大黃魚ATG5基因的分子特征及促進病毒增殖的作用

魏祖運， 王 珊， 李婉茹， 王勝藍， 陳玉紅，母尹楠， 陳新華

(福建農林大學海洋學院，福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 福州 350002)

自噬(autophagy)廣泛存在于真核細胞中，是細胞自我保護、存活、更新、物質再利用和維持體內平衡的重要機制[1-2]。自噬的基本過程包括雙層膜結構自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體降解[3]。自噬體形成過程受到多種基因的調控，這些基因被稱為自噬相關基因(autophagyrelated gene，ATG)[4]。到目前為止，已經在酵母中鑒定了30多種自噬特異性調控基因，其中ATG5作為自噬泛素化過程的調節基因，在自噬體形成早期發揮重要作用[5]。ATG5可以結合ATG12和多聚蛋白ATG16形成ATG12-ATG5-ATG16復合物，該復合物有利于自噬小體的延伸[6-7]。ATG5復合物還能夠與自噬囊泡膜結合，促進LC3 (ATG8)向自噬囊泡聚集[8]。ATG5蛋白水平的升高或降低直接影響自噬通路，敲低ATG5能特異性地阻斷自噬體的形成[9-10]。

自噬作為細胞維持自穩定的一種自我保護機制，在病毒復制過程中發揮重要作用。已有研究報道，病毒感染會導致自噬體積累，并利用自噬體的雙層膜狀結構作為“病毒工廠”[11]。受小鼠(Mus musculus)肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)感染的細胞，自噬體的雙層膜中可以檢測到病毒成分，病毒RNA在雙層膜小泡上完成了復制和轉錄[12]。目前，關于自噬在魚類病毒感染中的功能研究仍相對較少。傳染性鮭魚貧血癥病毒(infectious salmon anaemia virus，ISAV)感染會誘導大西洋鮭(Salmo salar)細胞發生自噬，利用3-甲基腺嘌呤抑制自噬顯著抑制了ISAV的復制，說明自噬對于ISAV復制具有促進作用[13]。Liu等[14]研究發現，鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)感染增強了宿主細胞的自噬活性，而自噬促進了宿主細胞中SVCV增殖。然而，也有研究報道自噬發揮抗病毒作用，例如雷帕霉素誘導的自噬抑制了鯉上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini，EPC)細胞內傳染性造血器官壞死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)的復制和細胞外病毒的產生，而使用抑制劑阻斷自噬過程則加劇了病毒感染效應，說明自噬在IHNV感染中發揮抗病毒作用[15]。

大黃魚(Larimichthys crocea)是我國重要的海水經濟魚類，隨著大黃魚養殖業的快速發展，由病毒、細菌和寄生蟲引發的疾病頻繁暴發，給大黃魚產業造成了巨大的經濟損失[16-17]。因此，解析大黃魚應對病原感染的免疫應答機制將有助于制定有效的病害防治措施。本研究克隆并鑒定了大黃魚ATG5(LcATG5)基因，研究了LcATG5在正常大黃魚組織和免疫細胞中的表達水平及該蛋白對魚類病毒增殖的影響，本能實驗為闡明ATG5在魚類病毒感染中的功能及其機制提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用大黃魚體長(21.0 ± 1.8) cm，體重(105.0 ± 13.5) g購自寧德市富發水產有限公司，將隨機挑選的大黃魚置于3 t養殖桶中適應性養殖10 d，水溫為25 °C左右，使用增氧設備不間斷曝氣，每天早晚各換水1次。采集健康大黃魚的血液、鰓、腦、頭腎、皮膚、肌肉、脾臟、肝臟、胃、心臟、腸等組織或器官立即置于液氮中速凍，保存于?80 °C超低溫冰箱備用。本研究獲得了福建農林大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準(PZCASFAFU2019019)，實驗過程中操作人員嚴格遵守福建農林大學倫理規范，并按照福建農林大學倫理委員會制定的規章制度執行。

