基于Nrf 2/HO-1啟動子篩選抗水生病毒藥物的方法

王靖雯， 吳苗苗， 李莉娟,2， 顧澤茂,2， 袁軍法,2*

(1. 華中農業大學水產學院，湖北 武漢 430070；2. 華中農業大學，水生動物疫病專業實驗室，湖北 武漢 430070)

水生動物病毒病種類多、流行廣、傳播快、死亡率高，是限制水產養殖業綠色發展的重要因素[1-2]。因抗病毒藥物缺失、疫苗種類有限，水生動物病毒病的防控始終是水產養殖中的難點，篩選綠色、廣譜的抗病毒藥物，建立高效防控技術體系是水生動物病毒研究的核心目標[3-4]。氧化應激是鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)、草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)等多種病毒感染的主要病理機制之一[5-6]?？寡趸纷鳛橐环N內源性的防御機制，除維持機體氧化-還原平衡穩態外，還可拮抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和SVCV等多種病毒，而蘿卜硫素、雷公藤紅素等作為藥食同源的抗氧化劑，也被證實具有較好的抗病毒作用[7-8]。因此，靶向抗氧化通路，篩選具有抗病毒作用的抗氧化劑，可為開發綠色、廣譜的抗水生病毒藥物提供新思路[9]。

核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)是細胞中氧化應激的主要傳感器，可啟動下游包括血紅素加氧酶1(HO-1)在內的抗氧化及解毒基因的轉錄與翻譯[10]。HO-1是將血紅素分解為膽綠素、Fe2+和CO的關鍵酶，在維持機體氧化還原平衡方面起關鍵作用[11-12]。此外Nrf2/HO-1信號通路還廣泛參與到機體的生長、分化、代謝、免疫等多種生命過程中，通過其下游醌氧化還原酶1(NQO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化/二相解毒酶維持機體的穩態[13-14]。Nrf2/HO-1信號通路是機體最重要的抗氧化防御系統，姜黃素、蘿卜硫素、雷公藤紅素等藥物可通過激活Nrf2介導的HO-1表達來緩解病毒感染引起的氧化應激并抑制病毒復制[7-8,15-16]。靶向Nrf2/HO-1信號通路的抗病毒藥物，通過激活抗氧化和抗炎癥等內源性防御通路發揮作用，具有廣譜性。這些藥物不直接作用于病毒本身，減少了耐藥性的產生，為開發綠色高效的抗病毒藥物提供了靶標。

胖頭鱥上皮細胞(FHM)對SVCV、RGV、大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus salmoidesrhabdovirus，MSRV)、傳染性胰臟壞死病毒 (infectious ancreatic necrosis virus，IPNV) 等多種水生動物病毒敏感，是病毒診斷、致病機制與病毒復制規律研究的重要材料[17-19]。本實驗利用胖頭鱥(Pimephales promelas)基因組數據，分析并構建了Nrf2、HO-1啟動子報告質粒，建立靶向其啟動子活性的藥物篩選方法，為抗水生動物病毒的藥物篩選提供了基礎工具和新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用FHM細胞系、SVCV、RGV均為本實驗室保存。

1.2 藥物與主要試劑

DNA提取試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix (with blue dye) 、膠回收試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司；DNA Marker、DH5α菌株購自北京擎科新業生物技術有限公司；限制性內切酶購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；低內毒素真核質粒提取試劑盒購自Magen公司；胎牛血清、M199培養基、0.25%EDTA胰酶以及OPTI-MEM培養液購自Gibco；FishTrans轉染試劑購自武漢美森特生物科技有限公司；姜黃素[95%(HPLC)，S19245]、白藜蘆醇(BR, 98%，S30630)、穿心蓮內酯(98%，S24818)、水飛薊賓[98%(HPLC)，Y53945]購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自Biosharp公司；pGL3- Basic、pRLTK1、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；pTOPO001 Simple Cloning Kit載體試劑盒購自北京金沙生物科技有限公司；TRIzol、反轉錄及定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成與測序由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.3 FHM Nrf2、HO-1基因啟動子的生物信息學分析

利用NCBI數據庫[National Center for Biotechnology Information (nih.gov)]獲取FHMNrf2(Gene ID: 120459756、NCBI Reference Sequence:XM_039647189.1)和HO-1(Gene ID: 120467971、NCBI Reference Sequence: XM_039656609.1)的基因組DNA序列及mRNA序列，利用AnimalTFDB3.0[AnimalTFDB3 (hust.edu.cn)]、JASPAR(JASPAR -A database of transcription factor binding profiles(genereg.net))在線軟件對轉錄因子結合位點進行預測。利用MethPrimer軟件[MethPrimer | Tools and Databases | The Li Lab (urogene.org)]預測CpG島。

