mRNA核苷堿基修飾開啟疫苗新時代

郭曉強

疫苗接種是大多數傳染病和部分慢性?。ㄈ鐚m頸癌等）預防的首選方法，成敗關鍵依賴于高效疫苗的研制和應用。1980年代前，滅活疫苗和減毒疫苗是主要的應用類型。隨著生物技術的出現和快速發展，亞單位疫苗、病毒載體疫苗和病毒顆粒樣疫苗等先后出現，種類繁多的疫苗為人類健康的保駕護航發揮著至關重要的作用。新型冠狀病毒感染（COVID-19）暴發后，疫苗應用更是在緩解疫情、減少傷亡中體現出難以估量的價值，其中新出現的mRNA疫苗尤為突出。

明星分子

1953年，雙螺旋結構的提出確立了DNA遺傳分子的中心地位；1957年底，克里克提出描述遺傳信息傳遞的中心法則，認定某種RNA在將DNA信息傳遞給蛋白質過程中發揮著中介作用，這種RNA被命名為信使RNA（messenger RNA， mRNA）；1961年，布雷內（S. Brenner）等利用細菌脈沖標記實驗發現了mRNA，開啟了對它的研究歷程[1]。mRNA在體內為蛋白質編碼、遺傳密碼解析的成果獲得1968年諾貝爾生理學或醫學獎；遺傳信息從DNA傳遞到RNA（重點在mRNA）稱為轉錄，轉錄過程的結構解析成果獲得2006年諾貝爾化學獎；遺傳信息從mRNA到蛋白質稱為翻譯，該過程的結構解析成果獲得2009年諾貝爾化學獎。所以，mRNA可謂名副其實的明星分子。

1980年代，mRNA開始被應用于體外研究并探索其醫學應用。1984年，梅爾頓（D. Melton）等在實驗室里完成RNA體外轉錄（in vitro transcribed， IVT），為將來的應用打開了第一扇成功之門。1987年，馬龍（R. Malone）采用脂質體包裹策略，將體外轉錄的mRNA轉入細胞并成功翻譯出蛋白質。1990年，沃爾夫（J. A.Wolff）等首次將體外轉錄mRNA注射到小鼠肌肉并表達出蛋白質。1992年，吉里科夫斯基（G. Jirikowski）等在小鼠模型上證明體外轉錄mRNA可有效治療糖尿病。這一系列成果說明了mRNA應用的理論可行性。

然而，后續研究發現，體外轉錄的mRNA存在激發機體先天免疫（導致不良反應）、易降解（穩定性差）、體內表達效率低（效果不佳）等諸多缺陷，從而限制了mRNA的實用性。許多科學家和藥物公司多次嘗試無果后，紛紛放棄而轉向其他方向，直到2023年兩位諾貝爾獎獲得者的突破性發現，mRNA的應用才出現了巨大轉機。

艱難探索

考里科（K. Karikó）是一位出生于匈牙利的生物化學家，1982年從匈牙利科學院塞格德生物中心獲得博士學位，1985年來到美國天普大學開展博士后研究，1990年加入賓夕法尼亞大學開啟獨立科研生涯?？祭锟埔恢睂RNA情有獨鐘，并對其應用前景充滿信心，積極嘗試申請科研基金以支持自己的進一步研究。遺憾的是屢戰屢敗，但從未氣餒的她仍堅持年年申請，中間經歷了身體狀況不佳、實驗進展不順、學校待遇下降等諸多困難，不屈的性格使她從未放棄，直到1998年才獲得第一筆科研經費，為自己建立mRNA研究平臺提供了資金保證。

由于經費有限，年近半百的考里科不得不親自做實驗?？祭锟葡到y研究了體外轉錄出的多種mRNA一級結構，以確定它們在細胞和組織內的最佳表達條件：她將特定mRNA（如編碼尿激酶型纖溶酶原激活物受體）遞送到體外培養的人骨肉瘤細胞后，發現可立即實現蛋白質的大量表達；她將編碼熒光素酶的mRNA借助脂質體輸送到大鼠腦中也得到高效表達，且在mRNA的3末端添加多聚腺嘌呤可顯著提升蛋白質表達量。這些成果使考里科更堅信mRNA的應用前景是光明的，但對真正阻礙mRNA應用的瓶頸問題（如免疫原性），一直無法解決。

