抗松材線蟲病馬尾松種質資源遺傳多樣性分析及核心種質構建

鄧莉麗，劉青華，周志春，高 凱，駱定會

（1.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所 浙江省林木育種技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311400；2.南京林業大學 林學院，江蘇 南京 210037；3.浙江省臨海市自然資源和規劃局，浙江 臨海 317000）

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus病是20 世紀80 年代初傳入中國的一種毀滅性森林病害，其傳播速度快，防治難度大，危害中國松林面積超180 萬 hm2，其中，馬尾松Pinusmassoniana最易受感染，松材線蟲病對中國馬尾松林業經濟發展造成了極大破壞[1]。馬尾松具有速生、耐旱等優良特點，松林面積達804 萬 hm2，是中國南方荒山造林的先鋒樹種[2]。近40 a 的林業生產實踐和研究發現，松樹種間和種內不同個體對松材線蟲病的抗性存在較大差異，且馬尾松群體中存在抗病基因型，因此選育抗性品種是當前治理松材線蟲病害最經濟有效的途徑之一[3]。自2001 年開始，中國開展了馬尾松松材線蟲病抗性育種研究，現已收集保存一批抗松材線蟲病馬尾松種質資源[4-6]。種質資源是遺傳改良的物質基礎，種質資源收集保存的越多，其群體遺傳多樣性越高，但收集保存的成本也越高。FRANKEL 等[7]提出核心種質的概念，即用最小的遺傳資源數量和最小的遺傳冗余最大限度地代表整個遺傳資源的多樣性。通過構建核心種質，能最大限度地去除重復和遺傳關系較近的種質材料，加強現有抗性馬尾松種質資源的有效保護利用，降低管理成本[8]。分子標記法是林木遺傳多樣性分析、種質資源評價和核心種質庫構建常用的方法[9-13]。其中簡單序列重復(SSR)分子標記具有多等位基因、共顯性和高度多態性等優點，能夠直觀反映不同種質間遺傳信息差異，在遺傳育種中得到廣泛應用[14]。Lü等[15]利用 SSR 分子標記數據研究了桉樹Eucalyptuscloeziana的遺傳多樣性并構建了核心種質；唐玉娟等[16]利用12 對 SSR 引物對杧果Mangiferaindica種質資源的遺傳多樣性進行分析并構建了分子身份證；HU 等[17]利用 SSR 分子標記技術對獼猴桃Actinidiachinensis的遺傳多樣性進行研究，構建了獼猴桃核心種質。

本研究利用 SSR 分子標記技術對前期篩選獲得的103 份抗松材線蟲病馬尾松種質和安徽省林業科學研究院審定的高抗良種進行遺傳多樣性及親緣關系分析，并基于M 策略和隨機取樣策略構建核心種質，通過分析不同構建策略的核心種質確定抗性馬尾松核心種質的最適取樣比例，為抗性馬尾松種質資源的合理開發和利用以及挖掘優異基因提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年，在國家馬尾松種質資源庫中依據松脂和抗性的關系，從1 207 株樹中選擇120 份候選抗性馬尾松無性系，同年在松材線蟲病重災區嚴重感染林分中收集健康樹242 份，并將所有無性系嫁接保存于浙江省臨海市林業技術推廣和場圃旅游服務總站(28°88′N，121°01′E)。2018—2020 年連續3 a 高強度對收集區內的候選抗性馬尾松無性系進行人工接種松材線蟲測定，篩選存活健康株系，共獲得103 份抗性馬尾松無性系，另取安徽省林業科學研究院審定的抗松材線蟲病良種(為目前中國所有的抗松材線蟲病良種)作為對照。合計114 份，其中浙江37 份、江西26 份、安徽42 份、福建6 份、貴州1 份、廣西2 份。采集抗性樣株幼嫩針葉，在-80 ℃冰箱中保存，各試驗材料編號及來源見表1。