1.4 質粒載體的構建

根據胖頭鱥基因組序列設計擴增引物(表1)，上下游引物的酶切位點以下劃線表示。提取FHM細胞的DNA，進行PCR擴增。 PCR體系共20 μL∶2X M5 HiPer plusTaqHiFi PCR mix (with blue dye)10 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL 。反應程序∶95 °C預變性3 min，94°C變性 25 s，根據引物Tm值設置退火溫度，退火25 s，72 °C延伸(10～15 s / kb )，35個循環；72°C延伸5 min。PCR 產物經 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測有明亮單一條帶后切膠回收。將純化后的擴增產物與pGL3-basic 載體進行雙酶切處理?；厥占兓蟮膯幼悠魏洼d體按物質的量 3∶1 混合，T4 DNA 連接酶 16 °C連接 12 h，轉化入DH5α 感受態細胞，涂布氨芐西林(Amp)抗性的平板，37 °C倒置培養12 h。對單菌落進行菌液PCR檢測，將陽性菌送測序，驗證序列是否正確。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 細胞培養及瞬時轉染

FHM細胞用含有10% FBS的M199培養基培養，培養溫度為28 °C，待細胞平鋪長滿孔板的80%～90%進行轉染。轉染試劑、質粒的配比及操作步驟按FishTrans轉染試劑使用說明進行。

1.6 啟動子活性分析

為評價藥物的細胞毒性，使用含不同濃度藥物的培養基(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL)對FHM進行藥物處理，同時設置陰性對照 (negative control, NC) 和二甲基亞砜 (DMSO)組，每個濃度設置6個重復，28 °C繼續培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑在培養箱內繼續孵育2.5 h，酶標儀于450 nm處測量吸光值，計算細胞活力。

轉染重組啟動子質粒及pRL-TK質粒24 h后，將白藜蘆醇、水飛薊賓、穿心蓮內酯和姜黃素4種藥物以10.0 μg/mL的濃度同細胞孵育，28 °C作用24 h后，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明進行熒光素酶活性檢測。再次轉染重組啟動子質粒及pRL-TK質粒，24 h后將上述初步篩選有效的藥物—水飛薊賓、穿心蓮內酯、姜黃素，進行梯度稀釋，選取基于藥物細胞毒性實驗確定的6個藥物濃度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0 μg/mL)對細胞進行處理，28 °C作用24 h后，檢測藥物濃度梯度對啟動子活性的影響。

1.7 抗病毒實驗

以6.3 μg/mL的姜黃素和穿心蓮內酯分別預處理細胞6 h，再分別以0.1感染復數 (multiplicity of infection，MOI)的SVCV和RGV進行感染，28 °C孵育1 h后更換為含相應藥物濃度的培養基繼續培養。收取細胞上清液及細胞樣，測定病毒滴度及病毒復制水平，驗證基于啟動子活性的藥物篩選策略。將收集的細胞培養上清連續10倍稀釋(10?1～10?10)，每個梯度6個重復，加入細胞培養板，每孔100 μL，同時用稀釋液做陰性對照，培養7 d后觀察并記錄全部孔的細胞病變，再根據Reed-Muench兩氏法計算出病毒滴度。

以RGV9506 (GenBank: JQ654586.1)的MCP序列(ORF97R)設計引物，建立RGV的絕對定量方法，評價藥物對RGV感染的影響。提取細胞樣DNA，以RGV感染組DNA樣品為模板進行PCR擴增，回收后按pTOPO001 Simple Cloning Kit載體試劑盒說明進行連接、轉化及陽性克隆的鑒定。提取標準重組質粒并測量濃度，然后依據公式計算每微升樣品中質?？截悢怠妹课⑸|?？截悢? 拷貝 / μL) = 質?？傎|量( μg / μL) /質粒分子量；質粒分子量 = 2 × 330 × nt(其中 nt 為質粒的堿基數) 。標準重組質粒進行10倍的梯度稀釋后定量檢測，得到標準曲線。提取細胞樣的DNA，進行實時熒光定量PCR(qPCR) 實驗對 RGV進行定量，RGV定量引物如表1所示。定量檢測SVCV-G的轉錄水平，評價藥物對SVCV復制的影響。提取細胞樣的總RNA并反轉錄為cDNA后進行qPCR，對SVCV G蛋白的mRNA水平進行定量檢測，SVCV-G定量引物如表1所示。

