41Ca的AMS測量方法及在生物醫學領域的應用

畢艷婷,付云翀

(1.西安地球環境創新研究院,西安 710061;2.中國科學院地球環境研究所 黃土與第四紀地質國家重點實驗室,西安 710061;3.西安加速器質譜中心 陜西省加速器質譜技術及應用重點實驗室,西安 710061)

鈣(Ca)是動植物生長的必須營養元素[1]。動物體內99%的鈣存在于骨骼和牙齒中,少部分存在于細胞外液和血液中。骨骼作為鈣儲存庫,通過不斷的骨吸收與骨形成維持體內鈣平衡,當平衡改變(骨重塑異常),就會導致代謝性骨病,例如骨質疏松。Ca2+可以維持動物的新陳代謝和細胞的正常生理功能,并作為“生物學信使”參與細胞信號傳導,胞漿內游離Ca2+濃度的變化可以反映多種疾病的發生,例如癌癥和腎臟疾病等[2-8]。此外,Ca在植物細胞功能中發揮多重作用[9],對植物的生長發育和長期儲存等方面至關重要。Ca2+在土壤中以游離金屬或水合物形式穩定存在,植物根系從土壤溶液中吸收Ca,樹葉、針葉凋落物和樹皮分解再次將Ca釋放到自然界形成循環過程[10-16]。但植物從土壤或營養液中攝取鈣以及鈣在植物內部的精確運轉機制目前尚不清楚。充分了解并闡明Ca2+在植物體內的傳輸過程、分布規律和吸收情況可為植物的科學補鈣提供幫助。因此,利用鈣同位素對個體(植物和動物)進行精細化鈣循環示蹤對生物醫學領域具有重要意義。

Ca的眾多同位素中有6種穩定同位素(40,42,43,44,46,48Ca),它們在生物體內含量較高且自然界來源復雜,因此不適合對個體精確地定量化示蹤。還有3種半衰期1 d以上的放射性核素,即41Ca(T1/2=(9.94±0.15)×104a)[17]、45Ca(T1/2=162.6 d)和47Ca(T1/2=4.5 d)。其中45Ca和47Ca衰變時會發射出電子和γ射線,二者半衰期相對較短,易對生物體造成輻射損傷(特別是應用前景最為重要的人體鈣代謝研究)[18];由于二者監測周期相對較短,而骨代謝比較緩慢(時間尺度為月和年),即使忽略輻射劑量的影響,他們仍然不是研究生命系統鈣代謝的最佳選擇。

41Ca半衰期較長,衰變方式為軌道電子俘獲并發射出3.3 keV的X射線,放射性極低,對生物體的損傷很小,適合長期生物示蹤工作,120 ng41Ca對受試者的輻射劑量約為每年0.06 μSv,比自然輻射的總劑量低3萬倍[20]。且天然樣品中41Ca/40Ca比值非常低(10-14～10-15),實驗時不用考慮自然界的影響,使得測量靈敏度得以提升。因此41Ca是一種理想的生物示蹤劑,廣泛應用于生命科學[21-35]和生物醫學領域[36-46]。一般加入41Ca作為示蹤劑使41Ca在樣品中濃度有所提升,但由于其半衰期長、發射的X射線能量低和同量異位素41K干擾等諸多原因,傳統的測量方法如衰變計數法、中子活化分析法和一般質譜法都難以高效準確地測定41Ca。與共振電離質譜(RIMS)[47-49]、液體閃爍譜儀(LSC)[50-52]和X射線(X-ray)光譜法[53]等相比,加速器質譜儀(AMS)通過測量41Ca/40Ca豐度比,從而量化分析41Ca并可有效排除干擾提升測量靈敏度[54]。X-ray光譜法雖然操作方便,樣品制備過程簡單,但計數率(<0.08%)和靈敏度較低[53];LSC方法相比于X-ray光譜法靈敏度略有提高(1%～13%)[50],但樣品制備和計數時間較長;RIMS方法與LSC和X-ray光譜法相比是較為靈敏的41Ca測量方法,但綜合對比檢測限和測量時間,AMS為最佳選擇[55]。

