基于分子印跡技術的電化學傳感器檢測吡蟲啉的研究

王 琪

（沈陽建筑大學，遼寧 沈陽 110168）

吡蟲啉（IMI）是一種新煙堿類農藥，常應用于設施農業作為殺蟲劑，可以有效控制刺吸式口器害蟲，保證農產品質量。其對脊椎型動物毒性低，對昆蟲毒性高，因此新煙堿類是全球最常用的殺蟲劑。據調查，IMI的使用量超過了任何其他種類的殺蟲劑，約占世界上所有殺蟲劑的四分之一[1-4]。

盡管IMI具有很多優勢，如高效、廣譜性、相對較低的毒性，但它對人類的健康和環境造成了負擔，大量使用的吡蟲啉增加了作物上的農藥殘留量，引發了食物中毒事件，噴施后的農藥污染環境，在空氣、土壤以及水中造成污染[5-6]。因此，迫切需要可行和可靠的IMI測定方法。高效液相色譜法（HPLC）作為IMI檢測的標準方法，因其優良的準確度、精密度和靈敏度而廣泛應用于生產和監督[7-8]。然而，HPLC通常需要昂貴的設備和復雜的程序，因此不適用于IMI的快速和經濟的分析。

分子印跡技術是一種可以合成具有特異性識別空穴的特殊材料的技術，具有良好的選擇性和剛性，能夠大大提高探測的敏感性[9]。運用分子印跡技術可以快速準確地檢測出目標物，不需要復雜的樣品前處理流程[10]。分子印跡電化學傳感器是將分子印跡特異性材料與電化學分析裝置結合起來，將目標物質濃度轉化為電信號來獲得檢測濃度的裝置。分子印跡電化學傳感器設計簡單、檢測速度快[11]。目前，已經有研究各種類型的吡蟲啉電化學性質傳感器，并有著優異的準確度與精密性[12-14]。

本文以金納米顆粒修飾玻碳電極，提高了電極反應過程的比表面積和響應電流值，以吡蟲啉為模板分子物質，以鄰苯二胺（o-PD）為主要作用功能聚合物單體，利用循環伏安法在聚集了金電層的電極上制備聚合物層，制作出吡蟲啉分子印跡電化學傳感器。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

華辰CHI610E電化學分析儀，上海市辰華儀器有限；玻碳電極用作工作電極、鉑絲電極用作對電極、Ag/AgCl電極用作參比電極；IKA磁力攪拌器；可調功率超聲清洗機，KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司；Thermo 超純水儀，GenPure xCAD Plus。

鄰苯二胺、吡蟲啉、三水合四氯化金（HAuCl4·3H2O），阿拉丁試劑有限公司；鐵氰化鉀、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸、無水乙酸銨，國藥集團化學試劑有限公司；氧化鋁拋光粉，上海辰華儀器有限公司；硝酸、無水乙醇、硫酸，天津市化學試劑供銷公司；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 玻碳電極預處理

將麂皮固定在玻璃面板上，在表面撒上一定量的三氧化二鋁粉末，再加入蒸餾水混合成糊狀，手持電極，將電極垂直接觸在麂皮表面，按照八字順時針打磨電極，力度適當即可，打磨先后順序為1.5 μm、0.5 μm、50 nm的三氧化二鋁粉末，打磨后用超純水沖洗表面直至光潔。在電極表面滴落一滴水珠，當水珠停留在電極鏡面表面中而不是全覆蓋整個電極平面即得到打磨效果良好的電極。然后將打磨后的電極放置于HNO3-H2O（體積比1∶1）溶劑中超聲清洗3 min，之后將電極放置于無水乙醇中超聲清洗3 min，最后在去離子水中超聲清洗3 min，以去除表層雜質。然后將超聲清洗后的電極放置于0.5 mol·L-1H2SO4溶液中活化電極。最后將處理好的電極放在鐵氰化鉀、氯化鉀溶液中利用循環伏安法測試，若可逆電位差小于90 mV說明電極處理效果良好。

