大黃魚(Larimichthys crocea)幼魚同生群內不同增重性能子群間的臟器生理差異*

葉文婷 蔣宏雷 江 柳 劉哲宇 李有志 王志錚①

(1. 浙江海洋大學水產學院 浙江舟山 316022; 2. 寧波市海洋與漁業研究院 浙江寧波 315103)

大黃魚(Larimichthyscrocea)隸屬于硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬, 素有“海水國魚”之美譽, 是當前我國最為重要的海水網箱養殖對象和近海增殖放流的當家魚種(江柳等, 2021)。種內個體差異作為自然界普遍存在的現象, 既是直觀甄選特異性群體的重要依據, 也是深入探掘種質特異性的宏觀生物學基礎。全面剖析目標同生群內個體差異的漸變特征,客觀揭示引起群內種質特異性分化的內在邏輯, 對于構建基于種內競爭和環境適應的群體分化理論,并指導目標物種的精細化選擇育種和建立科學高效的養殖模式具有重要研究價值。動物的機體代謝水平與其生長速度密切相關。生長速度作為度量個體差異的重要生物學參數, 既是綜合反映目標生物生理狀況的顯性指標, 也是評判苗種質量優劣程度的重要選項, 更是最為直觀的選擇育種性狀。由此, 針對大黃魚仔魚個體大小差異有隨養殖時間推移而逐漸放大(竺俊全等, 2004), 以及不同生長性能大黃魚養殖群體間在形質特征、腸道菌群種類組成、致病菌含量和肌肉生長調控基因表達上均存在顯著差異(李英英等, 2017; 李有志等, 2023; 張波等, 2023)的研究結果,本研究團隊以用于人工增殖放流的大黃魚幼魚同生群為研究對象, 以鰓和內臟(鑒于多數實驗組別的臟器質量過小, 均不足以滿足酶活力測定需求, 為便于比較, 以全臟為測定材料)為靶標, 試圖從機體代謝角度探析大黃魚幼魚同生群內不同增重性能子群間的臟器生理狀況差異, 以厘清基于生長性能漸變的生理異化特征, 揭示子群間生長性能分化機制, 并佐證李有志等(2023)所述子群間生存對策差異的可靠性,旨為大黃魚生長性能評價體系的構建和指導速生品種選擇育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚 寧波象山港灣水產苗種有限公司育苗車間出池后, 在象山西滬港海域的板式網箱(規格: 5 m×3 m×6 m) 內常規養殖3 個月的大黃魚同生群幼魚。隨機撈取其中形體完整、無病無傷的健壯個體 3 000 尾, 立即充氣并停食暫養于若干直徑1 m、高1.5 m 的白色塑料桶(實際水位1.3 m)內。2 d后, 用Sartorius BS223S 型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司, 精度0.01 g)逐尾稱量體質量并按其出現率分為5 個子群, 具體見表1。

表1 不同增重性能子群的體質量分組Tab.1 Body mass grouping of subgroups with different growth performances

1.1.2 實驗用水 48 h 暗沉淀、二級沙濾處理后的自然海水, 水溫(27.0±0.2) °C、DO (6.81±0.01) mg/L、pH 8.24±0.01、鹽度20.62±0.12。

1.2 實驗方法

1.2.1 臟器比例性狀的測定 各子群均任取實驗魚30 尾作為測定對象, 用Sartorius BSA223S 型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司, 精度1 mg)逐尾依次稱量體質量、鰓質量、內臟質量和凈體質量(去除鰓組織和內臟后的體質量), 并據此計算鰓系數(鰓質量/體質量)、內臟系數(內臟質量/體質量)、內臟凈重比(內臟質量/凈體質量)、鰓凈重比(鰓質量/凈體質量)和鰓臟比(鰓質量/內臟質量)。

1.2.2 耗氧率的測定 以直徑32 cm 的白色塑料桶(實驗實際容積為7.5 L)為呼吸室, 將各子群實驗魚分別置于對應的呼吸室內穩定30 min 后, 隨即以液態石蠟為絕氧材料密封水表面(石蠟厚度1 cm 以上)開始實驗, 實驗起始時刻均為18:00。各子群均設3個重復, 每個重復各放入實驗魚1 尾。實驗周期為24 h, 每隔12 h 用移液管自呼吸室底部吸取15 mL 水樣, 并即刻用哈希便攜式sensionTM 156 多參數測量儀測定其DO 值。實驗結束時刻, 用定性濾紙吸盡實驗魚體表水分后, 用Sartorius BSA223S 型電子天平逐尾稱量各呼吸室內實驗魚體質量, 并據此計算各呼吸室的耗氧率(OR)。