由此,本研究對41Ca的AMS測量技術發展和其在生物醫學領域的應用進行闡述。主要介紹41Ca-AMS分析技術中涉及的研究樣品形式的選擇和不同能量下AMS的儀器技術發展,總結了主要的基于添加41Ca為示蹤劑的生物醫學領域的應用研究情況,如動物長期骨鈣代謝、疾病防治與機理研究以及植物示蹤等方面。

1 41Ca的AMS測量方法

1.1 不同樣品形式的比較

1979年,Raisbeck和Yiou教授[19]驗證了利用AMS測定41Ca的可行性,提出將41Ca加速至足夠大能量(≥300 MeV)將41Ca和41K分離從而抑制同量異位素41K的干擾?；谶@種方法,他們以310 MeV的能量在Orsay的ALICE回旋加速器上首次實現了AMS對隕石樣品中41Ca的測量,樣品形式為CaO,測量的41Ca/40Ca豐度靈敏度為1×10-11[56]。

CaH2樣品的制備需要將41Ca從樣品中以CaC2O2形式沉淀,在1 000 ℃下轉化成CaO,CaO與Zr粉混合,在1 500 ℃下還原成金屬Ca,金屬Ca與H2進一步生成CaH2,回收率在80%～90%之間。但是制備過程復雜,危險性高,且CaH2在空氣中吸濕性強,必須在惰性氣體(如氬氣)的保護下處理和儲存,測試大批量樣品不夠便捷。

表1 AMS 的與方法本底對比Table 1 Comparison of background level using

1.2 41Ca-AMS測量技術

截止本世紀初,41Ca的測量主要在大型(≥5 MV)AMS上進行[18,74]。因為在較高的能量下,AMS對同量異位素41K有足夠的辨別能力,可以很好地將41Ca與41K分離,靈敏度滿足自然含量樣品41Ca/40Ca的測量要求。但隨著小型(≤3 MV)AMS已快速發展成為應用最廣的加速器質譜儀類型(約占AMS總量的75%)[82],以及分析靈敏度在10-11以上即可開展生物醫學領域的41Ca示蹤研究相關工作,致使能否在小型AMS上進行41Ca分析備受矚目。

對于小型(≤3 MV)AMS,較低的能量下無法完全分離41Ca和同量異位素41K,那么對其有效抑制顯得格外重要。如前所述,在離子源引出階段CaF2對41K的抑制能力不夠高。因此,各實驗室也嘗試在測量階段建立更為有效的分離41Ca和同量異位素41K的方法。2000年,Gif-sur-Yvette AMS在重離子線上建立了一個入射離子X射線探測系統(PXD),并嘗試在2.25 MV的端電壓下使用CaO樣品測量41Ca[77, 83]。PXD系統通過探測被分析的離子束與目標箔相互作用產生的特征X射線來分辨同量異位素。對于低能加速器來說,X射線的分離程度幾乎不受束流能量影響,但其產率對能量依賴性較強,所以這種方法測量靈敏度不高,41Ca/40Ca約為10-9。隨后,使用CaH2和CaF2,在2.25 MV端電壓下,通過氣體電離探測器對41Ca進行分析,得到的本底值分別為10-13和10-11。

VERA嘗試通過ΔTOF方法在3 MV串聯加速器上利用CaF2樣品對41Ca進行測量,本底值可以達到10-13[84]。ΔTOF方法的基本原理是根據41Ca和41K通過均勻的SiN箔后的能量損失差異導致飛行速度不同,從而在時間能譜上區分41K和41Ca[54,84-86]。但由于ΔTOF方法的探測效率較低,沒有用于批量測量,他們還嘗試使用一種緊湊型氣體電離室測量41Ca,本底水平約為10-13[87]。