1.2 細胞與病毒

取健康大黃魚的頭腎組織，置于70 μm細胞濾網上輕輕研磨，用含1%肝素鈉的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗制成細胞懸液，再將細胞懸液添加到34%/51% Percoll溶液上，4 °C，650 ×g離心30 min。離心后，吸取中間細胞層，使用L-15培養基洗滌3次，再使用5 mL L-15培養基重懸細胞，按照每孔2.0 × 106個細胞接種到6孔板，28 °C 培養2 h，分別收集懸浮的原代淋巴細胞和貼壁的原代巨噬細胞。將研磨后制成的細胞懸液加到51% Percoll溶液上，4 °C，650 ×g離心30 min，收集離心管底部的大黃魚原代粒細胞。

大黃魚頭腎細胞系(LYCK)和EPC細胞保存于本實驗室，使用L-15細胞培養基(含10% FBS)進行培養，培養溫度為28 °C[18]。SVCV原液保存于本實驗室。

1.3 LcATG5基因克隆

從大黃魚基因組數據庫中查找到LcATG5基因的編碼序列，根據預測序列設計引物LcATG5-F和LcATG5-R(表1)，用于擴增LcATG5基因的開放閱讀框(ORF)。以大黃魚脾臟總RNA反轉錄得到的第一鏈cDNA為模板，使用EasyPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技術有限公司)進行PCR擴增，反應體系∶cDNA模板1 μL，EasyPfu 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP Mix 4 μL，10× PCR Buffer 5 μL，無菌水 37 μL；反應條件∶95 °C 預變性5 min；95 °C 變性30 s，56 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min，30個循環∶72 °C延伸5 min。PCR產物回收后與載體pMD20-T連接后，轉化大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α，挑取陽性克隆進行測序。

表1 引物信息Tab. 1 Primer information

1.4 生物信息學分析

從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中檢索了其他物種ATG5的氨基酸序列(表2)，再使用NCBI中的BLAST工具進行氨基酸序列一致性分析。使用DNAMAN 8.0軟件進行氨基酸多序列比對，并使用BOXSHADE進行著色。使用Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)分析蛋白結構域。使用MEGA6.0軟件的鄰接法(Neighborjoining)構建系統進化樹。

1.5 LcATG5在大黃魚組織和免疫細胞中的表達分析

提取上述組織、器官或免疫細胞的總RNA，反轉錄cDNA為模板，利用針對LcATG5基因的特異性引物RT-LcATG5-F和RT-LcATG5-R(表1)，并以大黃魚β-actin基因作為內參基因，進行熒光定量PCR反應，檢測LcATG5在健康大黃魚組織、器官和免疫細胞中的表達水平。熒光定量PCR反應體系∶2×SYBR Green I 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，cDNA模板0.2 μL，無菌水9.6 μL。反應條件∶95 °C 預變性2 min，95 °C 變性15 s，57 °C 退火20 s，72 °C 延伸20 s，共40個循環。LcATG5的相對表達水平采用2?△△CT方法計算[19]，并用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。

將分離的大黃魚頭腎原代巨噬細胞、淋巴細胞和粒細胞以及LYCK細胞接種于6孔板內(2.0×106個/孔)，28 °C培養3 h后，使用終濃度為50 μg/mL的poly(I:C)(Sigma-Aldrich，美國)刺激細胞，無菌PBS處理的細胞作為對照，分別于刺激后4、8、12、24和48 h收集細胞，再利用熒光定量PCR分析LcATG5的表達變化。

1.6 蛋白質免疫印跡

將LcATG5的ORF序列插入到真核表達載體pcDNA3.1(Invitrogen，美國)的EcoR I和KpnI兩個酶切位點之間，得到重組質粒pcDNA3.1-LcATG5。將EPC細胞(1×106個/孔)接種于6孔板后過夜培養，再使用Fugene HD轉染試劑(Promega，美國)將2 μg重組質粒pcDNA3.1-LcATG5或對照質粒pcDNA3.1轉染EPC細胞，24 h后收集細胞，使用細胞裂解緩沖液(碧云天生物技術，中國)裂解細胞，4 °C，14000×g離心15 min，收集上清液。上清內蛋白經15% SDS-PAGE電泳后，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下在含有5%(質量體積比)脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉1 h，再與小鼠抗6×His標簽的單克隆抗體(1∶2000；Thermo Fisher，美國)孵育1 h，使用TBST緩沖液洗滌3次，然后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(H+L)多克隆抗體(1∶4000；Thermo Fisher，美國)孵育1 h，TBST緩沖液洗滌后，最后使用化學發光檢測試劑(NCM Biotech，中國)進行顯色。

