傳統腌漬蔬菜中高產AI-2 信號分子乳酸菌的篩選及其益生特性

呂欣然，劉雪晴，顧振辰，呂孟敏，勵建榮*，檀茜倩，崔方超，白鳳翎，俞張富，沈榮虎

（1 渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧錦州121013 2 杭州蕭山農業發展有限公司 杭州 311215）

群體感應（Quorum sensing，QS）是指細菌通過監測種群群體密度，進而調節其基因表達的行為，是細菌群體之間通訊和交流的一種機制[1]。目前，依據信號分子類型分為4 類群體感應系統：1）擴散信號因子（Diffusible signaling factor，DSF）群體感應，存在于革蘭氏陰性菌中，具有調節細菌毒力因子與生物膜形成等功能[2]；2）寡肽（Auto-inducing peptides，AIP）類群體感應，廣泛存在于革蘭氏陽性細菌中[3]；3）?；呓z氨酸內酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）類群體感應，介導細菌種間交流；4）呋喃硼酸二酯（Autoinducer-2，AI-2）類群體感應，AI-2/LuxS 群體感應系統及其合成酶蛋白LuxS，可介導革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間的種間和種內信息交流[4]。AI-2 是細菌中同型半胱氨酸代謝的副產物[5]，其QS 系統主要參與調控生物膜形成、生物發光、細胞運動和毒力因子的表達等[6]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是傳統發酵食品中一種重要的乳酸菌，廣泛應用在食品加工領域。其具有較好的抑菌性和胃腸道耐受能力，大多數植物乳桿菌菌株是公認的益生菌[7]。為有效適應生存環境變化，乳酸菌種群間會通過分泌群體感應信號增加個體間的信息交流，通過產生生物膜、細菌素等適應環境的變化[8]。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）通過AI-2/LuxS 群體感應系統調節其在腸道表面的黏附和定殖能力[9-10]。Moslehi-Jenabian 等[11]研究發現，AI-2/LuxS 群 體感應系統改善了4 種乳酸桿菌的酸適應性，增強其在胃腸道微生態系統中存活能力。AI-2/LuxS 群體感應系統可調控乳酸菌的酸耐受性和腸道定植能力，然而其調控乳酸菌的其它益生特性的能力尚不清楚。需進一步研究AI-2/LuxS 群體感應系統與乳酸菌益生特性的關系。

鑒于上述問題，本研究利用哈維氏弧菌BB170 菌株報告法，從傳統腌漬蔬菜中篩選產AI-2 信號分子乳酸菌，并通過酸耐受性、膽汁耐受性、黏附性、抑菌特性和生物膜形成能力等指標，評價AI-2/LuxS 群體感應系統對乳酸菌益生特性的影響，以期為開發具有益生潛力的乳酸菌發酵劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 乳酸菌菌株來源于安徽安慶農家自制蘿卜和雪菜，遼寧葫蘆島農家自制酸菜，遼寧阜新、彰武農家自制酸黃瓜和酸菜，遼寧沈陽農家自制酸菜，遼寧錦州農家自制酸菜；鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170，北納創聯生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、Hela 細胞，本實驗室保藏。

1.1.2 培養基及試劑 MRS 液體培養基、LB 液體培養基、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；AB 培養基，山東拓普生物工程有限公司；細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、Taq PCR Master mix、DNA marker，生工生物工程（上海）股份有限公司；高糖DMEM 培養基、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素-鏈霉素雙抗，Gibco（美國）公司。

1.2 主要設備與儀器

DL-CJ-2N 超凈工作臺，北京市東聯哈爾儀器制造有限公司；Bioscreen C 全自動生長曲線分析儀，上海謂載商貿發展有限公司：CO2培養箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GI54DS 高壓滅菌鍋，至微儀器有限公司；IKAVortexGENIUS3 振蕩器，德國IKA 公司；MoticAE2000 倒置顯微鏡，北京榮興光恒科技有限公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；QuantityOne 凝膠成像系統、Imark 酶標儀，美國Bio-Rad 公司；ABIsteponeplus-PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 高產AI-2 乳酸菌的篩選 將活化后的乳酸菌以2%接種于MRS 培養基，置37 ℃培養16 h，8 000 r/min 離心10 min，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，得到乳酸菌無細胞上清液。