1.8 統計分析

所有實驗數據均采用雙樣本等方差t檢驗進行處理，*，P＜ 0.05； **，P＜ 0.01 或 ***，P＜ 0.001。

2 結果

2.1 Nrf2、HO-1基因啟動子的生物信息學分析

通過NCBI數據庫獲取Nrf2和HO-1的DNA序列，分別選取編碼區(CDS區)起始密碼子ATG前后2482和2104 bp作為Nrf2和HO-1基因啟動子候選區，利用Animal TFDB3.0、JASPAR等軟件分別對Nrf2和HO-1啟動子區的轉錄因子結合位點進行預測，結果顯示，Nrf2和HO-1啟動子區存分別存在FOXO、ATF、IRF、AP-1、FOS和Nrf2、Bach1、SP-1、STAT等多種潛在轉錄因子結合位點(圖1)。利用MethPrimer預測到Nrf2啟動子中存在一個CpG島，位于2125～2243 bp，而HO-1啟動子中存在3個CpG島，分別位于53～156 bp、704～852 bp、1156～1276 bp(圖2)。

圖1 FHM Nrf2(a)和HO-1(b)基因啟動子區轉錄因子結合位點預測Fig. 1 Predicted transcription factor binding sites in the promoter region of FHM Nrf2 (a) and HO-1 (b) genes

圖2 FHM Nrf2(a)和HO-1(b)基因啟動子序列CpG島預測結果Fig. 2 Predicted results of CpG islands of promoter sequences of FHM Nrf2 (a) and HO-1 (b) genes

2.2 Nrf2和HO-1基因啟動子片段的擴增和報告載體的構建

構建FHMNrf2、HO-1啟動子報告質粒(圖3-a)。PCR擴增Nrf2和HO-1基因啟動子片段，回收后分別使用KpnⅠ、XhoⅠ和XhoⅠ、Hind III限制性內切酶對擴增片段及pGL3-Basic進行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖3-b)。結果顯示，在2000 bp附近及2000～3000 bp存在單一明亮的特異性條帶，與預期的大小一致，經連接、轉化、陽性單克隆菌液PCR及測序后確認獲得pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1重組雙熒光素酶質粒。

圖3 FHM Nrf2、HO-1啟動子報告質粒的構建(a) Nrf2、HO-1啟動子報告質粒構建流程圖，(b) Nrf2基因啟動子片段及pGL3-Basic質粒的雙酶切，(c) HO-1基因啟動子片段及pGL3-Basic質粒的雙酶切；1. pGL3-Basic質粒雙酶切產物，2. Nrf2基因啟動子片段雙酶切產物，3. pGL3-Basic質粒雙酶切產物，4. HO-1基因啟動子片段雙酶切產物，M. 分子質量標準DL5000。Fig. 3 Construction of FHM Nrf2 and HO-1 promoter reporter plasmids(a) flow chart for the construction of FHM Nrf2, HO-1 promoter reporter plasmid, (b) double digestion of Nrf2 gene promoter fragment and pGL3-Basic plasmid, (c)double digestion of HO-1 gene promoter fragment and pGL3-Basic plasmid; 1. pGL3-Basic plasmid double digestion product, 2. Nrf2 gene promoter fragment double digestion product, 3. pGL3-Basic plasmid double digestion product, 4. HO-1 gene promoter fragment double digestion product, M. molecular quality standard DL5000.

2.3 基于啟動子活性的藥物篩選

選取白藜蘆醇、水飛薊賓、穿心蓮內酯和姜黃素4種中草藥有效成分來探究藥物對Nrf2和HO-1啟動子活性的影響，驗證啟動子的活性。細胞毒性實驗顯示，4種藥物的濃度在25.0 μg/mL以下時對細胞無明顯毒性(圖4)，當濃度升至50.0 μg/mL時，除姜黃素外，其他3種藥物的細胞存活率均大于70%。

以10.0 μg/mL的藥物濃度進行初步篩選實驗。結果顯示，水飛薊賓和姜黃素可顯著上調Nrf2的啟動子活性，而穿心蓮內酯和姜黃素則可顯著上調HO-1的啟動子活性(圖5)。選取以上3種有效藥物，對不同濃度藥物刺激下的啟動子活性進行檢測，結果顯示，6.3 μg/mL的水飛薊賓可有效上調Nrf2和HO-1的啟動子活性；穿心蓮內酯各濃度均未能顯著激活Nrf2的啟動子，相反，3.1～50.0 μg/mL的穿心蓮內酯均可顯著激活HO-1啟動子，其中6.3 μg/mL的效果最為顯著；姜黃素中除因藥物毒性導致細胞大量死亡的50.0 μg/mL，其他濃度均可顯著上調Nrf2的啟動子活性，但只有6.3 μg/mL的姜黃素濃度可顯著上調HO-1的啟動子活性(圖6)。