1.7 病毒感染實驗

將EPC細胞(1×106個/孔)接種于6孔板后過夜培養，使用Fugene HD轉染試劑將2 μg重組質粒pcDNA3.1-LcATG5或pcDNA3.1轉染EPC細胞，24 h后，每孔加入1 mL 106TCID50/mL SVCV感染細胞，1 h后移除病毒，加入含10%胎牛血清的L-15培養基培養細胞。分別于感染后12和24 h在顯微鏡下觀察細胞病變效應，并使用含1%結晶紫的溶液對細胞進行染色；同時于感染后24 h收集細胞培養上清檢測病毒滴度，于感染后12 和24 h收集細胞提取總RNA，采用熒光定量PCR檢測SVCV糖蛋白基因(SVCV- G)、基質蛋白基因(SVCV- M)和磷蛋白基因(SVCV- P)的表達水平，內參為鯉β-actin基因。

2 結果

2.1 大黃魚ATG5基因的分子特征與進化分析

LcATG5(GenBank登錄號∶XM_027287056.1)的ORF全長為828個核苷酸，編碼275個氨基酸的蛋白質(圖1)，其預測分子量為32.32 ku，理論等電點為5.7。與其他物種ATG5氨基酸序列相似，LcATG5含有1個高度保守的APG5結構域(第79～270位氨基酸)，并具有典型的泛素連接酶特征，包括2個泛素樣結構域(ubiquitin-like domain)，分別位于第16～105位和第185～273位氨基酸，1個富螺旋結構域(helix-rich domain；第121-171位氨基酸)和1個保守的鈣蛋白酶切割位點(calpain cleavage site；第188～196位氨基酸；圖2)。此外，LcATG5序列中還發現了與ATG12結合的位點Lys149(圖2)。序列一致性分析發現，LcATG5與其他魚類ATG5序列的一致性較高，約為86.18%～98.55%，但是與哺乳類、兩棲類、爬行類和鳥類同源基因的一致性相對較低，為80.43%～81.52%(表2)。系統進化分析顯示，魚類ATG5聚成一簇，遠離兩棲類、鳥類和哺乳類組成的分支，其中LcATG5與棘頭梅童魚ATG5的親緣關系最近(圖3)。

圖1 大黃魚ATG5核苷酸與氨基酸序列特征“*”表示終止密碼子，灰色陰影指示保守的APG5結構域。Fig. 1 The nucleotide and amino acid sequence characteristics of LcATG5Terminational codon is indicated by “*” and APG5 domain is shaded by gray.

圖2 大黃魚ATG5與其他物種ATG5氨基酸序列比對序列上方的箭頭指示ATG5保守的結構域，包括2個泛素樣結構域(ubiquitin-like domain)和1個富螺旋結構域(helix-rich domain)。黑色虛線方框指示鈣蛋白酶裂解位點(calpain cleavage)。黑色三角▲標出的賴氨酸殘基為ATG12偶聯位點。Fig. 2 Alignment of ATG5 amino acid sequences from L. crocea and other vertebratesArrows above the sequences represent the conserved domains of ATG5, including two ubiquitin-like domains and a helix-rich domain. The calpain cleavage site is boxed by black dotted line and a lysine residue as the conjugation site for ATG12 is indicated by ▲.

圖3 鄰接法構建的ATG5系統進化樹Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed based on ATG5 amino acid sequences

2.2 LcATG5在大黃魚不同組織和細胞中的表達特征

LcATG5在所有檢測的組織或器官中均有表達，在血液中表達量最高，在脾臟中表達量最低(圖4-a)。此外，LcATG5在所檢測的免疫細胞中也都有表達，相對表達水平最高的細胞是原代粒細胞，其次是原代淋巴細胞和LYCK細胞，最低的是原代巨噬細胞(圖4-b)。Poly(I:C)刺激后，LcATG5在這4種免疫細胞中的轉錄水平都發生了顯著上調，在LYCK細胞和原代淋巴細胞中的表達量都是在處理后12 h達到峰值，分別是對照組的3.93和1.43倍(圖5-a，c)；LcATG5在原代巨噬細胞中的表達量從刺激后12 h開始上調，在48 h達到峰值，是對照組的1.57倍(圖5-b)，而其在原代粒細胞中的表達量在12 h達到峰值，是對照組的2.73倍(圖5-d)。