表1 材料編號及來源Table 1 Test materials’ number and source

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及SSR 引物信息 馬尾松針葉基因組DNA 采用北京艾德萊生物科技有限公司生產的改良CTAB 植物基因組DNA 快速提取試劑盒提取。利用超微量分光光度計，根據在260 nm 的吸光度D(260)和D(260)/D(280)確定DNA 樣品的純度和質量濃度，經檢驗合格后的DNA 用TE 溶液或去離子水(滅菌后)稀釋至20～50 mg·L-1，置于-20 ℃的冰箱保存備用。

參考董虹妤等[18]和YANG 等[19]使用的馬尾松 SSR 引物，用質量濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選條帶清晰且多態性較高的SSR 引物(圖1)，最終篩選出具有高多態性引物14 對(表2)，引物序列由浙江尚亞生物技術有限公司合成。

圖1 引物多態性檢測圖Figure 1 Primer polymorphism detection diagram

表2 14 對SSR 引物信息Table 2 14 pairs of SSR primer information

1.2.2 SSR-PCR 擴增和毛細管電泳 利用選取的14 對 SSR 引物對114 份馬尾松DNA 樣本進行PCR 擴增，設定本研究的反應體系為25.0 μL：2×TaqPlus Master Mix (Nazyme Code：P211-03)12.5 μL，引物F 和R (10 μmol·L-1)各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴增反應在Takara PCR Thermal cycler 上進行，其程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。所得PCR 產物采用Qsep100 全自動毛細管電泳核酸分析儀進行檢測和基因分型。

1.2.3 遺傳參數及群體結構分析 利用GenAlex 6.5[20]計算各位點的遺傳多樣性參數，包括等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Shannon’s 多樣性指數(I)、近交系數(Fis)、固定指數(F)和基因流(Nm)，并對收集的抗松材線蟲病馬尾松種質進行主坐標分析(PCoA)。采用Cervus 2.0[21]獲得微衛星位點的多態信息含量(PIC)。利用Structure 2.3.4[22]對抗性馬尾松種質資源進行分類，推測最佳聚類組群數目，確定群體結構，并對各亞群的遺傳多樣性參數進行分子方差分析(AMOVA)。

1.2.4 核心種質構建 對抗松材線蟲病馬尾松種質進行群體結構分析后，利用Power Core[23]和Core Finder[24]對各亞群基于不同算法構建核心種質。其中，Power Core 是利用隨機取樣策略和啟發式算法，尋找從初始階段到最終階段的最優路徑進行核心集合選擇；Core Finder 基于NP-完全覆蓋問題，采用拉斯維加斯式(LasVegas-style)隨機算法的M 策略進行樣本選擇。在構建核心種質過程中，Power Core 和Core Finder 會自動生成合理的取樣比例。最后利用SPSS 26.0 和Excel 中t檢驗對原有種質與核心種質各遺傳多樣性指標進行差異顯著性分析，同時運用PCoA 和Powermarker[25]對所構建的核心種質構建UPGMA 進化樹，確認構建的核心種質的代表性。

2 結果與分析

2.1 抗松材線蟲病馬尾松種質資源遺傳多樣性分析

由表3 可知：14 對 SSR 引物在114 份抗松材線蟲病馬尾松樣本中共檢測出115 個等位位點，Na為5～11，平均為8.17。所有材料的Ne為3.45～8.05，平均為5.54。Ho和He的分別為0～0.57 和0.51～0.73，He均值(0.64)高于Ho均值(0.06)，Fis平均為0.92，綜合表明該抗性馬尾松種質中存在雜合子缺失現象。PIC為0.82～0.95，平均為0.9，I為1.15～1.90，平均為1.51，表明所選引物多態性高。

表3 不同SSR 位點的遺傳多樣性統計Table 3 Genetic diversity of different SSR microsatellite loci