科研摯友

1997年，考里科在一次復印論文時偶遇剛到賓夕法尼亞大學不久的免疫學家韋斯曼（D. Weissman），交談中雙方都對彼此的研究內容很感興趣，并開始合作研究。

韋斯曼是一位美國本土的免疫學家，1987年從波士頓大學獲得免疫學和微生物學博士學位，隨后進入美國國立衛生研究院開展博士后研究，重點關注人類免疫缺陷病毒（HIV）感染免疫細胞的機制，希望開發出有效疫苗。1997年，韋斯曼在賓夕法尼亞大學成立研究小組，最初準備研發預防HIV和流感的DNA疫苗，了解到考里科在mRNA方面的工作后，他果斷轉向mRNA疫苗研究。

考里科和韋斯曼的合作堪稱集天時、地利、人和于一體，他們的成功有點水到渠成的感覺。

天時方面，從1990年代開始，斯坦曼（R. Steinman）發現樹突細胞在免疫系統中的重要性，并得到科學界普遍認可，斯坦曼因此分享了2011年諾貝爾生理學或醫學獎的一半獎金，樹突細胞成為韋斯曼等開展免疫學研究的重要實驗材料；1996年，霍夫曼（J. Hoffmann）在果蠅中首先鑒定出天然免疫中能識別不同病原體的Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR），兩年后巴特勒（B. Beutler）克隆出第一個哺乳動物的TLR，兩人因此分享2011年諾貝爾生理學或醫學獎另外的一半獎金，TLR識別是mRNA產生免疫原性的重要原因，這兩項成果為后續的突破奠定了重要基礎。

地利方面，兩人在同一學校，可隨時溝通實驗進展和遇到的問題，保證實驗順利進行。人和方面，兩人性格都非常隨和，關鍵是專業上互補性強，考里科有生物化學專業背景，熟悉mRNA的制備和改造，韋斯曼有免疫學背景，精于免疫機制研究，他們面臨的首要問題是消除mRNA的免疫原性。

考里科首先合成了一系列mRNA，韋斯曼將這些mRNA轉染樹突細胞，結果樹突細胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）等炎癥因子的合成和釋放量顯著增加，說明樹突細胞被高度激活了。這一結果的重要性還在于，它提供一個非常理想的操作系統，相比動物實驗，樹突細胞測試mRNA的免疫原性既快速又價廉，這大大加快了研究步伐。

樹突細胞存在多種TLR，它們可感知不同外源物進而激活下游信號，如TLR3可由雙鏈RNA激活，TLR9由DNA觸發。他們進一步證實了體外轉錄mRNA通過識別TLR3等激活樹突細胞[2]，下一關鍵問題是如何規避這種激活效應。

重大突破

2004年，考里科和韋斯曼測試了不同來源的RNA對樹突細胞的激活作用，結果迥異。體外轉錄的RNA和細菌RNA可激活樹突細胞，而作為對照的哺乳動物tRNA則幾乎對樹突細胞沒有任何影響。 tRNA和其他類型RNA的最大區別在于其存在廣泛的核苷修飾（修飾核苷數量可達總核苷數量25%），因此他們推測通過修飾核苷可能會消除對樹突細胞的激活。為驗證這一假說，他們將多種修飾核苷，如假尿苷（Ψ）、5-甲基胞苷（m5C）、5-甲基尿苷（m5U）、N6-甲基腺苷（m6A）和2-硫尿苷（s2U）等摻入體外轉錄合成的mRNA，然后測試這些修飾后的mRNA對樹突細胞的激活效應，結果出現明顯差異。相比較于未修飾mRNA，摻入m5C和m6A對樹突細胞釋放TNF-α無顯著影響，而摻入m5U、s2U或Ψ則幾乎完全消除了TNF-α的生成，這意味著對尿苷的修飾可能是最佳選擇。這一重要結果表明體外轉錄mRNA經過對其特定核苷的修飾，竟然能起到對樹突細胞的隱身效果，尤其用Ψ替代體外轉錄mRNA中相應的尿苷（uridine，U）可實現在不影響編碼序列的前提下，消除免疫原性。

