夏桑菊防治干眼癥的網絡藥理學機制及實驗驗證*

李進良， 胡雙飛， 蒙奮兆， 李沛波，吳灝， 彭維， 蘇薇薇， 王永剛， 孫維廣

1.中山大學生命科學學院 / 廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心 /廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275

2.廣州白云山星群（藥業）股份有限公司，廣東 廣州 510288

干眼癥稱為角結膜干燥癥（KCS），具有干澀、異物感、燒灼感和流淚增多等多種癥狀，全球干眼癥患病率為5%～50%，女性和老年人群中患病率更高，嚴重影響了患者的工作效率與生活質量（Zhao et al.，2023）。目前，干眼癥治療主要依靠西醫治療。西醫治療效果顯著，但副作用嚴重且價格昂貴，給患者家庭乃至社會造成了沉重的經濟負擔（吳改萍，2022；Demolin et al.，2023）。因此，亟須尋找一種經濟、有效、安全性好的治療方法。中醫藥具有原材料取自天然藥材，臨床表現為安全性高、副作用低等特點，中醫治療備受干眼癥患者的關注。中藥具有多成分、多靶點整體調節效果，可能是治療干眼癥的理想用藥。

夏桑菊（XSJ ，Xiasangju）是一種傳統的中藥復方，主要由夏枯草、桑葉和野菊花組成，源自清代著名溫病學家吳鞠通《溫病調辨》中的經典方劑“桑菊飲”（孫鵬等，2016）?！吨袊幍洹罚?020 版）中記載其具有清肝明目，疏風散熱功效，能夠用于頭暈耳鳴、風熱感冒等疾病的治療；且其原料取自藥食兩用藥材，安全可靠。夏桑菊以蒙花苷（linarin）、綠原酸（CA，chlorogenic acid）、迷迭香酸（RA，rosmarinic acid）等化合物為主要藥效成分，抗炎、抗氧化活性效果明顯，具備眼部疾病保健、預防、醫療潛力（Wu et al.，2022）。姚向超等（2015）將野菊花開發成滴眼液治療蒸發過強型干眼，發現可以減輕干眼眼表的炎癥反應。石守禮（1978）從中草藥中篩選出夏枯草、菊花等配制成紅眼1號眼藥水治療急性結膜炎患者，發現治療2～4 d 即可痊愈。魚俊杰等采用中藥菊花、桑葉等制成清明眼藥水，治療電光性眼炎310例，總有效率99.97%。臨床結果表明，清明眼藥水是一種療效好、療程短的中藥滴眼劑。以上表明，夏桑菊具有治療干眼癥潛力（魚俊杰等，1992）。然而，夏桑菊治療干眼癥的臨床及作用機制研究尚未報道，未充分發揮藥典對臨床用藥的指導作用。

本研究采用廣州白云山星群（藥業）股份有限公司的夏桑菊浸膏，利用網絡藥理學方法及分子對接技術，探究夏桑菊防治干眼癥相關的有效成分、關鍵靶點以及過程中可能涉及的生物過程和信號通路。在網絡藥理學分析結果的基礎上，采用分子對接驗證，通過體外細胞實驗驗證，進一步探索夏桑菊有效成分對相關關鍵靶點的作用，為夏桑菊的外用劑型開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

綠原酸（110753-202119）、蒙花苷（111528-202112）、迷迭香酸（111871-202007）均購于中國食品藥品檢定研究院，其他材料為：HCE-T 人角膜上皮細胞系（富衡生物，FH1239）、夏桑菊浸膏（廣州白云山星群（藥業）股份有限公司，B220301）、TNF-α 檢測試劑盒（云克隆Cloud-clone，SEA133 Hu）等。

1.2 方法

1.2.1 夏桑菊化學成分檢測色譜條件參照《中國藥典》夏桑菊顆粒含量測定方法。離子源：ESⅠ（正、負離子模式檢測）；噴霧電壓正模式5 500 Ⅴ，負模式-4 500 Ⅴ；噴霧氣為 55 psi（1 psi = 1/145 MPa）；輔助加熱氣50 psi；離子源溫度500 ℃；氣簾氣35 psi；碰撞器壓力10 psi；掃描范圍m/z50～1 500。