圖4 LcATG5在大黃魚組織/器官和免疫細胞中的表達模式(a) LcATG5在大黃魚組織/器官中的表達譜。1. 血液，2. 肌肉，3. 腸，4. 鰓，5. 腦，6. 心臟，7. 肝臟，8. 皮膚，9. 胃，10. 頭腎，11. 脾臟；(b) LcATG5在大黃魚免疫細胞中的表達譜。1. 原代頭腎粒細胞，2. 原代頭腎淋巴細胞，3. 大黃魚頭腎細胞系(LYCK)，4. 原代頭腎巨噬細胞。Fig. 4 Expression profiles of LcATG5 in tissues/organs and immune cells(a) Relative expression levels of LcATG5 transcripts in different tissues of L. crocea. 1. blood, 2. muscle, 3. intestine, 4. gills, 5. brain, 6. heart, 7. liver, 8.skin, 9. stomach, 10. head kidney, 11. spleen; (b) relative expression levels of LcATG5 in immune-related cells of L. crocea 1. primary head kidney granulocytes, 2. primary head kidney lymphocytes, 3. L. crocea head kidney cell line (LYCK), 4. primary head kidney macrophages.

圖5 Poly (I:C) 刺激后免疫細胞中LcATG5的表達水平變化使用終濃度為50 μg/mL poly (I:C) 分別刺激大黃魚頭腎細胞系(a)、原代巨噬細胞(b)、原代淋巴細胞(c)和原代粒細胞(d)；*. P＜ 0.05，**. P ＜0.01。Fig. 5 Expression changes of LcATG5 in immune cells after stimulation with poly (I:C)L. crocea head kidney cell line (a), primary macrophages (b), primary lymphocytes (c), and primary granulocytes (d) were treated with poly (I:C) at a final concentration of 50; *. P ＜ 0.05, **. P ＜ 0.01.

2.3 LcATG5過表達促進SVCV病毒的復制

為了確定LcATG5在病毒感染過程中的作用，我們在EPC細胞中過表達LcATG5，然后使用SVCV感染EPC細胞，檢測LcATG5過表達對SVCV復制的影響。結果顯示，在EPC細胞中能夠檢測到LcATG5蛋白表達 (圖6-a)，SVCV感染12和24 h 后，LcATG5的表達水平顯著上調(圖6-b)；過表達LcATG5的EPC細胞中的細胞病變效應(CPE)明顯多于對照組(圖7-a)，并且細胞經結晶紫染色后也顯示出相似的結果(圖7-b)；同時過表達LcATG5的EPC細胞培養上清液中SVCV滴度為1013.82TCID50/mL，顯著高于對照組109.27TCID50/mL(圖7-c)，細胞內SVCV標志基因SVCV-G、SVCVM和SVCV-P的表達水平也顯著高于對照組，在24 h時分別是對照組的13.83、15.72和11.39倍(圖7-d～f)。上述結果表明，LcATG5促進了EPC細胞中SVCV的復制。

圖6 LcATG5在EPC細胞中表達水平分析(a)蛋白免疫印跡分析LcATG5在EPC細胞中表達情況，1. 對照，2. LcATG5，下同；(b)熒光定量PCR檢測SVCV感染EPC細胞12和24 h后 LcATG5的轉錄水平。Fig. 6 Expression level of LcATG5 in EPC cells(a) Western blotting was used to detect the overexpression of LcATG5 in EPC cells, 1. control, 2. LcATG5, the same below; (b) the expression level of LcATG5 genes was detected in EPC cells at 12 and 24 h post-infection by real-time PCR.

