大理州4縣(市)家畜布魯氏菌病血清學調查與分析

趙燦奇

(大理州動物疫病預防控制中心,云南 大理 671005)

布魯氏菌病(簡稱布病),是一種由布魯氏菌引起的人畜共患病[1],世界動物衛生組織(WOAH)將其列為必須通報的重要動物疫病,我國將其列為二類動物疫病[2,3]。動物布魯氏菌病主要侵害動物生殖系統,以母畜流產和公畜睪丸炎為主要特征,人可通過接觸病羊、病牛及其流產物,或攝入帶菌產品而感染[4]。布魯氏菌病不僅嚴重阻礙畜牧業穩定健康發展,同時嚴重威脅到人民群眾生命財產安全。大理州牛、羊、豬存欄量居全省前列,2022年末,大理州生豬存欄245.14萬頭(其中能繁母豬22.07萬頭),肉牛存欄79.87萬頭,奶牛存欄8.16萬頭,羊存欄157.13萬只,家禽存欄1885.25萬羽。隨著養殖業的不斷發展壯大,動物交易越來越頻繁,同時也增加了人畜共患病發生的概率。特別是自2010年以來,大理州人畜布魯氏菌病疫情開始反彈,并高位維持,防控形勢十分嚴峻。為了解和掌握大理州畜間布魯氏菌病的流行情況,本試驗采用布魯氏菌熒光偏振試驗(FPA)初篩和微量法補體結合試驗(mCFT)[5]確診的方法,對大理州大理市、賓川縣、洱源縣、劍川縣2022年留存的7655份動物血清(其中牛血清5467份、羊血清1962份、豬血清226份)進行布魯氏菌病抗體檢測,對檢測結果進行分析與統計,了解和掌握大理州動物布魯氏菌病流行情況,為全州動物布魯氏菌病的控制和凈化提供基礎數據和技術支撐。

1 材料方法

1.1 樣品采集

按照《2022 年大理州畜間布魯氏菌病監測凈化方案》的相關要求和抽樣數量,結合大理、賓川、洱源、劍川4個縣(市)養殖存欄等實際情況,2022年9—11月間在上述4縣(市)范圍內根據“按養殖規模分配+陽性群跟蹤監測”的采樣模式,選取牛存欄50頭以上,羊存欄100只以上的17個規?；B殖場;選取與流行病學相關聯的9個村(近5年來發生過人畜間布魯氏菌病病例),豬存欄5頭以上,牛存欄2頭以上,羊存欄10只以上的476戶養殖戶,采集血清樣品。共采集了7655份動物血清樣品(規模場5044份,散養戶2611份),其中牛血清5467份,采自大理、賓川、洱源、劍川4個縣(市)的13個規模養殖場和181戶養殖戶;羊血清1962份,采自大理、賓川、洱源、劍川4個縣(市)各鄉(鎮)不同日齡羊的4個規模場、238戶養殖戶;豬血清226份,采自大理、賓川、洱源3縣(市)的57戶養殖戶,具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息表

1.2 主要試劑和儀器

FPA試劑盒,批號202303;mCFT用補體、溶血素、抗原、多功能酶標與熒光偏振儀(TECAN SPARK CYTO)、洗板機(Ts-20)等均由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室(北方)提供。

1.3 FPA檢測

取反應板,將7655份待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清分別加入ELISA抗原包被板中,20μL/孔,其中陰性對照血清各加3孔、陽性對照血清加1孔,加樣過程要盡量避免產生氣泡。每孔加180μL樣品稀釋液,充分混勻。室溫下孵育反應板3～5min。讀取每孔的空白值。每孔立即加入10μL熒光標記抗原,充分混勻。室溫下孵育反應板3～5min。讀取每孔偏振值。FPA判定標準為△mP值≥20mP時,為布魯氏菌病抗體陽性(+);△mP值<20mP時,為布魯氏菌病抗體陰性(-)[6]。

1.4 mCFT檢測

對FPA初篩陽性的血清,采用mCFT進行確診。在測定溶血素、補體、抗原最佳使用濃度的基礎上,將待檢血清、陽性對照血清和陰性對照血清在96孔深孔稀釋板中用生理鹽水作1∶10稀釋,放入水浴鍋中58℃滅能30min。然后取96孔U型底微孔板按表2進行臨床樣品的檢測,用酶標儀讀取并記錄各孔的OD600 nm值并判定結果。陽性血清加抗原對照孔和溶血素對照孔,須完全抑制溶血;陰性血清不加抗原對照孔和其他對照孔完全溶血,試驗成立。被檢臨床血清不加抗原對照孔應完全溶血,表明反應結果符合要求,可判定被檢臨床血清加抗原檢測孔結果,制作并對比標準比色孔OD600 nm值判定結果[4]。100%溶血判定為陰性,50%～90%溶血判為可疑,0%～40%溶血判為陽性。

表2 臨床樣品的檢測 單位：μL

2 檢測結果

2.1 FPA檢測結果

采用FPA對7655份動物血清樣品進行檢測,結果顯示,3個縣(市)豬血清樣品FPA初篩結果均為陰性;牛血清樣品僅賓川縣檢測出1份陽性,其余3個縣(市)均為陰性;羊血清樣品陽性率最高,洱源縣陽性率10%(26/260),賓川縣陽性率4.54%(35/772),其余2縣(市)均為陰性。具體檢測結果見表3。