1.2.2 化學成分對應靶點及疾病相關靶點收集通過TCMSP 數據庫檢索活性成分作用靶點，根據類藥性（DL） ≥ 0.18，并結合文獻對未納入篩選標準但報道有生物活性和藥理作用的成分也納入候選活性成分，篩選得到夏桑菊浸膏活性成分的作用靶點。以“xerophthalmia”為關鍵詞，在Gene‐cards 數據庫中檢索干眼癥相關靶點，整理合并得到干眼癥對應的疾病靶點。

1.2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”及PPⅠ網絡構建利用網站Ⅴenny 2.1.0 得到夏桑菊浸膏活性成分主要作用靶點。將上述靶點導入Cytoscape3.9.1 及String 數據庫構建“夏桑菊浸膏-成分-靶點-疾病”及PPⅠ網絡圖。

1.2.4 信號通路富集分析及分子對接利用DAⅤⅠD 數據庫對作用靶點進行GO（gene ontology）及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，選取夏桑菊浸膏核心成分和PPⅠ網絡中score排名前4的核心靶點，利用PubChem 數據庫、ChemBioOffice Ultra 13.0.2-Chem3D、PyMOL 2.5.2、AutoDockTools-1.5.7軟件進行分子對接。

1.2.5 夏桑菊有效成分體外細胞模型驗證

1） MTS 法檢測細胞活力。細胞用不同濃度（30、50、70、90、110、130 mmol/L）NaCl 分別模擬（350、400、450、500、550、600 mOsm/L）滲透壓處理人角膜上皮細胞24 h，更換培養基，加入20 μL MTS 孵育2 h 后，采用酶標儀測定波長490 nm 處吸光度值，按公式計算得各組的細胞活力

2）研究有效成分對高滲誘導下人角膜上皮細胞的保護作用。實驗分設不同組，采用600 mOsm/L（130 mmol/L NaCl ）滲透壓造模并同時給藥，MTS檢測細胞活力。

3）劃痕實驗。使用移液管在人角膜上皮細胞上劃出數條劃痕，倒置顯微鏡拍0、24 h 圖像，觀察實驗重復3次，并計算平均值。

4）Elisa 法檢測各組細胞培養液上清中炎癥因子TNF-α 的蛋白濃度。細胞按實驗設計分組并做相應處理，每組處理24 h，檢測細胞培養液上清。

5）對高滲誘導下人角膜上皮細胞相關基因的表達的檢測。細胞按實驗設計分組并做相應處理，處理24 h，提取總RNA，逆轉錄成cDNA 后于-20 ℃條件下保存。采用實時熒光定量基因擴增儀擴增各組cDNA目的基因。

以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

6）統計學分析。采用GraphPad Prism 8.0軟件分析實驗數據，結果采用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 夏桑菊浸膏活性組分的UFLC-Triple-TOFMS/MS分析

采用UFLC-Triple-TOF-MS/MS 技術，分別在正、負離子模式下分析夏桑菊浸膏組成，其總離子流圖如圖1所示。通過與標準品和公開數據庫的一級和二級質譜數據比對，共指認了61個化合物，其中包括19 種黃酮類化合物，17 種有機酸及其酯類化合物，5 種氨基酸類化合物，3 種核苷類化合物以及17 種其他化合物。為進一步利用網絡藥理學預測其治療干眼癥藥效及藥效作用機制提供了物質組成的基礎數據。

圖1 夏桑菊浸膏總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Xiasangju extracts

2.2 活性成分及疾病相關靶點收集

根據UFLC-Triple-TOF-MS/MS 結果，采用DL≥0.18標準，結合文獻對未納入篩選標準但報道有生物活性和藥理作用的成分（高蒲星等，2023），共獲得24 個活性成分，通過數據庫搜索及可視化處理，共得夏桑菊浸膏活性成分相關靶點315個及“夏桑菊-成分-靶點”網絡（圖2）。該網絡圖中共有339個節點和605條邊。