按照燕彩玲等[12]、曹素芳等[13]、張騰等[14]的方法，采用哈維氏弧菌生物發光法測定乳酸菌產AI-2 活性。信號分子AI-2 的濃度用相對熒光強度表示。Ac為待測相對熒光強度；Ai為待測樣品的熒光強度值；Aj為介質對照的熒光強度值。計算公式如下：

1.3.2 luxS 基因生物學鑒定 取1 mL 過夜培養的乳酸菌菌懸液，參照DNA 快速抽提試劑盒說明書提取乳酸菌DNA。參照張騰[15]的方法設計luxS引物與PCR 反應體系和擴增條件。PCR 產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，凝膠成像系統觀察擴增結果，送至上海生物工程有限公司測序。

1.3.3 生長曲線的測定 向96 孔板中加入200 μL MRS 液體培養基，將乳酸菌以2%接種于培養基中，使用全自動生長曲線儀于37 ℃每2 h 測定其OD600nm值。

1.3.4 耐酸能力的測定 將活化后的二代乳酸菌以2%的接種量接種于pH 值分別為1.5，2.5，3.5，4.5 的MRS 培養基中，37 ℃培養24 h 后移入96孔板中，測定其ODAi，以未作處理培養的乳酸菌ODAj作對照[16]。存活率計算公式：

1.3.5 耐膽鹽能力的測定 將活化后的二代乳酸菌以2%的接種量接種于體積分數分別為1%，2%，3%，4%的含膽鹽的MRS 培養基中[17]，測定方式同1.3.4 節。

1.3.6 抑菌能力的測定 利用雙層瓊脂擴散法測定篩選出的乳酸菌的抑菌能力[18]。以大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌為指示病原菌。在平板中加入10 mL 素瓊脂作為底層培養基，待其凝固后，將牛津杯放在其表面，然后將含有106CFU/mL 指示菌的LB 半固體培養基倒入平板內作為上層培養基，待其凝固后，將牛津杯取出，分別在孔內加入180 μL 乳酸菌液，37 ℃培養12 h，測量抑菌圈直徑。

1.3.7 生物膜形成能力的測定 向96 孔板中加入200 μL MRS 液體培養基，將乳酸菌以2%接種于培養基中，置于37 ℃分別培養24，36 h 和48 h。棄上層培養液后，用PBS 清洗2～3 次去除浮游細胞，晾干后，加100 μL 結晶紫染色15 min，去除染液后用PBS 緩慢沖洗至無色。晾干后加入200 μL 33%冰醋酸脫色，搖勻。用多功能酶標儀在OD595nm處測定其吸光度值[19]。

1.3.8 Hela 細胞黏附能力的測定 乳酸菌菌懸液的制備[20]：將活化后的2 株產AI-2 的乳酸菌和鼠李糖乳桿菌LGG（作為陽性對照）接種于MRS 液體培養基培養過夜，調整細菌濃度，使其在波長600 nm 處的吸光度為1 4000 r/min 離心10 min，收集菌體，用無菌PBS 洗滌3 次。最后用不含血清的DMEM 高糖培養基重懸。

黏附性測定[21-22]：在六孔板中預先放入20 mm×20 mm 的載玻片，將培養好的Hela 細胞調整至2×104cell/mL，接種到六孔板中使其貼壁生長，至細胞長成單層后用無菌PBS 洗滌2 次，每孔加入1 mL DMEM 和1mL 預先制備好的乳酸菌菌懸液繼續培養1 h。六孔板用PBS 洗3 次，除去未黏附的乳酸菌，加入甲醛固定20 min，對載玻片進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下隨機取20 個視野，觀察并計算乳酸菌黏附數。

1.3.9 數據處理 試驗均重復測定3 次，數據采用“平均數±標準差”表示。利用SPSS 23 軟件對數據進行統計學分析，Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 高產AI-2 信號分子乳酸菌的篩選結果