1.2.2 電化學傳感器的制備

吡蟲啉分子印跡電化學傳感器的制備：首先配置5 mmol·L-1HAuCl4·3H2O、0.1 mol·L-1KCl混合溶液，將已經處理好的電極（GCE）置于溶液中，采用循環伏安法在電極表面修飾金電層，電壓范圍在0.2～1 V，聚合速率為50 mV·s-1，聚合10圈，超純水沖洗，自然晾干即得到金納米粒子修飾的電極（Au/GCE），金電層具有良好的導電性，可以增大電極的比表面積，有助于提高電極表面的電子傳遞速率，提高檢測的靈敏度。然后將Au/GCE置于含4 mmol·L-1鄰苯二胺、1 mmol·L-1吡蟲啉、0.1 mmol·L-1HAuCl4·3H2O的醋酸鹽緩沖溶液中。采用循環伏安法制備分子印跡膜，電壓范圍在-0.2～1.2 V之間，聚合速率50 mV·s-1，聚合15圈，去離子水沖洗，自然晾干。將晾干后的修飾電極浸入0.5 mol·L-1HCl溶液中磁力攪拌洗脫30 min，去離子水沖洗自然晾干即得對吡蟲啉具有特異性識別性的印跡電極（MIP/Au/GCE），制備過程如圖1所示，非印跡傳感器（NIP/Au/GCE）除了不添加吡蟲啉，制備過程與印跡傳感器制備方法相同。

圖1 吡蟲啉分子印跡電化學傳感器制備過程

1.2.3 分子印跡電化學傳感器的性能及機理的電化學表征

通過電化學測試對電極進行電化學表征，選擇差分脈沖法和循環伏安法對傳感器進行檢測，得到相關測試曲線，從而分析裸電極、吡蟲啉印跡電極和非印跡電極以及孵育后印跡電極的機理。在三電極體系中，分別以不同狀態下電極作為工作電極、鉑絲電極作為輔助電極、Ag/AgCl電極作為參比電極。

循環伏安法測定參數：電位范圍選擇在-0.2～0.6 V之間，掃描速度為0.05 V·s-1。

差分脈伏安法測定參數：掃描電位范圍-0.2～0.6 V，采樣幅度2 mV，脈沖幅度6 mV。

兩種測試方法均在0.2 mol·L-1、氯化鉀5 mmol·L-1K3Fe(CN)6溶液中測試。將MIP/Au/GCE電極在吡蟲啉溶液中孵育10 min，再在鐵氰化鉀探針溶液中利用循環伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）檢測吸附效果。

2 結果與討論

2.1 吡蟲啉傳感器的制備與表征

電極表面電聚合的循環伏安圖如圖2所示。由圖2（a）可以看出，未修飾金電層的印跡傳感器（MIP/GCE）在循環伏安法聚合第1圈中0.63 V附近沒有陽極峰，修飾金電層的傳感器Au/NIP/GCE和Au/MIP/GCE電極分別在0.63 V和0.36 V處出現明顯的不可逆陽極峰，如圖2（b）、圖2（c）所示。在電聚合過程中，質子化的o-PD單體作為電子給體與強氧化劑AuCl4-離子相互作用，形成o-PD低聚物使AuCl4-離子還原為AuNPs，AuNPs作為活性催化劑，促進了額外的o-PD單體的氧化聚合。隨著聚合圈數的增加，氧化峰值電流顯著降低，這意味著電極表面形成了絕緣聚鈀層。在pH=5.2的醋酸鹽緩沖液中，吡蟲啉的硝基與o-PD上的質子胺基團之間的形成鍵嵌入到聚合物網絡中。圖2（c）表明，修飾金電層的非印跡電極（Au/NIP/GCE）的聚合過程與Au/MIP/GCE相似，因為吡蟲啉的電活性較低，不影響電聚合過程中的電流響應。

圖2 電極表面電聚合的循環伏安圖

2.2 分子印跡電化學行為分析

通過循環伏安法分析傳感器制備過程，如圖3所示。與裸電極（曲線a）相比，當修飾金電層到電極表面后，峰電流值變大（曲線b），這是由于金納米粒子增加電極的表面積，同時提高了電子的傳遞速率。當印跡電極表面負載了大量的不導電的分子印跡聚合物，探針離子只能通過特異性空穴到達電極表面，所以Au/MIP/GCE 電極（曲線c）峰電流值變小。Au/NIP/GCE電極（曲線d）由于表面形成了不導電的、致密厚實的聚合物，且無印跡位點，阻礙了探針離子的擴散，故峰電流值很小，幾乎為0。