3 討論

自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性降解途徑，在維持細胞存活、更新、物質再利用和內環境穩定中起著重要作用。自噬在病毒感染過程中也發揮著重要作用，可以將細胞質內的病毒顆粒轉運到溶酶體，利用溶酶體清除病毒，也可以將病毒轉運給細胞內感受器或MHCⅡ類分子激活先天性或適應性免疫應答[20]。自噬在病毒感染中的作用具有雙重性，一方面自噬能夠降解入侵的病毒，另一方面有些病毒能夠利用自噬的過程進行復制、增殖[21]，這取決于病毒和細胞的類型以及細胞所處環境[11,22]。目前關于自噬和自噬相關基因(ATG)在魚類病毒感染過程中報道還相對較少。我們前期的研究發現，大黃魚自噬相關基因Beclin-1通過誘導自噬或負調控I型干擾素反應促進病毒復制[23]。本研究從大黃魚中克隆了ATG5基因(LcATG5)，其ORF全長為828個核苷酸，編碼一個含有275個氨基酸的蛋白質，具有1個保守的APG5結構域和典型的泛素連接酶特征，包括2個泛素類結構域和1個富螺旋結構域，這三個結構域相互作用形成凹槽，再與ATG16氨基端的螺旋結構結合[6]。LcATG5序列中還包含1個calpain切割位點，其基序與草魚和斑馬魚的相同，該位點經過calpain選擇性剪切，ATG5可在該位點分割成兩種形式，分別作為分子開關引導細胞進入自噬或凋亡[24]。此外，與黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)ATG5結構類似，LcATG5存在保守的Lys-149，能夠與ATG12的Gly-186偶聯，這是自噬小體形成的關鍵步驟[25]。系統進化分析顯示，LcATG5與其他魚類ATG5處于硬骨魚類分支中，表明本研究克隆得到的LcATG5確實為ATG5的同源基因，并且LcATG5與棘頭梅童魚ATG5的序列一致性最高，為98.55%。綜上結果表明LcATG5在進化過程中保留了保守的結構特征，也預示了其功能的保守性。

LcATG5在所有檢測的組織或器官中呈組成型表達，這種組成型表達模式在其他魚類，如石斑魚、黃顙魚和草魚中都有報道，說明自噬是在魚體內是一個普遍的過程，可能與各個組織的生理功能密切相關。進一步比較分析發現，LcATG5在大黃魚血液中的表達量最高，在脾臟中的表達量最低，這與石斑魚、黃顙魚和草魚中報道的結果明顯不同，石斑魚和黃顙魚ATG5都是在腦組織中的表達量相對較高[26-27]，而草魚ATG5的表達量在鰓組織中相對較高，在中腎部位表達量較低[28]，上述結果表明，不同魚類中ATG5的組織分布模式存在明顯差異，可能是由于魚種差異或生存環境不同導致的。此外，LcATG5基因在原代巨噬細胞、淋巴細胞和粒細胞以及LYCK細胞中也均有表達，提示LcATG5可能參與大黃魚免疫應答過程。

ATG5啟動雙膜囊泡形成是自噬過程的重要步驟，ATG5在病毒復制過程中的功能在哺乳類中已經被證實[29]。目前在魚類中的研究相對較少，赤點石斑魚神經壞死病毒(RGNNV)和石斑魚虹彩病毒(SGIV)感染后，石斑魚ATG5的轉錄水平顯著升高[26]；病毒類似物poly (I:C) 刺激24 h，草魚CIK細胞中ATG5的表達水平也顯著上調[28]。在本研究中，poly (I:C) 處理后，LcATG5在大黃魚4種免疫細胞中的表達水平均顯著上升，表明魚類ATG5可能在病毒感染過程中發揮作用。進一步研究發現，過表達LcATG5可顯著增加了SVCV感染引起的CPE現象，同時感染細胞培養上清液中SVCV滴度和細胞內SVCV標志基因的表達水平均顯著升高，表明LcATG5促進了SVCV病毒在EPC細胞中復制。已有研究報道，過表達石斑魚ATG5促進RGNNV和SGIV復制，草魚ATG5顯著抑制草魚呼腸孤病毒(GCRV)感染后IFN-I的表達。因此，實驗推測魚類病毒可能利用ATG5參與形成的雙膜囊泡進行復制，并且ATG5通過抑制I型干擾素反應影響魚類的抗病毒免疫應答。

4 結論

綜上所述，本研究從大黃魚中鑒定出一個ATG5基因，其在所有檢測的組織、器官和免疫細胞中呈組成型表達，同時poly(I:C) 刺激顯著上調了免疫細胞中LcATG5的表達水平。功能研究發現，過表達LcATG5能夠促進EPC細胞中SVCV增殖，但是具體機制有待明確。這些研究結果將為深入研究自噬和自噬相關基因在魚類病毒感染過程中的作用及機制奠定了基礎。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）