表3 FPA布魯氏菌病檢測結果記錄表

2.2 mCFT 檢測結果

對FPA初篩的62份陽性血清樣品(其中牛血清1份,羊血清61份),采用mCFT進行確診,結果見表4。其中55份羊血清樣品經mCFT確診為陽性,其余均為陰性。經mCFT確診后,4個縣(市)豬血清樣品、牛血清樣品個體陽性率均為0,羊血清樣品個體陽性率為2.8%(55/1 962)。

表4 mCFT檢測結果記錄表

3 討論

我國現行的動物布魯氏菌病診斷技術(GB/T 18646—2018)規定了多種動物布魯氏菌病血清學檢測方法,包括RBT、SAT、MRT、CFT、iELISA、cELISA等試驗方法[5,7],但目前大理州的動物布魯氏菌病檢測仍然在沿用20世紀六七十年代開發的傳統凝集類試驗方法,即RBT初篩、SAT確診,主要是由于RBT、SAT檢測試劑的成本相對新方法低。這兩種方法都有其優缺點,RBT具有操作簡便,節約檢測成本,檢測敏感性較高的優點[7-9],但RBT的檢測結果易受診斷抗原質量的影響,出現假陽性或假陰性[10];SAT受IgM類抗體影響大[11],特異性和敏感性較低,容易出現漏檢,且結果判定受人為主觀因素影響,凝集類試驗的敏感性和特異性相比FPA和ELISA等方法低,且不適合大規模樣品檢測。在WOAH手冊中目前已不推薦SAT作為布魯氏菌病血清學診斷方法,僅用于布魯氏菌病陽性血清的效價標定。FPA方法敏感性及特異性與ELISA相當,該方法最大的優點在于快速高通量,檢測92份樣品僅需15min,適合大量樣品的布魯氏菌病血清學篩查。mCFT相比常量法CFT操作更簡便,是國際公認的布魯氏菌病血清學確診的金標準。所以本試驗采用FPA進行血清樣品布魯氏菌抗體初篩,對于初篩陽性的樣品再采用mCFT確診,極大提高了檢測效率和準確性。

本試驗檢測結果表明,4縣(市)豬血清樣品與牛血清樣品的布魯氏菌病個體陽性率均為0,這主要與樣品來源、樣品量存在一定的關系。此次檢測樣品中的牛血清樣品主要來源于規?；膛ｐB殖企業,本次試驗的豬血清樣品均采自養殖戶,且樣品數量較少,檢測結果存在一定的局限性。因此,大理州豬群與牛群布魯氏菌病流行的真實情況還需要更多監測數據的驗證。檢測結果表明大理州4縣(市)的家畜布魯氏菌病主要以羊布魯氏菌病為主,陽性率達2.8%(以mCFT檢測結果確診),陽性樣品均采自養殖戶,這與我國動物布魯氏菌病主要以羊布魯氏菌病為主的流行情況基本一致。大理州由于畜禽養殖比較密集、規?；潭容^低、動物頻繁調運、生物安全防范能力不高等因素,導致畜間布魯氏菌病急劇傳播和上升,嚴重威脅著公共衛生安全。因此做好動物布魯氏菌病防控,特別是羊布魯氏菌病的準確診斷是減少人間布魯氏菌病發病數的有效手段。

布魯氏菌病陽性動物是重要傳染源,不論是在家畜引種過程中,還是畜群布魯氏菌病凈化過程中,陽性動物的漏檢將對同場群的易感動物造成巨大的感染風險,如何快速、準確的檢測是控制和凈化布魯氏菌病的重要環節之一。大理州現階段采取的動物布魯氏菌病防控政策是“檢驗—淘汰”策略,在布魯氏菌病防控實踐中,因檢測方法的問題常常會導致誤診和漏診的現象存在,從而引起誤殺或傳染源不能及時剔除出群,嚴重阻礙了布魯氏菌病的有效防控和凈化。因此,要盡快建成完善的州、縣、鄉動物疫病監測體系,加快高效準確診斷試劑的推廣應用,更新動物布魯氏菌病檢測技術。應盡快在全州逐步推廣應用高通量、高敏感特異的診斷方法,如推廣布魯氏菌病競爭ELISA試劑盒或布魯氏菌病熒光偏振抗體檢測試劑盒進行布魯氏菌病陽性動物篩查,再采用牛/羊布魯氏菌病間接ELISA試劑盒進行確診[12]。

建議大理州加大監測力度和范圍,及時對調入牛羊、引起人感染布魯氏菌病和高流產率畜群等開展排查、隔離、采樣、檢測和報告工作。定期開展診斷技術培訓和宣傳活動,不斷提高縣(市)級動物疫控中心技術人員和村防疫員的理論水平和實踐操作能力,在今后的臨床診斷與疫病凈化過程中,要在結合當地布魯氏菌病流行情況,聯用幾種不同的檢測方法,盡可能減少陽性動物的漏診,從而做到及時、準確的確診。同時加強對養殖場(戶)等重點人群的宣傳和專業知識培訓。讓廣大群眾充分認識布魯氏菌病對人畜的危害,提高對布魯氏菌病的自我防護意識。