小熊貓槽盤吸蟲的形態學鑒定及分子進化研究

張愛輝,胡春波,魏偉,毛瑞峰,賈斌,王春仁,高俊峰*

(1. 黑龍江八一農墾大學動物科技學院,黑龍江 大慶 161319;2.齊齊哈爾市龍沙動植物園有限公司,黑龍江 齊齊哈爾 161002; 3.黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

槽盤吸蟲病,是由背孔科(Notocotylidae)槽盤屬(Ogmocotyle)吸蟲寄生于動物小腸中所引起的一種吸蟲病。槽盤吸蟲感染的宿主范圍較廣,包括山羊、綿羊、黃牛等家畜,甚至一些野生的哺乳動物[1,2]。動物感染后會出現貧血、消瘦、腹瀉、出血性腸炎等癥狀,嚴重感染可引起死亡[3]。槽盤吸蟲病不僅給畜牧業帶來嚴重的經濟壓力,而且對野生動物的生命健康存在著巨大的威脅。

有關研究顯示,已經報道的槽盤吸蟲種類有鹿槽盤吸蟲(Ogmocotylesikae)、羚羊槽盤吸蟲(Ogmocotylepygargi)、唐氏槽盤吸蟲(Ogmocotyletangi)和小熊貓槽盤吸蟲(Ogmocotyleailuri)[4-7]。不同種類的槽盤吸蟲寄生的宿主也有所差異,如鹿槽盤吸蟲主要寄生于麝[8]、綿羊和山羊體內,羚羊槽盤吸蟲主要寄生于綿羊和山羊體內[4],唐氏槽盤吸蟲寄生于小鹿體內[6],而小熊貓槽盤吸蟲主要寄生于小熊貓體內[9]。傳統的形態學鑒定主要依據槽盤吸蟲睪丸的形態與雄莖囊的位置作為槽盤吸蟲種類判定的依據。但目前有關小熊貓槽盤吸蟲的報道極少,僅在北京動物園有小熊貓感染槽盤吸蟲的報道[9]。

近年來,分子生物學方法已成為物種鑒定中常用的有效方法[10]。核糖體DNA(rDNA)的內轉錄間隔區(Internal transcribed spacer region,ITS)被報道可作為良好的遺傳標記基因,已經廣泛地用于寄生蟲領域的蟲體鑒定及遺傳進化分析[11]。因此,本研究擬對齊齊哈爾某動物園小熊貓腸道內分離的吸蟲通過形態學結合分子生物學方法進行鑒定,并基于rDNA ITS-2序列進行遺傳進化分析,探討該吸蟲在復殖吸蟲中的分類地位。本研究為小熊貓槽盤吸蟲病的流行病學調查和分子鑒別診斷提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 蟲體

蟲體采自黑龍江省齊齊哈爾某動物園一例小熊貓死亡病例,剖檢時于腸道內發現大量小型吸蟲,將蟲體收集后用生理鹽水反復沖洗,放在70%的酒精中固定,于-20℃保存備用。

1.2 主要試劑

德式蘇木素染液采購于Biosharp 公司;dNTPs、Loading Buffer、瓊脂糖均采購于寶日醫生物技術(北京)有限公司;DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、加拿大樹膠、水楊酸甲酯。

1.3 蟲體裝片制備及形態學鑒定

將酒精中固定的蟲體取出,采用蘇木素染色的方法[12]經染色,梯度酒精褪色,水楊酸甲酯透明,加拿大樹膠封固后制成裝片。將做好的裝片放于顯微鏡下,先通過低倍鏡觀察蟲體整體輪廓,再通過高倍鏡觀察蟲體的各個器官,特別注意蟲體的睪丸形態及雄莖囊的位置,參考先前文獻報道[4]進行形態學鑒定。

1.4 DNA的提取及ITS序列分析

在70%酒精中取出蟲體,經蒸餾水沖洗幾遍放置于無菌離心管中,利用DNA提取試劑盒提取此吸蟲總DNA,將提取的DNA存放于-20℃保存備用。

以所提取的DNA為模板,上游引物CPF：5′-CCCTGGAAACGGATTGT-3′,下游引物CPR：5′-ATGCTTGGGTCATAGAAA-3′,PCR擴增目的序列。反應體系為25μL;反應條件：94℃ 2min,94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 80s,共35個循環,72℃延伸7min。得到的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,將得到的目的條帶使用膠回收試劑盒進行純化回收,送往測序公司進行雙向測序。將序列利用生物學軟件DNAStar 5.0,將兩段序列進行拼接,與NCBI中相關吸蟲序列進行比對分析,利用MEGA 11軟件將所得序列進行分段。

1.5 系統發生樹的構建

以有尾感器亞綱的牛仰口線蟲(Bunostomumphlebotomum)為外群,將本研究所獲得的槽盤吸蟲與復殖吸蟲部分代表性吸蟲ITS-2序列進行比對分析(表1)。使用MEGA 11軟件系統發育選項中的最大似然估計法(ML),substitution model、rates and patterns等選用默認值,其中Bootstrap Replications改為500,來構建系統發生樹,探討小熊貓槽盤吸蟲在復殖吸蟲中的分類地位。