2005年，考里科和韋斯曼將實驗結果發表在《免疫》（Immunity）雜志上[3]，為mRNA的應用掃清了一個重要障礙，成為具有里程碑意義的成果。

砥礪前行

然而，這一重大突破在當時并未引起過多的關注，但考里科和韋斯曼繼續在該領域深入探索，以解決更多實際問題。

考里科研究發現，核苷修飾（Ψ替代U）后的體外mRNA不再與TLR結合，即使結合也無法激活下游炎癥信號，從而無法啟動對mRNA的降解，這樣可增加mRNA在細胞內的存留時間，進而增加翻譯效率[4]。因此，核苷修飾的mRNA一方面可以消除先天免疫，另一方面還增加了體內表達效率，可謂“一箭雙雕”。他們還將核苷修飾的mRNA遞送到小鼠脾臟，發現確實可以實現蛋白質產量增加和免疫激活降低的雙重效果，這一發現為未來的治療應用提供了重要佐證。

體外合成的單鏈mRNA通常無法避免一定量的雙鏈RNA污染，而雙鏈RNA可被細胞TLR識別引發免疫應答?？祭锟茷榇瞬捎酶咝б合嗌V法（HPLC）去除雙鏈RNA并獲得高純凈度的單鏈mRNA[5]。這種操作既減少炎癥因子生成，又增加蛋白質翻譯效率（10～1000倍），為mRNA的應用進一步掃清了障礙。

2012年，考里科將編碼促紅細胞生成素（EPO）的人工合成修飾mRNA注射到小鼠體內，6小時后小鼠血清中EPO含量開始迅速升高，一段時間后網織紅細胞和成熟紅細胞數量也顯著增加。隨后，在非人靈長類動物實驗上也獲得類似結果。這說明mRNA具有用作蛋白藥物臨床治療的可行性。

韋斯曼和考里科對mRNA核苷修飾技術進行了多方面改進，大大提升其實用性[6]：利用脂質納米顆粒（lipid nanoparticle， LNP）遞送mRNA；采用1-甲基假尿苷（m1Ψ）代替尿苷（這是新冠病毒疫苗研發的基礎）；對mRNA在疫苗應用中的潛力也做了進一步探索。

2017年，韋斯曼開發出針對寨卡病毒（Zika virus）包膜糖蛋白的mRNA疫苗，該疫苗在人體內可產生強大而持久的中和抗體反應[7]。由于寨卡病毒疫情暴發在2013年，當時只有零星病例，因此無法開展有價值的臨床試驗。2018年，韋斯曼和考里科等進一步聯合開發HIV和流感的mRNA疫苗，動物實驗顯示這類疫苗表現出強烈且持久的保護作用。這一系列重要進展確立了mRNA作為疫苗的可行性，但鑒于是新興疫苗，因此尚待嚴格臨床實驗以確定其安全性和有效性。

為加快mRNA應用，一些生物技術公司先后成立。2006年，韋斯曼和考里科親自創立mRNA應用公司RNARx，申請了多項mRNA核苷修飾方面的專利，雖然后續發展并不順利，但卻鼓舞了越來越多的研究人員進入該領域。2008年，德國生物制藥新技術公司（BioNTech）成立，目標是開發癌癥個體化mRNA疫苗。2010年，美國莫德納公司（Moderna）成立，公司名字本身就是修飾mRNA（modified mRNA）兩個單詞的縮寫。遺憾的是，mRNA的實際應用卻遲遲沒有到來，許多公司都放棄了研發，這種情況下仍能苦苦支撐下來的公司無疑承擔著巨大的壓力。

大顯身手

2020年初，新型冠狀病毒感染的突然暴發打破了mRNA應用的平靜。為應對日趨嚴重的流行病形勢，亟需高效疫苗的出現，此時，mRNA修飾技術的價值開始顯現。

2020年1月，中國科學家公布了新冠肺炎病毒（SARS-CoV-2）基因組序列，莫德納公司、生物制藥新技術公司和美國輝瑞公司立即啟動mRNA疫苗研制計劃。首先設計出基于SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA序列（用m1Ψ代替相應的U）；進一步體外轉錄出攜帶修飾核苷的mRNA并包裝入LNP，轉入體內后可檢測到大量針對刺突蛋白的中和抗體，初步證明有效性；最后采用嚴格生產標準制備出疫苗（莫德納公司生產的疫苗名為mRNA-1273，生物制藥新技術公司和輝瑞公司生產的疫苗名為BNT162b2），隨后開啟一系列臨床試驗，Ⅲ期臨床結果顯示，這兩種疫苗保護效率均達到90%以上[8]。隨后在美國食品藥品監督管理局（FDA）緊急使用授權的前提下，這兩種修飾mRNA疫苗迅速在2020年底投入使用。