圖2 “夏桑菊浸膏-成分-靶點”網絡圖Fig.2 Xiasangju extracts-component-target network diagram

通過Genecards 數據庫檢索得到干眼癥相關靶點共146 個，與夏桑菊浸膏成分對應靶點取交集，如圖3所示，得到夏桑菊浸膏治療干眼癥主要作用靶點21個。

圖3 夏桑菊浸膏成分潛在靶點與疾病靶點 Ⅴenny 圖Fig.3 Ⅴenny diagram of potential targets and disease targets of compounds of Xiasangju extracts

2.3 網絡構建與分析

2.3.1 “夏桑菊-成分-主要靶點-疾病”網絡將上述夏桑菊主要靶點及疾病靶點可視化處理，構建“夏桑菊-成分-靶點-疾病”網絡圖，如圖4所示。節點熊果酸、山柰酚、迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷、蘆丁的度值（degree）排名前6。這6種成分作用靶點數量較多，表明它們可能是夏桑菊中主要藥理活性成分。參考2020年版《中國藥典》選擇夏枯草、桑葉、野菊花測定指標分別為迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷作為夏桑菊顆粒成分定量測定的3個質量控制成分，因此選取這3 種成分作為夏桑菊核心成分，后續進行分子對接操作及體外細胞實驗驗證。

圖4 “夏桑菊浸膏-成分-主要靶點-疾病”網絡圖Fig.4 Xiasangju extracts-component-target-disease network diagram

2.3.2 PPⅠ網絡將21 個交集靶點導入String 數據庫分析，得到PPⅠ蛋白互作圖（圖5）。其中度值排名前4 的節點為MMP9、IL-1β、Caspase1、IL-6，表明這些節點在PPⅠ網絡中處于核心位置，節點聯系較為緊密，可能為夏桑菊治療干眼癥的核心靶點。因此選取這4個靶點作為核心靶點進行后續分子對接操作及體外細胞實驗驗證。

2.3.3 GO 和KEGG 富集分析利用DAⅤⅠD 數據庫對作用靶點富集分析。靶點基因主要參與T細胞增殖的正調控細胞對脂多糖的反應、免疫反應、炎癥反應、細胞表面受體信號通路等生物學進程，對應細胞外間隙、質膜外側、細胞表面等細胞組分以及細胞因子活性、生長因子活性、信號受體活性等分子功能。GO 分析結果按P值從小到大排序，排名前10的條目見圖6。

圖6 GO分析結果Fig.6 GO analysis results

此外，上述靶點共富集得到66條KEGG 通路，相關通路有細胞因子-細胞因子受體相互作用、晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路、TNF 信號通路、ⅠL-17 信號通路、NF-κ B 信號通路等。富集通路按P值從小到大排序，將上述結果導入R 語言進行可視化，結果如圖7所示。

圖7 KEGG分析Fig.7 KEGG analysis results

2.4 分子對接

利用Ⅴina 軟件將綠原酸、迷迭香酸、蒙花苷分別與MMP9、Caspase1、IL-1β、IL-6這4 個核心靶點對應的蛋白質建立分子對接模型，預測12 種對接結果見表1。其中，結合能數值＜ -5.0 kJ /mol時表示結合較好，＜ -7.0 kJ/mol代表結合強烈（鄭蘇楠等，2022）。結果顯示預測結合能均＜ -6 kJ /mol，代表結合的可能性較高。如圖8 顯示MMP9 通過GLU-402、GLY-186、TYR-423 與蒙花苷形成氫鍵結合，Caspase1 通過ARG-240、GLU-241、ARG-391與蒙花苷形成氫鍵結合。

