酶、HSP60基因顯著上調。益生菌誘導宿主的免疫基因上調，提高宿主的抵抗力，不僅可以減少疾病的發生，還可增加養殖品種的產量。

2.3 益生菌對蝦、貝腸道屏障的調節作用

2.3.1 腸道結構 腸的形態狀態，如絨毛長度、肌層厚度和杯狀細胞數量，對營養物質的消化和吸收起著重要作用。蝦、貝的腸道不僅是消化和吸收的場所，還是重要的免疫器官。腸道以其特殊的結構特征在阻止異物入侵中發揮著重要作用。腸道上皮細胞及其連接物維持著腸道的選擇透過性，能夠有效阻止病原菌、毒素進入腸道。腸道黏膜往往由胃液、膽汁、黏蛋白、黏多糖及消化酶組成，腸道黏膜具有抑制有害菌、病毒定植，保護腸組織免受損傷的作用[32]。Hamidoghli等[33]在凡納濱對蝦飼料中添加不同含量的酵母水解物（0.5%、1%、2%、4%），飼喂8周，取1 cm蝦腸，觀察其形態發現，4%組的蝦腸道絨毛排列更整潔有序，絨毛長度和肌層厚度顯著高于其他組。Duan等[34]將濃度為1×109 CFU/g丁酸梭菌以不同添加量加入到日本囊對蝦飼料中（0、100、200 mg/g），養殖56 d后取樣，使用HE染色，將蝦腸制成切片，置于顯微鏡下觀察發現，丁酸梭菌添加組上皮細胞緊密相連，腸道絨毛排列整齊致密，肌層厚度增加。

2.3.2 腸道微生物 據研究表明，動物腸道中的微生物數量達到了1012[35]，其中大多數細菌屬于厚壁菌門和擬桿菌門[36]。這兩種菌門含有大量益生菌，如芽孢桿菌、乳桿菌等。腸道菌群對機體的健康和新陳代謝至關重要。腸道微生物參與機體的消化、能量產生、營養物的吸收、代謝及免疫。腸道微生物受到環境變化或病菌感染時，腸道菌群平衡受到破壞，益生菌生長繁殖被抑制，病原菌在機體內迅速定植。益生菌依靠其黏附作用在腸道內定植，形成種群優勢，與病原菌形成競爭關系，維持腸道屏障。益生菌產生抗菌肽抑制病原菌的生長繁殖，抗菌肽是機體重要的免疫蛋白，抗菌肽通過與病原菌競爭占位來抑制其定植，還可作為信號蛋白為益生菌和免疫系統傳遞信號[37]。茹媛媛[38]在紅螯螯蝦飼料中添加不同濃度的乳酸乳球菌（1.5×106、1.5×107、1.5×108 CFU/g），飼喂60 d，經腸道微生物高通測序發現，各試驗組螯蝦的腸道菌群結構與對照組相比均發生了顯著變化，以添加量為 1.5×107 CFU/g組變化最大，其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）是腸道優勢菌群，Alpha多樣性分析、物種組成分析和功能預測結果表明，添加量為 1.5×107 CFU/g組有較好的腸道微生態環境，微生物菌群最豐富，有益菌數量和種類均最多。Fan等[39]使用地衣芽孢桿菌1×108CFU/g的飼料，飼喂凡納濱對蝦35 d，試驗結束時，與對照組相比試驗組蝦腸道中乙酸、丁酸含量顯著提高，16s RNA測序結果顯示，地衣芽胞桿菌增加了部分細菌的多樣性和豐度，變形菌門和類浮霉狀菌屬的豐度下降，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度增加，因此，地衣芽孢桿菌調節了蝦腸道菌群組成。Azad等[40]研究了芽孢桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌組成的混合益生菌（1.10 ×106 CFU/g）對羅氏沼蝦免疫的影響，此實驗分為三個對照組和三個實驗組，三個對照組分別為一個陰性對照（Cn）即不施用益生菌及病原菌和兩個陽性對照，兩個陽性對照分別記為Cv和Ca組，Cv組只施用弧菌，Ca組只施用水氣單胞菌。三個處理組分為T1、T2、T3，T1組使用益生菌處理蝦，但不接種病原菌；T2益生菌喂養羅氏沼蝦，使用弧菌攻毒羅氏沼蝦；T3飼喂益生菌，進行水氣單胞菌攻毒，該實驗共進行60 d。實驗結果表明，各處理組蝦腸道內容物細菌總密度均有升高趨勢，攻毒試驗結束時，益生菌添加組的羅氏沼蝦成活率顯著高于對照組。

3 展望

隨著益生菌在水產養殖中的研究取得顯著進展，益生菌現已被農業部批準作為飼料添加劑用于水產養殖。關于未來益生菌在水產養殖中的應用研究，可重點關注益生菌的選擇和作用機理。今后，可從以下幾個方面進行研究：一是益生菌對水生病原體的拮抗作用機制尚不清晰，益生菌的長期使用對病原菌的作用效果也不確定，因此應深入探討益生菌的作用機理。二是益生菌具有向病原菌轉移耐藥基因的風險，應仔細評估益生菌作用與水生動物的潛在危險。三是當前對于益生菌的有益效用機制的研究較少，其作用機理尚不明確。因此，需要通過轉錄組、代謝組、蛋白組等手段研究益生菌細胞的結構成分、代謝產物、酶和功能蛋白等，為益生菌的作用機理提供依據。

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Advances in research on immunoregulation of probiotics on shrimp and shellfish

WANG Xiao1，2， WU Hengmei2， XIAN Jianan1， LU Yaopeng1

（1. Institute of Tropical Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Key Laboratory of Research and Utilization of Functional Components of Marine Biological Resources in Hainan Province / Key Laboratory of Protection and Utilization of Tropical Agricultural Biological Resources of Hainan Province， Hainan Academy of Tropical Agricultural Resources， Haikou 571101， China; 2. School of Life Sciences， Jiamusi University， Jiamusi 154002， China）

Abstract：The regulatory effects of probiotics on the antioxidant capacity， immune function and intestinal barrier of shrimp and shellfish were reviewed， the mechanisms of common probiotics on the regulation of biological functions of shrimp and shellfish were introduced， and the direction of the development of probiotic research was prospected.

Key words：probiotics; immunity; shrimp; shellfish; mechanism