1.2.3 窒息點的測定 以直徑9 cm 的透明塑料瓶(實驗實際容積為1 L)為呼吸室, 將各子群實驗魚分別置于對應的呼吸室穩定30 min 后, 以液態石蠟為絕氧材料密封水表面(石蠟厚度1 cm 以上)后即刻開始實驗, 實驗起始時刻均為18:00。各子群均設4 個重復, 每個重復各放入實驗魚4 尾。實驗期間, 持續觀察實驗魚存活情況, 并以玻璃棒多次輕觸無反應作為死亡判別標準, 待呼吸室內實驗魚死亡率為50%時, 立即用哈希便攜式sensionTM 156 多參數測量儀測定取自呼吸室底部水體的DO 值。

1.2.4 相關功能酶活力的測定 各子群隨機選取實驗魚5 尾, 于冰盤上逐尾摘取鰓和內臟, 4 °C 雙蒸水沖凈、濾紙吸干表面水分并借助Sartorius BSA223S型電子天平逐一稱重后, 立即分別放入已做好標記的樣品袋內并置于-80 °C 冰箱中保存備測。其中, 涉及鰓組織的為抗氧化酶(SOD、CAT、POD)和ATP 酶(Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase), 涉及內臟的為消化酶(淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶)、AKP、ACP 和ATP 酶(Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase)。上述酶活力測試盒均購自南京建成生物工程研究所, 測試步驟及計算方法均按所附說明書。測定儀器為UV-1240 型紫外可見分光光度計(島津國際貿易有限公司)。

1.3 數據處理

整理所得實驗測定數據, 運用SPSS24.0 軟件依次計算本研究所涉各實驗子群的臟器比例(鰓系數、內臟系數、內臟凈重比、鰓凈重比和鰓臟比)、耗氧率(晝均耗氧率、夜均耗氧率、日均耗氧率)、窒息點水中含氧量以及鰓和內臟相關酶活力的均值和標準差,采用LSD多重比較法檢驗子群內和子群間的差異顯著性(視P＜0.05 為顯著差異); 借助ChiPlot 網站(網址:https://www.chiplot.online/)分別構建各子群基于臟器比例性狀和耗氧率性狀間歐氏距離的聚類熱圖。

2 結果

2.1 臟器比例性狀的估算與聚類特征

由表2 和圖1a 可見, 子群間臟器比例性狀的差異及其聚類特征主要表現為: (1) 鰓系數呈A≈B≈C≈D＜E, 內臟系數、內臟凈重比和鰓凈重比均呈A≈B≈C＜D＜E, 鰓臟比除A、C 子群均顯著大于D、E 子群(P＜0.05), B 子群顯著大于E 子群(P＜0.05)外, 其余子群間均無顯著差異(P＞0.05); (2) 經聚類, 在臟器比例性狀上首先聚為一支的分別為A-B 子群和C-D 子群。綜上表明, 鰓系數和內臟系數的顯著高企均可致大黃魚幼魚增重性能的明顯下降, 臟器比例性狀聚類對甄別E 子群具良好的辨識效果。

圖1 基于臟器比例性狀和耗氧率的聚類熱圖Fig.1 Clustering heat map based on organ proportion traits and oxygen consumption rate

表2 實驗子群間臟器比例性狀的差異Tab.2 Differences in organ proportion traits among experimental subgroups

2.2 耗氧率及其聚類特征

由圖2 和圖1b 可見, 子群間耗氧率的差異及其聚類特征主要表現為: (1) 日均耗氧率呈 A≈B≈C≈D＜E。其中, 夜均耗氧率呈A≈B＜C＜D＜E, 晝均耗氧率呈A≈B＞C≈D, 且E 子群顯著大于除A 以外的其他子群(P＜0.05); (2) 耗氧晝夜節律已出現分化。其中,A、B 子群的耗氧率均呈晝均＞夜均(P＜0.05), 其余子群均呈夜均＞晝均(P＜0.05); (3) 除E 子群的日均耗氧率與其晝均和夜均耗氧率均無顯著差異(P＞0.05)外,其余子群的日均耗氧率則均介于晝均、夜均之間, 且三者間均具顯著差異(P＜0.05); (4) 經聚類, 在耗氧率性狀上首先聚為一支的分別為A-B 子群和D-E 子群。綜上表明, 日均耗氧率的高企和耗氧晝夜節律的分化均可導致大黃魚幼魚增重性能的明顯改變, 耗氧率性狀聚類對甄別C 子群具良好的辨識效果。