圖5 四種藥物對Nrf2 (a)、HO-1 (b) 啟動子活性的影響1. 對照，2. 白藜蘆醇，3. 水飛薊賓，4. 穿心蓮內酯，5. 姜黃素；*.表示差異顯著(P＜0.05)；下同。Fig. 5 Effects of four drugs on Nrf2 (a) and HO-1 (b)promoter activity1. control, 2. resveratrol, 3. silybin, 4. andrographolide, 5. curcumin; *.means the difference is significant (P＜0.05); the same below.

圖6 不同藥物濃度對Nrf2、HO-1啟動子活性的影響(a)～(c)分別表示不同濃度的水飛薊賓、穿心蓮內酯和姜黃素對Nrf2啟動子活性的影響，(d)～(f)分別表示不同濃度的水飛薊賓、穿心蓮內酯和姜黃素對HO-1啟動子活性的影響；1. NC，2. 3.1 μg/mL，3. 6.3 μg/mL，4. 12.5 μg/mL，5. 25.0 μg/mL，6. 50.0 μg/mL。Fig. 6 Effect of different drug concentrations on the activity of Nrf2 and HO-1 promoters(a)-(c)the effects of different concentrations of silybin, andrographolide and curcumin on Nrf2 promoter activity, (d)-(f)the effects of different concentrations of silybin, andrographolide and curcumin on HO-1 promoter activity; 1. NC，2. 3.1 μg/mL, 3. 6.3 μg/mL, 4. 12.5 μg/mL, 5. 25.0 μg/mL, 6.50.0 μg/mL.

2.4 抗病毒活性

為驗證姜黃素和穿心蓮內酯激活Nrf2和HO-1的啟動子是否與抗病毒活性關聯，分別以姜黃素和穿心蓮內酯對FHM細胞進行孵育，再分別以RGV和SVCV感染FHM，以含相應濃度藥物的維持培養基繼續培養。結果顯示，SVCV和RGV感染可誘導細胞產生明顯的CPE，姜黃素和穿心蓮內酯的處理可顯著緩解病毒感染引起的細胞病變(圖版)。

構建的RGV熒光定量標準曲線(y=-3.413x+40.60)具有較好的線性關系(圖7)。姜黃素處理組和穿心蓮內酯處理組可分別減少約40%和60%的RGV拷貝量；姜黃素處理組和穿心蓮內酯處理組較對照組分別下調約20%和60%的SVCVG水平。滴度結果也證實，藥物處理可減少培養基上清中的病毒粒子含量，其中穿心蓮內酯的效果更為顯著，RGV和SVCV的病毒滴度分別下降了25%和23%(圖8)。

圖7 靶向MCP基因的RGV定量標曲Fig. 7 Quantitative standard curve of RGV targeting MCP gene

圖8 藥物的抗病毒活性檢測(a) 絕對/相對定量檢測病毒的復制水平，(b) 藥物處理后病毒的滴度檢測；1. 病毒感染組，2. 姜黃素組，3. 穿心蓮內酯組。Fig. 8 Detection of antiviral activity of drugs(a) absolute/relative quantification of viral replication levels, (b) titer detection of viruses after drug treatment; 1. virus infection group, 2. curcumin group, 3. andrographolide group.

3 討論

啟動子是基因的開關，位于結構基因5‘端的上游，與轉錄因子一起，從起始時間和表達程度上對基因的轉錄進行調控[20]。本實驗對Nrf2、HO-1啟動子區的轉錄因子結合位點及CpG島進行了預測。Nrf2啟動子序列中預測到的潛在轉錄因子結合位點較為分散，其中存在與細胞增殖、凋亡、分化和炎癥相關的ATF家族，涉及細胞生長發育及代謝周期調控的FOX家族，以及IRF 家族的結合位點。HO-1啟動子序列中的潛在轉錄因子結合位點較為集中，其中FOS、JUN、MAF、BACH1、AP-1、Nrf2等HO-1轉錄調控中常見的轉錄因子集中在1240～1260 bp。在人(Homo sapiens)的HO-1啟動子序列中同樣預測到IRF-1、AP-1和STAT的結合位點[21]。CpG島主要分布在啟動子區，CpG島的甲基化可影響轉錄因子的結合，對基因的表達產生負調控作用[22]。牙鲆(Paralichthys olivaceus)的Nrf2啟動子中存在2個CpG島，且急性缺氧可顯著降低CpG島的甲基化，促進Nrf2的表達。與牙鲆不同，胖頭鱥的Nrf2啟動子中預測到1個CpG島[10]。 人類的HO-1啟動子區中存在一個長307 bp的CpG島，而胖頭鱥的HO-1啟動子中預測到3個預測的CpG島[21]。此外研究表明，Nrf2啟動子區域rs13005431位點的多態性變化會改變Nrf2的轉錄活性，影響對結核病的易感性；哺乳動物的HO-1啟動子的多態性也被證明與肺部和心腦血管等疾病密切相關[23-24]。但水生動物鮮有啟動子多態性與疾病聯系的相關研究，相關研究的展開將對抗病育種具有積極意義。