對于緊湊型AMS(<1 MV)來說,目前仍然無法在低能量情況下將41Ca和41K分離,但是可以通過39K校正的方法來實現對41Ca的測量。首次在緊湊型AMS上分析41Ca的是ETH,在0.5 MV的端電壓下分析41Ca,校正后的背景值接近5×10-12,表明緊湊型AMS可以用于生物醫學樣本中41Ca的測量[74,92-93]。TNO和CNA在1 MV的端電壓下獲得了和ETH相當的本底水平,且TNO的測量效率較ETH有所提升[80-81]。近期MRC-EMSI實驗室和Aarhus大學也測試了其1 MV AMS對41Ca的分析能力,背景值分別為1.41×10-11[78]和9×10-12[79]。

Xia等[94]報道了基于激光捕獲和冷卻的原子阱捕獲分析技術(ATTA),可以測量41Ca原子的數量。單個原子在塞曼減速器中選擇性冷卻,通過諧振激光束捕獲在磁光阱(MOT)中,并通過觀察捕獲原子的熒光來檢測。ATTA分析完全不受其他元素(例如41K)的影響,可以用于增強超靈敏同位素痕量分析的能力。通過這種方法可以對自然樣品中的41Ca/40Ca進行分析,目前檢測限已經達到10-17,但總體分析效率有待進一步提升,樣品需還原至金屬Ca且用量較大。

綜上所述,3 MV AMS雖然無法將41K和41Ca完全分開,但在此能量下結合氣體電離探測器可一定程度上分離41K,從而將41Ca/40Ca的本底值降到10-13左右。

2 41Ca的AMS測量技術在生物示蹤中的應用

41Ca-AMS技術在生命科學[20-35]、生物醫學[36-46]、地球科學[19]、環境科學[95-98]、核天體物理[66]等諸多領域應用廣泛,本研究主要介紹41Ca-AMS技術在生物醫學領域中的示蹤應用。

2.1 41Ca的AMS測量技術在動物骨鈣動力學研究中的應用

骨質疏松是全球公共健康問題之一[18],骨鈣動力學研究對于骨質疏松的早期發現和治療非常重要。與質量平衡法、骨活檢的組織形態測量、雙能X射線骨密度儀(DXA)測量骨密度(BMD)以及利用生化標志物監測骨吸收率的短期變化等方法相比,鈣同位素示蹤技術是一種理想的骨鈣代謝直接測量方式。目前41Ca示蹤技術是探究生物體骨鈣代謝情況以及鈣缺乏疾病機理等方面的重要手段,在評估人類骨骼健康、監測骨重塑動態和藥物干擾效果等方面具有潛力[21-23]。早期測量只獲得一些簡單的結果,例如狗的骨代謝方法研究[18];人體血液與尿液中的41Ca/40Ca比值在一次性給藥100 d左右后趨于穩定,約為1.5×10-11[24];藥物干擾對41Ca濃度的影響等[21-22]。

二十世紀初,科學家們開始通過41Ca示蹤人體骨轉換率的微小變化建立人類鈣平衡的線性動力學模型,可用來預測個體骨轉換率的變化[25]。并通過群體藥代動力學(NONMEM)分析41Ca數據,建立描述尿液中41Ca示蹤劑動力學的連續三隔室模型[26],后將其擴展為四隔室模型[27-28],可用來評估藥物干擾、飲食、激素水平和生活方式對骨骼代謝的影響。例如,評估雙膦酸鹽[29]、大豆異黃酮[30-31]、維生素D[32]等藥物以及特殊飲食[33-34]對骨吸收的影響和高鈣飼料(奶制品或碳酸鈣)對代謝綜合癥豬的冠狀動脈鈣沉積的影響[35]。與傳統技術相比,使用41Ca對骨骼進行同位素標記可以縮短干預周期,降低受試者數量,并更容易進行交叉研究。

2.2 41Ca-AMS測量技術在疾病防治與機理研究中的應用

41Ca-AMS技術可以應用于臨床醫學中一些疾病的早期診斷和預后監測。如監測健康個體與特殊疾病(例如ESRD、甲亢和腫瘤骨轉移)患者之間的鈣動力學差異可作為患者的早期診斷和長期預后的監測指標。研究人員對晚期腎病(ESRD)患者和健康個體的血清進行41Ca標記,并通過AMS測量受試者血清樣本中的41Ca/40Ca比值,對比鈣動力學分布可以看出,ESRD患者血漿中的41Ca/40Ca比值與對照組存在明顯差異[36]。