表1 分子對接最低結合能Table 1 Minimum binding energy for molecular docking kJ/mol

圖8 分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking model diagram

2.5 不同滲透壓對人角膜上皮細胞活力的影響

MTS 結果如圖9 所示，不同滲透壓處理24 h，滲透壓350、400、450 mOsm/L 時對人角膜上皮細胞的活性無顯著性影響，500～600 mOsm/L 時降低了人角膜上皮細胞活性?；跐B透壓為600 mOsm/L時能夠顯著降低人角膜上皮細胞活力（P＜ 0.01）。因此，后續選用600 mOsm/L 滲透壓處理，以探究迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷3種有效成分對細胞的保護作用；滲透壓 ≤ 450 mOsm/L 時，對人角膜上皮細胞的活性無顯著性影響，故選用450 mOsm/L滲透壓造模探究迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷對細胞的保護作用機制及遷移能力。

圖9 不同滲透壓處理24 h對人角膜上皮細胞細胞活性的影響 （n=3）Fig.9 Effects of different hyperosmosis treatment for 24 h on the cell activity of human corneal epithelial cells (n=3)

2.6 主要活性成分對高滲誘導的人角膜上皮細胞的保護作用

將人角膜上皮細胞在600 mOsm/L 滲透壓培養基中培養24 h 后，與對照組相比，600 mOsm/L 組的細胞活力降至49.3%（P＜ 0.01）。與600 mOsm/L比較，蒙花苷可顯著提高人角膜上皮細胞活性，細胞活性提高到74.8%（P＜ 0.05），如圖10 所示。表明蒙花苷對高滲透壓所致的細胞活性降低具有顯著抑制作用。

圖10 3種主要活性成分對高滲誘導的人角膜上皮細胞的保護作用的影響（n=3）Fig.10 Effects of 3 major active components on the protection of human corneal epithelial cells induced by hyperosmosis (n=3)

2.7 對高滲誘導的人角膜上皮細胞的遷移能力的影響

為探討3種活性成分是否在體外對人角膜上皮細胞具有促進修復的功能，通過劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。在24 h 高滲刺激后，正常對照組中角膜上皮細胞的遷移率為54.55%，450 mOsm/L的刺激條件下僅為9.04%，正常組與模型組之間有統計學差異（P＜ 0.01）；在綠原酸及蒙花苷的作用下，遷移率升高到32%及18%，結果有統計學差異（P＜ 0.05），研究表明 450 mOsm/L 的高滲刺激會降低角膜上皮細胞的遷移能力，而綠原酸及蒙花苷能提升高滲下角膜上皮細胞的移行能力，如圖11顯示。

圖11 實驗條件下24 h后的20 倍鏡劃痕實驗的代表性圖和量化統計圖 （n=3）Fig.11 Representative diagram and quantitative statistical plots of 20-fold mirror scratch experiment after 24 hours under experimental conditions （n=3）

2.8 對高滲誘導下人角膜上皮細胞IL-1β 及Caspase1基因的表達

PCR 結果顯示，450 mOsm/L 組IL-1β、Cas‐pase1mRNA 的相對表達量與正常對照組相比升高（P＜0.01）；與450 mOsm/L 相比，迷迭香酸、綠原酸組中的Caspase1、IL-1βmRNA 的相對表達量顯著降低（P＜0.05），蒙花苷組中的Caspase1mRNA的相對表達量顯著降低。如圖12 所示3 種有效成分能夠有效抑制高滲誘導下人角膜上皮細胞中IL-1β及Caspase1基因表達。

圖12 3種活性成分對高滲誘導下人角膜上皮細胞IL-1β、Caspase1基因的表達的影響（n=3）Fig.12 Effects of 3 major active components on the expression of IL-1β and Caspase1 genes in human corneal epithelial cells induced by hyperosmosis (n=3)

2.9 對高滲誘導下人角膜上皮細胞分泌TNF-α 水平的影響

Elisa 結果顯示， 與正常對照組相比，450 mOsm/L 組中的TNF-α 蛋白濃度明顯升高（P＜ 0.05）；與450 mOsm/L 組相比，迷迭香酸、綠原酸組的TNF-α蛋白濃度明顯降低（P＜ 0.05）如圖13 所示。表明迷迭香酸、綠原酸有效抑制了細胞中炎癥因子TNF-α的分泌。