用哈維氏弧菌BB170 生物發光法從200 多株乳酸菌中篩選到10 株可產生AI-2 信號分子的乳酸菌。圖1a 為乳酸菌菌株AI-2 的產生情況。在0 h，AI-2 是種間交流信號分子，剛加入的乳酸菌上清液中的信號分子未被指示菌識別，所檢測到的熒光強度是哈維氏弧菌所產生。0～4 h 內，各組熒光強度逐漸下降，表明各組產生的信號分子未達到使指示菌發光的濃度，熒光強度在4 h 最低，之后逐漸升高，說明4 h 是報告菌株誘導發光的閾值時間，因此，以4 h 測定的熒光強度來計算最為準確。本結果與蔡針華[23]的研究結果相近，各組發光強度均在4 h 達到最低點，相對熒光強度計算時間以孵育4 h 為基準點。圖1b 為10 株乳酸菌的相對熒光強度。源自于酸菜的植物乳桿菌SCT-2 信號分子AI-2 產量遠高于其它乳酸菌，植物乳桿菌DL10 產量最低，且SCT-2 產量為DL10的8.7 倍。選擇以上兩株植物乳桿菌做后續試驗并比較。

2.2 luxS 基因生物學鑒定結果

圖2a 為兩株產AI-2 乳酸菌luxS 基因擴增后的電泳結果。目標條帶約為477 bp，與NCBI 中植物乳桿菌luxS 基因大小相同，說明兩株乳酸菌都含有luxS 基因。將其序列在NCBI 上進行BLAST 比對，選取部分同源性較高的不同菌株，用Neighbor-joining 法構建系統發育樹，結果見圖2b。高產AI-2 信號分子的SCT-2 與植物乳桿菌NMD-17 的luxS 基因有100%的同源性。低產信號分子的DL10 與植物乳桿菌KLDS1.0391 在同一分支且同源率達99%。

圖2 luxS 基因擴增后電泳結果及系統發育樹Fig.2 Electrophoresis results after luxS gene amplification and phylogenetic tree

2.3 乳酸菌的生長曲線

圖3 顯示AI-2 產量不同的兩株乳酸菌24 h生長曲線。2 株乳酸菌的生長周期相似。2 h 時開始進入對數生長期，10 h 時達到對數生長末期，而后進入穩定期，菌密度在對數末期達到最大值，菌株SCT-2 在18 h 進入生長衰退期，而DL10 菌體密度相對穩定。排除生長特性的干擾即可做后續試驗。

圖3 2 株乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of two strains lactic acid bacteria

2.4 耐酸、耐膽鹽能力

益生菌對酸和膽鹽的抗性是選擇新益生菌候選物的基本特性，這種特性與菌株在胃腸道中的存活密切相關[24]。通常，只有很少細菌可以在pH 2.0 下存活，一部分在pH 3.0 下存活，在pH 4.0幾乎所有菌株僅可維持其初始種群的80%[25]。圖4a 顯示兩株乳酸菌在不同pH 下的存活率。兩株乳酸菌在pH 1.5 和2.5 時，存活率僅為12.7%和13.6%。當pH 4.5 時，均表現出80%以上的存活率，其中高產AI-2 菌株SCT-2 存活率高出低產AI-2 菌株DL10 的8%左右。Rogers 等[26]研究了酸脅迫條件下，嗜酸乳桿菌NCFM 與鼠李糖桿菌GG的AI-2 活性變化規律，發現隨著pH 的降低，AI-2 活性顯著增加，說明酸脅迫下，乳酸菌會產生更多AI-2 來應對。這與本試驗結果大致相似，說明luxS 基因產生的AI-2 信號分子在抗酸脅迫中發揮了關鍵作用。

圖4 兩株乳酸菌體外對酸和膽鹽的耐受性分析Fig.4 Tolerance analysis of acid and bile salt tolerance of two strains lactic acid bacteria in vitro

膽汁鹽是阻礙細菌存活的另一個屏障，也是胃腸道細菌細胞應激的主要因素[27]。雖然體外條件與體內情況不同，但是體外耐受能力測定可以反映菌株對膽鹽的抗逆性。圖4b 顯示兩株乳酸菌在不同膽鹽含量下的存活率。兩株產AI-2 的乳酸菌隨膽鹽濃度的升高，存活率顯著下降。在膽鹽含量為0.1%時，兩株乳酸菌均表現出良好的存活率。當膽鹽含量為0.3%和0.4%時，高產AI-2 的SCT-2 存活率為65.2%，高出DL10 存活率20%?？傮w看來，SCT-2 對膽鹽的抗性顯著高于DL10，說明產AI-2 能力好的菌株，其耐膽鹽能力也更好。這與Jiang 等[28]的研究結果相似，植物乳桿菌YM-4-3 在生長對數期時，可耐受0.4%膽汁，而穩定生長期只能耐受0.2%膽汁，且luxS 基因的表達也隨植物乳桿菌YM-4-3 的生長而減少，表明AI-2/LuxS 群體感應系統參與調控乳酸菌對膽鹽的耐受性。