圖2 實驗子群間夜均、晝均和日均耗氧率的差異Fig.2 Differences in average nighttime, daytime, and daily oxygen consumption rates among experimental subgroups

2.3 窒息點

由圖3 可見, 窒息點水中氧含量隨增重性能的減弱總體上呈漸次增加的趨勢。其中, 與E 子群存在組間差異(P＜0.05)的僅為A、B, 呈E＞A≈B, C、D 子群作為過渡類型, 它們的窒息點與其他子群均無組間差異(P＞0.05)。由此可知, 大黃魚幼魚的增重性能會隨其窒息點水中含氧量的趨勢性提高而表露出極明顯的減弱效應。

圖3 實驗子群間窒息點水中含氧量的差異Fig.3 Differences in oxygen content in water at asphyxiation points among experimental subgroups

2.4 內臟消化酶和磷酸酶活力

由圖4 和圖5 可見, 內臟淀粉酶活力隨增重性能下降呈階梯式下降趨勢, 其中A 最大 (P＜0.05), B 顯著大于E (P＜0.05), C、D、E 三者間均無顯著差異(P＞0.05); 脂肪酶活力隨增重性能下降大體上呈先降后升趨勢, 除A 顯著大于C (P＜0.05), B、C 均顯著小于E (P＜0.05)外, 其余子群間均無顯著差異(P＞0.05);蛋白酶活力隨增重性能下降大體上呈先升后降趨勢,其中A 顯著小于C、E (P＜0.05), E 顯著大于除C、D以外的其他子群(P＜0.05); AKP 和ACP 酶活力分別呈A＜B＜C＜D＜E (P＜0.05)和A≈B＜C≈D＜E。綜上可知, 與子群間增重性能排序吻合度最高的內臟消化酶和磷酸酶活力分別為淀粉酶和AKP。

圖4 實驗子群間內臟消化酶活力的差異Fig.4 Differences in digestive enzyme activities in the viscera among experimental subgroups

圖5 實驗子群間內臟AKP 和ACP 活力的差異Fig.5 Differences in AKP and ACP activities in the viscera among experimental subgroups

2.5 鰓組織抗氧化酶活力

由圖6 可見, 鰓組織SOD、CAT 和POD 酶活力分別呈A＞B＞C≈D≈E、A＞E＞B≈C≈D 和A＞B≈E＞C＞D。由此可知, 諸酶活力中與子群間增重性能排序相似性最高的抗氧化酶為SOD。

圖6 實驗子群間鰓組織抗氧化酶活力的差異Fig.6 Differences in antioxidant enzyme activities in gill tissues among experimental subgroups

2.6 內臟和鰓組織ATP 酶活力

由圖 7 可見, 鰓組織 Na+/K+-ATPase 和Ca2+/Mg2+-ATPase 酶活力均呈 A＞B≈C＞D≈E; 內臟Ca2+/Mg2+-ATPase 酶活力無組間差異(P＞0.05),Na+/K+-ATPase 酶活力除 A 顯著大于 D、E 子群(P＜0.05)外, 其余子群間均無顯著差異(P＞0.05)。由此可知, 鰓組織ATP 酶活力在區分不同增重性能子群上較內臟具更高的辨識度。