圖13 3種活性成分對高滲誘導下人角膜上皮細胞分泌TNF-α 水平的影響（n=3）Fig.13 Effects of 3 major active components on the secretion of TNF-α by human corneal epithelial cells induced by hyperosmosis (n=3)

3 討 論

通過UFLC-Triple-TOF-MS/MS 技術共指認61個化合物，篩選獲得夏桑菊中24 種化合物成分，在“夏桑菊-化合物-靶點”網絡中，發揮藥效作用最活躍的成分為熊果酸、山柰酚、綠原酸、迷迭香酸、蘆丁、蒙花苷。研究表明，這6種化合物能夠抑制炎癥反應和氧化應激，減輕眼部炎癥和細胞損傷（Chen et al，2021；李亞梅等，2020；胡盼盼，2021；羅飛等，2021）。夏桑菊浸膏中的6 種活躍成分起到治療干眼癥的關鍵作用。

PPⅠ網絡及關鍵靶點分析，夏桑菊通過MMP9、IL-1β、Caspase1、IL-6等關鍵靶點發揮藥效作用。該4個靶點與干眼癥密切相關，其中Caspase1、ⅠL-1β 為已報道ROS-NLRP3-ⅠL-1β 信號通路中的成分（周洋等，2020）。高滲產生的ROS可誘導NLRP3的激活，進而促進Caspase-1 激活導致ⅠL-1β 分泌增加，突出了ROS-NLRP3-ⅠL-1β 信號軸在干眼癥進展過程中的啟動作用（Dai et al.，2019）。因此，本研究利用氯化鈉誘導的人角膜上皮細胞高滲模型研究發現，迷迭香酸、綠原酸及蒙花苷對高滲誘導下對人角膜上皮細胞具有保護及提升遷移能力作用；在基因轉錄水平上，3 種有效成分下調Caspase1和IL-1β的mRNA 表達，減少促炎介質產生；這與本研究基于網絡藥理學的預測結果相互印證。

通過GO、KEGG 結果分析，細胞因子和其受體相互作用在干眼癥的發生和發展中發揮著重要的作用。例如，ⅠL-1β、ⅠL-6、ⅠL-17、TNF 等多種細胞因子及受體的水平在干眼癥患者的淚液中明顯升高，這些細胞因子刺激角膜、結膜和淚腺上皮細胞分泌更多的炎癥介質和細胞因子，從而引起眼部組織的炎癥反應和損傷（Liu et al.，2020；Liang et al.，2020；Wei et al.，2014）。AGE-RAGE 信號通路在干眼癥的發病過程中也發揮了重要作用。RAGE是一種跨膜受體，廣泛表達于多種類型細胞上，包括免疫細胞、血管內皮細胞、神經元和肌肉細胞等，與AGE結合后可以激活多種信號通路，從而引起炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡等（Kaji et al.，2006）。研究表明，在干眼癥患者的淚液和角膜中，AGE 和RAGE 的水平均明顯升高，這與疾病的發生和發展密切相關（Wang et al.，2011）。AGE-RAGE 的激活使得炎癥反應和氧化應激的發生，從而導致眼部組織的損傷和炎癥反應。本研究通過體外細胞模型驗證了高滲誘導下IL-1β基因表達及TNF-α 蛋白分泌水平升高，進一步揭示了GO與KEGG結果的可靠性。

分子對接結果表明，3 種化合物與4 個靶點有較好的結合能力，此外，體外實驗結果也顯示3種化合物能對相關蛋白及基因發揮作用。進一步說明分子對接結果的可靠性。后續將對該研究進一步探究，確定這些化合物的治療劑量和途徑。

綜上，本研究聯合網絡藥理學與體外細胞實驗，初步闡釋了夏桑菊的物質基礎與其防治干眼癥的作用機制，并挖掘了更多可能靶點，為進一步研究其機制提供了基礎與方向。