表1 本研究進化樹中復殖吸蟲ITS-2的序列信息

2 結果

2.1 吸蟲的形態學鑒定

經德式蘇木素染液染色后的蟲體裝片放在顯微鏡下進行觀察,觀察結果顯示本研究分離的蟲體形態與文獻中小熊貓槽盤吸蟲的描述一致。蟲體小,呈卵圓形或葵花籽形,兩端鈍圓,口吸盤小,位于蟲體前端腹側面。無咽,食道短,兩腸支沿著身體兩側向后延伸至睪丸內側。雄莖囊粗壯,呈半圓形橫臥在蟲體中央。沒有腹吸盤。子宮發達,在蟲體的中后部,呈“S”狀彎曲。睪丸位于蟲體后側,對稱分布,睪丸具有大量分葉,似香腸狀、不規則的卵圓形。梅氏腺位于兩睪丸之間。卵巢位于蟲體末端中央,分葉排布,每葉呈橢圓形(圖1)。因此,根據其形態要點將本研究分離的吸蟲鑒定為小熊貓槽盤吸蟲。

A：口吸盤;B：食道;C：雄莖囊;D：子宮;E：睪丸;F：梅氏腺;G： 卵巢。

2.2 rDNA ITS序列的擴增及分析

通過PCR擴增出小熊貓槽盤吸蟲的ITS序列,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳在950bp左右出現單一條帶,與預期條帶大小一致(圖2)?；蚱谓浶Ｕ筮M行拼接,基因全長為936bp,根據NCBI中相似序列進行比對分析得出ITS-1、5.8S和ITS-2序列大小分別為518bp、126bp和292bp。將獲得的ITS-2序列與NCBI中Ogmocotylesikae(KF008246)的ITS-2序列進行對比分析,二者同源性為94.9%(圖3),根據兩段序列對比有15個堿基發生了突變,即C49-T、T56-A、C84-T、G145-A、A158-G、A195-T、A217-G、C223-T、C230-T、C246-T、C247-T、A248-G、A262-G、A267-T、C277-T。

M：DL-2000標準分子量;1：陰性對照;2-4：槽盤吸蟲樣本。

圖3 蟲體ITS-2基因相似性與分歧度分析

2.3 遺傳進化分析

本研究以牛仰口線蟲作為外群,基于ITS-2序列采用最大似然法構建復殖吸蟲系統發育進化樹。在系統發生樹中,本研究分離的槽盤吸蟲與槽盤屬的另兩種吸蟲O.capricorni和鹿槽盤吸蟲親緣關系最近,處于同一分支。其他背孔屬吸蟲與槽盤屬吸蟲均在背孔科分支中。背孔科、前后盤科、裂體科、后睪科、片型科形成單獨分支(圖4)。該結果與傳統的形態學鑒定結果一致,表明ITS-2標記的基因可以用來鑒定背孔科吸蟲的種間遺傳關系。

圖4 ML方法構建復殖目吸蟲系統進化樹

3 討論

為了清楚地觀察到小熊貓槽盤吸蟲的內部器官結構,本研究通過德氏蘇木素染色方法對槽盤吸蟲進行染色。與槽盤屬已報道的鹿槽盤吸蟲、唐氏槽盤吸蟲和羚羊槽盤吸蟲的形態學要點進行比較,發現其睪丸的形態與雄莖囊的位置在各吸蟲間均有所差異,其中羚羊槽盤吸蟲的睪丸呈長柱形且睪丸邊緣有多數分瓣,雄莖囊縱臥于蟲體前端。唐氏槽盤吸蟲的睪丸呈長塊狀,邊緣有深淺不等的缺刻,雄莖囊位于蟲體前半部的右側。鹿槽盤吸蟲的睪丸呈長橢圓形,邊緣有4～5個缺刻[13],雄莖囊也是縱臥于蟲體前端。而小熊貓槽盤吸蟲的睪丸大量分瓣且呈香腸狀,雄莖囊發達且橫臥于蟲體前半部。通過染色結果發現從小熊貓體內分離到的蟲體睪丸形態與雄莖囊位置與文獻描述一致,根據形態學確定此吸蟲為小熊貓槽盤吸蟲。

雖然在形態上可以簡單快速地對槽盤吸蟲進行種屬的鑒定。但是,蟲體間的形態差異以及鑒定人員的水平和經驗等因素影響著對蟲體鑒定的準確性。所以就要借助分子生物學手段對所研究的槽盤吸蟲進行進一步鑒定。ITS被廣泛地應用于寄生蟲蟲種鑒定以及遺傳進化分析中[14]。為了對槽盤吸蟲進行種類鑒定及進化分析,本研究擴增其ITS基因序列并測序比對分析,發現此蟲體與O.capricori和鹿槽盤吸蟲的基因相似度分別為94.8%和94.9%,且在進化樹中處于同一分支,由此可以表明此種吸蟲屬于槽盤屬吸蟲。另外,在槽盤屬吸蟲分支中,O.capricorni與鹿槽盤吸蟲聚在一起,較本研究分離的小熊貓槽盤吸蟲親緣關系要近。NCBI數據庫中O.capricorni與鹿槽盤吸蟲序列信息顯示兩種吸蟲的宿主分別為髭羚和山羊,宿主動物均屬于偶蹄目?？?但本研究的槽盤吸蟲宿主動物為小熊貓,屬于食肉目小熊貓科,這可能是出現上述進化分析結果的重要原因。

本研究通過形態學結合分子生物學方法對黑龍江省某動物園小熊貓體內分離的吸蟲進行鑒定,最終確定所分離的吸蟲為小熊貓槽盤吸蟲。該結果填補了槽盤吸蟲的分子數據,為我國小熊貓槽盤吸蟲的流行病學調查及分子鑒別診斷提供科學的參考依據。