3 討論

3.1 臟器比例性狀與增重性能間的相關性

動物的組織和臟器按其生理代謝功能可分為活性和惰性兩部分(牟恩鏇等, 2021)。鰓和內臟共同構成了魚體的活性部分?！捌鞴俅x活性假說”指出, 動物的活性內臟系數與其代謝水平呈正相關(Itazawaetal, 1983; Oikawaetal, 1992)。故, 本研究中鰓系數和內臟系數分別呈A≈B≈C≈D＜E 和A≈B≈C＜D＜E (表1),以及耗氧率性狀聚類上首先聚為一支的分別為A-B子群和D-E 子群(圖1b)的結果, 在印證魚類活性內臟系數與其體質量呈負相關(Grimetal, 2012; Luoetal,2013)這一論斷可靠性的同時, 也客觀反映了高企的機體代謝能耗是導致D、E 子群增重性能明顯弱于其他子群的本質。魚類的耗氧晝夜節律與其攝食運動習性息息相關。經調研, 棲息于自然海域的大黃魚往往具有晝伏夜出的生活習性。李有志等(2023)研究表明,在網箱養殖生境下大黃魚幼魚以專注搶食為導向形成并固化了優先保障攝食運動代謝的生存對策, 其中A 子群依托強勁的競食優勢, 建立了優先獲得食物保障的高收益攝食策略, E 子群為有效彌補在競食中所處的劣勢地位, 固化了通過顯著提高機體代謝水平以大幅增加覓食運動量的低收益攝食策略。故,本研究中圖1a 所示在臟器比例性狀聚類上首先聚為一支的分別為A-B 子群和C-D 子群, 與A、B 子群耗氧率均呈晝均＞夜均(P＜0.05), 而其余子群則均呈晝均＜夜均(P＜0.05) (圖2)的結果, 所反映的子群間在機體能量代謝聚類和耗氧晝夜節律分化上完全相吻的情形, 既闡釋了在日均耗氧率和窒息點均相近(圖2,圖3)的情形下, 調整耗氧晝夜節律以積極響應投飼主要在白晝進行的傳統養殖模式是導致A、B 子群增重性能明顯強于C、D 子群的重要途徑, 也揭示了在傳統人工投飼場景(投喂時間相對固定且時長較短)下,機體能量代謝上的差異是導致C、D、E 子群在搶食運動能力中明顯弱于A、B 子群, 而不得不保持固有耗氧晝夜節律的根本原因。

3.2 抗氧化生理和ATP酶活力與增重性能間的相關性

鰓不僅是大黃魚唯一的呼吸器官, 并且還在其機體滲透壓調節中發揮著極為重要的作用。窒息點系直接反映水生動物耐低氧能力的重要生理指標(楊程等, 2016)。Na+/K+-ATPase 和Ca2+/Mg2+-ATPase 酶均屬調控細胞內外液滲透壓的跨膜蛋白(李有志等,2022)。故, 它們對鰓組織的生理狀況均具重要的指示作用。據報道, 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)作為生物有氧代謝產生的對細胞具毒害作用的副產物(Mittler, 2002), 不僅可通過阻斷有氧呼吸鏈以減少ATP 的形成, 而且還會通過增強脂質過氧化作用改變細胞膜的流動性和完整性, 從而導致ATP 酶活性的下降(李海英等, 2008), 當體內過多的ROS 不能被及時清除時, 勢必會造成細胞內各類大分子的氧化損傷, 并進而引起生物有機體的各種生理病變(Lietal, 2001)。因此, 窒息點和ATP 酶活力均可作為反映有機體健康狀況的重要生理指標。SOD、CAT 和POD 作為抗氧化酶系統的重要成員, 在保持體內ROS 動態平衡和維系細胞正常代謝中起著十分重要的作用(王志錚等, 2013)。其中, SOD 在清除活性氧反應過程中最早發揮作用(張克烽等, 2007), 是最能代表機體抗氧化防御變化特征的指標酶(Wilhelm Filhoetal, 1993)。故, 本研究中鰓組織SOD、CAT 和POD酶活力分別呈 A＞B＞C≈D≈E 、 A＞E＞B≈C≈D 和A＞B≈E＞C＞D (圖 6), Na+/K+-ATPase 和 Ca2+/Mg2+-ATPase 酶活力均呈A＞B≈C＞D≈E (圖7), 窒息點水中氧含量除E 顯著大于A、B (P＜0.05)外, 其他子群間均無顯著差異(P＞0.05) (圖 3), 以及在耗氧率性狀聚類上首先聚為一支的分別為A-B 子群和D-E 子群(圖1b)的結果, 既表明A、B 子群鰓組織強大的ROS清除能力不僅為支撐并維系它們在搶食競爭中的優勢地位保證了持續而充足的能量供給, 而且也為它們在耗氧晝夜節律調整后有氧呼吸鏈仍不受影響提供了重要的生理保障, 從而有效促進了增重性能的明顯躍升, 也映射了通過顯著提高日均耗氧率(圖2)以增加攝食運動頻率來彌補競食能力處于劣勢地位的窘境, 和高企鰓組織CAT 和POD 酶活力以抵御ROS 的快速產出, 是導致E子群耐低氧能力顯著受抑和增重性能顯著下滑的重要原因。綜上, 鑒于鰓組織SOD 酶活力在甄別搶食能力上的良好區分度, 可將其視為大黃魚同生群幼魚搶食能力的指示酶。與此同時, 內臟 Ca2+/Mg2+-ATPase 酶活力無組間差異(P＞0.05), Na+/K+-ATPase 酶活力除A 顯著大于D、E子群(P＜0.05)外, 其他子群間均無顯著差異(P＞0.05)(圖7)的結果, 在進一步證實鰓組織在機體滲透壓調節上較內臟更具重要性的同時, 也揭示了因增加攝食運動頻率而高企的內臟能量代謝負荷是導致D、E子群Na+/K+-ATPase 酶活力和增重性能均顯著低于A子群的根本原因。