新型冠狀病毒mRNA疫苗通常在上臂通過肌肉注射，攜帶修飾mRNA的LNP進入人體后，通過淋巴引流到達淋巴結，被樹突細胞吸收并翻譯出刺突蛋白，刺突蛋白被進一步遞呈給B細胞和T細胞，隨后啟動免疫應答。免疫細胞擁有記憶功能，待真正的新冠病毒感染時，可及早啟動保護作用，將病毒危害降到最低，同時也避免了病毒傳播。由于新冠病毒是一種全新病毒，首次產生免疫應答較弱，因此需間隔兩周后再次注射疫苗，方可真正體現保護作用。

相較傳統疫苗，mRNA疫苗具有自己獨特的優勢：工藝簡單、耗時短；安全性高；適應性好（對于易突變病毒，新疫苗研制較快，且可以多種亞型疫苗同時應用）[9]。

與此同時，其他幾種類型的SARS-CoV-2疫苗也迅速推出，全球共接種130多億劑疫苗，挽救了數百萬人的生命，同時也避免了更多感染者發展為重癥，為社會的逐步開放恢復正常發揮了重要作用。

功成名就

隨著新型冠狀病毒mRNA疫苗的推廣應用及其價值體現，考里科和韋斯曼在mRNA核苷修飾發現方面的貢獻逐漸得到科學界的認可。他們在短短3年時間內共同分享了幾十項重大科學獎勵，比較著名的有阿爾巴尼醫學中心獎（Albany Medical Center Prize）、拉斯克臨床醫學研究獎（Lasker Clinical Medical Research Award）、路易莎·格羅斯·霍維茨獎（Louisa Gross Horwitz Prize）、生命科學突破獎（Breakthrough Prize in Life Sciences）、蓋爾德納國際獎（Gairdner International Award）和唐獎（Tang Prize）等，可謂能獲得的獎項基本拿遍，直到分享2023年度諾貝爾生理學或醫學獎[10]。此外，他們在2022年共同入選美國國家發明家名人堂。

mRNA修飾技術在新型冠狀病毒疫苗方面的成功算是牛刀小試，其更大的意義在于它廣泛的應用潛力，如可以部分替代傳統的蛋白治療、開發針對癌癥預防或治療的疫苗等。包括考里科在內的多位科學家都對修飾mRNA技術的應用前景充滿信心，現在的成果只是起點而非終點，它的未來不可限量。

[1]Dolgin E. The tangled history of mRNA vaccines. Nature， 2021， 597（7876）： 318-324.

[2]Karikó K， Ni H， Capodici J， Lamphier M， et al. mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. J Biol Chem， 2004， 279（13）： 12542-12550.

[3]Karikó K， Buckstein M， Ni H， et al. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors： The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity，2005， 23（2）： 165-175.

[4]Karikó K， Muramatsu H， Welsh F A， et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther， 2008， 6（11）： 1833-1840.

[5]Karikó K， Muramatsu H， Ludwig J， et al. Generating the optimal mRNA for therapy： HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified， proteinencoding mRNA. Nucleic Acids Res， 2011， 39（21）： e142.

[6]Ruffell D. The future in an RNA molecule： from mRNA vaccines to therapeutics - An interview with Drew Weissman. FEBS Lett， 2021， 595（18）： 2305-2309.

[7]Pardi N， Hogan M J， Pelc R S， et al. Zika virus protection by a single low-dose nucleoside-modified mRNA vaccination. Nature， 2017， 543（7644）： 248-251.

[8]Sahin U， Muik A， Derhovanessian E， et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses. Nature， 2020， 586（7830）： 594-599.

[9]Shapiro L， Losick R. Delivering the message： How a novel technology enabled the rapid development of effective vaccines. Cell， 2021， 184（21）： 5271-5274.

[10]Callaway E， Naddaf M. Pioneers of mRNA COVID vaccines win medicine Nobel. Nature， 2023， 622（7982）： 228-229.

關鍵詞：mRNA 核苷修飾 疫苗 諾貝爾獎 ■