航天醫學領域也離不開41Ca-AMS的技術支持。航天員在訓練和執行任務期間會長期處于失重狀態,骨鈣代謝失衡,骨量減少,且恢復非常緩慢,嚴重危害航天員的身體健康。對失重狀態下的實驗鼠進行41Ca標記,再用藥物進行干預。通過AMS測量實驗鼠股骨部位的41Ca/40Ca比值可以得到骨鈣沉積情況,從而評估失重對股骨攝取外源鈣的能力以及骨量下降和骨鈣代謝紊亂的機理,有利于針對失重導致的鈣代謝異常疾病提出相應的預防和治療措施[37-38]。

鈣吸收率的準確測量對于臨床醫學上合理補鈣和預防鈣代謝疾病具有一定指導意義。與傳統的鈣吸收率測量方式相比,41Ca標記體內鈣庫,可以區分內源鈣從而獲得補鈣劑的凈鈣吸收率[39-40]。表觀吸收率=(攝入Ca-糞便Ca)/攝入Ca×100%;凈鈣吸收率=(攝入Ca-糞便Ca+糞便中的內源Ca)/攝入Ca×100%;糞便中的內源Ca=糞便Ca×(糞便中41Ca/40Ca比值/血液中41Ca/40Ca比值)。通常凈鈣吸收率大于表觀吸收率,這種測量方法可以更精準的測量鈣吸收率,為臨床上補鈣劑量的確定提供理論指導。

41Ca-AMS技術也可以通過探究細胞內鈣離子動力學從而研究相關疾病的機理。由于缺血時細胞內外Ca2+濃度會發生變化,用41Ca作示蹤劑可以探究心肌缺血和氧氣再灌注時心肌組織中的鈣吸收和沉積情況,從而闡明不可逆肌細胞損傷的事件和機制[41]。致癌物質引起細胞癌變的過程中,胞漿內游離的Ca2+濃度呈現迅速升高的趨勢。因此可以通過分析增加的Ca2+來源開展致癌機理研究。使用致癌物質刺激人肺成纖維樣細胞時,41Ca-AMS技術可測量胞漿內Ca2+濃度變化和運動情況,為癌癥的機理研究提供了一種新的檢測手段[42-43]。這種方法還可用來檢測中樞神經系統類藥物(谷氨酸和MK-801)作用下的PC12細胞內外鈣內流情況[44]和藥物刺激破骨細胞時破骨細胞骨吸收行為[45-46]。

2.3 41Ca-AMS測量技術在植物示蹤研究中的應用

此外,應用41Ca-AMS技術還可以對植物體進行示蹤研究。2016年[99],國內首次建立了41Ca-AMS技術示蹤植物體的樣品制備方法,并基于該方法對桃樹做了個別樣品的41Ca示蹤研究[100],通過樹干注射的方法進行41Ca標記,利用AMS測量各器官的鈣含量。結果表明,41Ca-AMS技術可以用于研究植物對土壤和水中Ca2+的吸收情況以及Ca2+在植物體內的轉運機制,有望為農作物的科學補鈣和破譯植物-土壤系統界面化學相互作用過程提供幫助。

3 小結與展望

雖然利用41Ca-AMS可以實現生物樣品的批量測量,但是,目前41Ca-AMS技術仍然面臨一些挑戰。對于小型AMS測量41Ca來說,如何將本底降到可以測量自然含量下的樣品是亟待解決的問題。樣品制備階段可以利用CaH2和CaF2兩種樣品形式對41K進行抑制,其中CaH2的效果雖好,但制備流程復雜且危險,樣品保存困難,不適合大批量測量;CaF2易于制備,但對41K的抑制在4個量級左右,且氟化物具有較強的記憶效應,導致即使使用大型AMS,在41K和41Ca完全分離的情況下,依然得不到理想的本底水平,無法滿足大批量的地質年代學樣品的測量。