2.5 抑菌能力

表1 列出兩株乳酸菌對單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌抑菌的能力，結果表明，產AI-2 的乳酸菌對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有不同程度的抑制能力（P＜0.05）。低產AI-2 的菌株DL10 對單增李斯特菌和嗜水氣單胞菌的抑菌直徑為（15.93±0.26）mm 和（15.80±0.13）mm，在4 種指示菌中抑制率明顯低于高產AI-2 的SCT-2。SCT-2 對單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的抑菌直徑為17.50～19.43 mm，表明高產AI-2 信號分子的植物乳桿菌SCT-2 具有較強的抑菌作用。

表1 2 株乳酸菌的抑菌能力Table 1 Bacteriostatic ability of two strains of lactic acid bacteria

2.6 生物膜形成能力

生物膜是一種復雜的微生物基質。細胞和胞外多糖、蛋白質等其它有機成分附著在生物或非生物表面可形成生物膜[29]。細菌形成的成熟生物膜可以抵抗紫外線、pH 值、滲透壓等外界不利因素，并降低對常規抗菌藥物的敏感性。圖5a 顯示兩株乳酸菌在不同時間生物膜的形成能力。隨著時間的延長，生物膜產量逐漸增多，且高產AI-2的菌株SCT-2 在3 個時期生物膜的形成顯著高于低產AI-2 的菌株DL10（P＜0.05），生物膜產量平均提高111.4%。高產AI-2 的SCT-2 生物被膜形成能力更強，而低產AI-2 的DL10 的生物被膜形成能力較弱。E 等[30]研究顯示，植物乳桿菌LIP-1的AI-2 信號分子上調可促進生物膜的形成。與本研究結果相似，說明AI-2/LuxS 群體感應系統正向調控乳酸菌生物膜的形成。

圖5 兩株乳酸菌在不同時間的生物膜形成能力和細胞黏附能力Fig.5 Biofilm forming ability and cells adhesion ability of two strains lactic acid bacteria at different times

2.7 Hela 細胞黏附能力測定

乳酸菌的黏附能力是發揮益生作用的首要條件[31]。蘇帥等[32]以人結腸癌HT-29 細胞為黏附模型，以黏附能力較強的鼠李糖乳桿菌LGG 為陽性對照菌株，對乳酸菌的體外黏附能力進行評估，結果表明鼠李糖乳桿菌和長雙歧桿菌單獨或聯合使用在HT-29 細胞上都表現出良好的黏附性。圖5b為3 株乳酸菌對Hela 細胞黏附的結果，在光鏡下觀察Hela 細胞無明顯變化，且所篩選的產AI-2乳酸菌不同程度地黏附在Hela 細胞周圍。其中高產AI-2 乳酸菌SCT-2 黏附數量最多，達到102 CFU/細胞，與陽性對照相比，黏附率提高17.4%，且達到DL10 黏附數量的3 倍，黏附能力最強。低產AI-2 乳酸菌DL10 黏附數量最少，黏附能力最差。Jia 等[33]研究表明luxS 缺失的乳酸桿菌對Caco-2 細胞的黏附能力降低，且luxS 與乳酸桿菌對胃腸環境的高耐受性相關。這與本結果相似。推測AI-2 產生量與乳酸菌黏附能力呈正相關。

3 結論

乳酸菌具有抑菌、抗癌、改善腸道菌群等益生功能，是食品工業中的重要菌種。作為細菌種間交流的特殊信號分子AI-2，具有調控細菌生物膜形成、相關基因的表達等生理功能。本研究篩選獲得1 株高產AI-2 的植物乳桿菌SCT-2 和低產AI-2的植物乳桿菌DL10。通過驗證確定兩株植物乳桿菌中均存在調控AI-2 合成的luxS 基因。與低產AI-2 乳酸菌比較，高產AI-2 植物乳桿菌SCT-2的生物膜產量、耐酸性、耐膽鹽、抑菌率與細胞黏附性等特性均有提高。綜上所述，AI-2/LuxS 群體感應系統具有調控乳酸菌的生物膜形成能力、耐膽鹽性、抑菌能力及細胞黏附性等益生特性。