近年來，關于Nrf2/HO-1信號通路參與病毒復制及病理機制的研究逐漸深入。Nrf2和HO-1具有廣譜的抗病毒活性，HO-1可誘導IFN-1表達并抑制HCV的NS3/4A蛋白酶活性；Nrf2介導的HO-1表達還可抑制寨卡病毒(Zika virus，Zika)及單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)等病毒的增殖[7,25-26]。研究已證實多種藥物可靶向Nrf2和HO-1信號通路發揮抗病毒作用∶青蒿的類黃酮衍生物DMO-CAP處理可誘導p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、JNK/MAPK和ERK/MAPK磷酸化，激活Nrf2/HO-1，抑制甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的增殖[27]；青蒿琥酯通過激活AMPK依賴的Nrf2/HO-1信號通路來抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的復制[28]。魚類中也有研究表明，蘿卜硫素、香豆素衍生物BBC和α-脂質酸可靶向于Nrf2/HO-1通路抑制SVCV和病毒性出血敗血癥病毒(viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)[8,29-30]。靶向內源性防御通路Nrf-2/HO-1的抗病毒策略為廣譜抗病毒藥物的篩選提供了新的思路，基于此，本實驗構建了Nrf2、HO-1的啟動子報告質粒，評價了靶向Nrf2/HO-1啟動子活性的抗病毒藥物篩選方法。該方法利用靈敏度高、檢測線性范圍廣的熒光素酶報告系統，以熒光信號強度定量表示啟動子活性的強弱。與靶向病毒基因的藥物篩選方式相比，該方法不受病毒種類的限制，適用于所有可引起氧化應激的水生生物病毒，具有廣譜性，也不易產生耐藥性[31]。與基于活體實驗及細胞病變程度的傳統藥物篩選方法相比，該方法篩選周期短，易于操作與重復，可用于抗水生病毒藥物初篩[32]。

姜黃素可通過PKC的磷酸化激活Nrf2；穿心蓮內酯可通過p38/MAPK的磷酸化促使Nrf2入核介導HO-1的表達，以發揮其抑制HCV、COVID-19等多種病毒的抗病毒作用[15,33-35]。本研究也證實姜黃素和穿心蓮內酯可激活FHMNrf2、HO-1的啟動子活性，抑制RGV和SVCV的增殖。白藜蘆醇是常見的多酚之一，被普遍認為具有抗氧化、抗癌癥等功能。研究表明白藜蘆醇在3.1～100.0 μmol/L時均可顯著激活HEK293T細胞中抗氧化元件(ARE)的啟動子活性，在50.0 μmol/L時可激活PI3K/Akt介導的Nrf2信號通路以減輕氧化應激誘導的腸道屏障損傷。本實驗以10.0 μg/mL的濃度進行藥物初篩時，白藜蘆醇并未激活FHMNrf2、HO-1的啟動子活性[36-38]。隨著對白藜蘆醇研究的逐漸深入，其保護作用開始出現爭議∶白藜蘆醇可增強HCV的復制，不適用于慢性丙型肝炎的抗氧化治療；存在雙相刺激劑量依賴性反應及晝夜節律，即在低劑量下及暗期為抗氧化劑，存在保護作用，高劑量下及光照期作為促氧化劑，通過下調PKB/Akt的磷酸化增加氧化應激[36,39-41]。這些均表明白藜蘆醇的抗氧化效應在不同細胞、濃度、狀態下不同。

本實驗分析并構建了胖頭鱥Nrf2、HO-1啟動子報告質粒，并在此基礎上建立了基于抗氧化信號通路的抗病毒藥物篩選方式，分別以DNA病毒RGV和RNA病毒SVCV驗證了該藥物篩選方式的有效性，為魚類抗病毒藥物的高效快速篩選提供了新方法。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）