圖7 實驗子群間鰓組織和內臟ATP 酶活力的差異Fig.7 Differences in ATP enzyme activities in gill tissues and viscera among experimental subgroups

3.3 內臟消化生理和磷酸酶活力與增重性能間的相關性

肝臟是魚體的代謝中心(陸忠康, 2001)。研究發現, 肝胰臟不僅是魚類淀粉酶中心生成器官(陳春娜,2008), 而且也是魚體諸臟器中淀粉酶活性的最高者(Uysetal, 1987; 周景祥等, 1999; 馬愛軍等, 2006;劉忠義等, 2006)。故, 可將淀粉酶活力視為衡量魚類肝臟健康程度的重要指標酶。由此, 本研究圖4 所示內臟諸消化酶中僅淀粉酶活力大體上表露為隨大黃魚幼魚增重性能下降而下降的結果, 所反映的大黃魚幼魚增重性能與其內臟淀粉酶活力具較強相關性的特征, 揭示了提高肝臟健康度對其內臟代謝降耗所具的重要作用。

AKP 和ACP 均屬正磷酸單酯水解酶, 在機體骨化以及部分營養物質的消化、吸收和轉運過程中起重要作用, 系廣泛存在于各種動物體內的重要解毒體系(何海琪等, 1992)。其中, AKP 作為營養吸收的標志物(Segneretal, 1989), 通過與ATP 酶的共同作用,可將消化酶作用產生的小的多肽和氨基酸穿過細胞膜(Gawlickaetal, 1995; Bagloleetal, 1998); ACP 系溶酶體的標志酶, 在細胞內消化過程中起重要作用。據報道, AKP 和ACP 活性在魚體內的分布并不均衡,其中大黃魚高AKP 活性的臟器主要為胃和前腸, 高ACP 活性的臟器主要為肝臟和胃(俞軍等, 2016), 即大黃魚內臟較鰓和肌肉組織具更高的AKP 和ACP活性。無疑, 本研究圖5 所示內臟AKP 和ACP 酶活力分別呈A＜B＜C＜D＜E (P＜0.05)和A≈B＜C≈D＜E 的結果, 所反映的它們與大黃魚幼魚增重性能間均存在負相關關系的特征, 無疑提示了它們作為非特異性免疫酶的重要成員, 在有效抑制因機體代謝能耗顯著高企對內臟帶來的損害中所起的重要保護作用。綜上, 鑒于內臟AKP 在甄別增重性能上較ACP 酶活力具更好地區分度的結果, 故可將其視為評價大黃魚同生群幼魚增重性能的重要指示酶。

4 結論

(1) 鰓系數、內臟系數和日均耗氧率的顯著高企(P＜0.05)均可導致大黃魚幼魚增重性能的明顯下降,耗氧率性狀聚類和臟器比例性狀聚類分別對甄別C、E 子群具良好的辨識效果。

(2) 耗氧晝夜節律的分化是引起大黃魚幼魚增重性能發生明顯改變的主因, 調整耗氧晝夜節律以積極響應投飼主要在白晝進行的傳統養殖模式是導致A、B 子群增重性能獲得明顯增強的重要途徑。

(3) 隨窒息點水中含氧量的趨勢性提高, 大黃魚幼魚的增重性能將表露出極明顯的減弱效應。表明,提高大黃魚幼魚的耐低氧能力, 對其在搶食運動中占據優勢地位并進而增強增重性能具重要助益。

(4) 內臟消化酶和非特異性免疫酶中, 酶活力隨增重性能增強呈單調增加的僅為AKP。故, 可將其作為評價大黃魚同生群幼魚增重性能的重要指示酶。

(5) 鰓組織非特異性免疫酶中, 與競食地位最相關的僅為SOD。故, 可將其視為表征大黃魚同生群幼魚搶食能力的重要指示酶。