圖3 不同修飾電極的循環伏安圖

2.3 實驗條件優化

在pH為3～7的范圍，考察了不同pH醋酸鹽緩沖溶液對印跡傳感器性能的影響，結果顯示當聚合液pH為5.2時印跡傳感器的檢測性能最佳，所以選擇pH為5.2的醋酸鹽緩沖溶液為電解質溶液。

適當的聚合圈數有助于提高印跡空穴量。過高的聚合物圈數也會造成與電極反應的表面聚合層厚度過高，洗脫的反應難度也提高，特異性吸附空穴數量減少；過少的聚合圈數會降低聚合層與電極之間的緊密度，引起聚合膜脫落。為了提高傳感器檢測性能，考察了聚合圈數對響應電流的影響，結果顯示響應電流隨著聚合圈數的增加呈現先增后降的趨勢，在設定聚合圈數為15圈時，測試的響應電流值最大，所以本實驗的最優聚合條件為15圈。

探討了不同洗脫時間對洗脫效果的影響，結果顯示隨著洗脫時間的增加，響應電流值呈增大的趨勢，且在洗脫30 min后響應電流值不再發生變化，所以最佳洗脫時間為30 min。

將印跡電極置于1×10-5mol·L-1吡蟲啉溶液中進行吸附測試，孵育不同時間后，進行DPV測試，孵育時間越長響應電流值越低，當孵育到10 min之后響應電流穩定在一定值，這是因為吡蟲啉在特異性吸附后達到了平衡，所以最佳孵育時間為10 min。

2.4 分子印跡膜厚度的確定

分子印跡膜厚度達到納米級別時，傳質效果和吸附速率最優。玻碳電極在1 mmol·L-1的吡蟲啉和4 mmol·L-1o-PD的pH=5.2醋酸鹽緩沖液中進行電聚合。用電量計算法[15]計算聚合膜的厚度，公式如式（1）所示。

式中：m—功能單體的質量，取4.326 mg；

Q—聚合過程中的總電量，在本次聚合過程中為0.1803 C；

F—法拉第常數，9.65×104C·mol-1；

A—電極表面積；

ρ—聚合膜的分子密度，g·cm-2，用o-PD的分子密度作為高分子的分子密度。

根據公式（1）算出薄膜的層厚為92 nm。

2.5 線性關系與檢測限結果

在最佳實驗條件下，配置含有1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11mol·L-1吡蟲啉標準溶液，將聚合電極在上述溶液中孵育10 min后，利用DPV法檢測，并將檢測結果繪制標準曲線，如圖4所示。由圖4可以看出，吡蟲啉濃度越大，響應電流值越低，并在1×10-4～1×10-12mol·L-1范圍內成良好的線性關系，經實驗確定其檢測限為1×10-12mol·L-1，線性方程為I=-5.323 81X+19.423 57，相關系數為0.995 09。

圖4 不同濃度吡蟲啉的DPV曲線

2.6 實際樣品檢測

為驗證Au/MIP/GCE傳感器在實際樣品中的檢測效果，對小白菜樣品上的吡蟲啉進行了加標回收實驗。將小白菜搗碎，乙腈溶液浸泡萃取，制得樣品溶液。利用該樣品溶液分別加入濃度為1、0.1 μmol·L-1吡蟲啉溶液，在最佳實驗條件下，使用傳感器對樣品進行測試，結果如表1所示。由表1可知，實驗得到的回收率為104.6%～105.7%，RSD為1.52%～1.65%。結果證明，該傳感器對實際樣品中IMI的測量是很有效的，并且擁有優異的精密度和準確性。

表1 小白菜樣品中IMI的回收實驗

3 結 論

本研究構建了一種聚合了金電層的吡蟲啉分子印跡傳感器。在1×10-4～1×10-12mol·L-1濃度區域內印跡傳感器對吡蟲啉有良好的線性，檢出限為1×10-12mol·L-1，對吡蟲啉品加標回收率為104.6%～105.7%，RSD為1.52%～1.65%。該吡蟲啉分子印跡傳感器具有良好的選擇性、靈敏性，可實現對實際樣品中吡蟲啉的快速檢測。