2.2 抗松材線蟲病馬尾松種質群體結構和主坐標分析

Structure 分析得出的結果經Structure Haevester 處理后發現(圖2A)：lnP(D)(馬爾科夫鏈不作數迭代后所得的對數似然值)持續增大，沒有拐點，可用ΔK[L(K)在連續K之間變化率的增量]來確定最優分組數(K)。由圖2B 可知：當K=4 時，ΔK取得最大值，表明參試的114 份馬尾松樣本被劃分為4 個亞群。亞群Ⅰ(綠色)包含了12 份種質資源，其中2 份來自廣西，1 份來自貴州，3 份來自福建，2 份來自安徽，4 份來自浙江；亞群Ⅱ(黃色)包含24 份種質資源，其中8 份來自安徽，7 份來自江西，9 份來自浙江，該亞群有12 份抗性馬尾松種質摻雜有來自紅色部分的基因；亞群Ⅲ(紅色)包含了29 份種質資源，其中10 份來自安徽(均為皖馬抗良種)，8 份來自江西，11 份來自浙江，共有12 份抗性馬尾松種質摻雜有來自黃色部分的基因；亞群Ⅳ(藍色)包含49 份種質資源，其中2 份來自福建，21 份來自安徽(其中1 份為皖馬抗良種)，11 份來自江西，15 份來自浙江(圖3)。由Structure 輸出的分組結果可知(表4)：篩選獲得的抗性馬尾松種質中有75.4%的個體樣本隸屬不同亞群的比例(Q)＞0.8，僅有12.3%的個體Q＜0.6，表明抗性馬尾松種質群體結構較強，不同來源的個體被聚在相同的遺傳結構中表明不同省間的馬尾松存在基因滲入現象。

圖2 lnP(D)和ΔK 隨K 變化的折線圖Figure 2 Line plots of lnP(D) and ΔK as a function of K

圖3 114 份抗性馬尾松樣本的Structure 聚類圖Figure 3 Structure cluster diagram of 114 samples of resistant P.massoniana

表4 各亞群基因型情況Table 4 Number of genotypes in each cluster

基于遺傳距離矩陣對抗性馬尾松材料進行主坐標分析(PCoA)。由圖4 可知：全部馬尾松種質資源可大致分為3 組，主坐標1 和2 分別解釋了位點信息數據中10.45%和6.74%的變異?；诳剐择R尾松114 份樣本主坐標分析圖可知：大部分地理來源一致的抗性馬尾松種質分布比較集中，但來自安徽、江西、浙江的部分抗性馬尾松種質在3 個組中均有分布。結合群體結構分析結果可知：114 份抗性馬尾松種質資源的分布情況基本符合群體結構分析。

圖4 抗性馬尾松114 份樣本主坐標分析Figure 4 Principal coordinate analysis of 114 samples

2.3 抗松材線蟲病馬尾松各亞群間遺傳多樣性及分子方差分析

由表5 可見：抗性馬尾松種質各亞群的遺傳多樣性整體水平較高。亞群Ⅳ的等位基因數在4 個亞群中最大(13.43)，亞群Ⅰ具有最低的等位基因數(6.07)?？剐择R尾松4 個亞群所包含的馬尾松個體數不同，但亞群間遺傳多樣性水平差異不明顯。亞群Ⅳ的Ne最高，為7.14，而最低的是亞群Ⅰ，為4.87。亞群Ⅳ的Ho和He均最高，但與具有最小值的亞群Ⅲ差異不顯著，分別高0.03 和0.15。

表5 馬尾松各亞群遺傳多樣性水平Table 5 Genetic diversity parameters for all populations of resistant P.massoniana

AMOVA 方差分析表明(表6)：抗性馬尾松遺傳變異14%存在于亞群間，而亞群內變異為80%，表明亞群內的遺傳變異是抗性馬尾松變異的主要來源。4 個亞群間FST為0.143，表明亞群間存在中等程度遺傳分化。

表6 基于微衛星數據的遺傳變異分析Table 6 Analysis of molecular variance from microsatellite data using GenALEx

2.4 抗松材線蟲病馬尾松核心種質庫構建與評價

利用M 策略和隨機取樣策略構建核心種質的遺傳多樣性指標見表7。結果顯示：基于隨機取樣策略的Power Core 和基于M 策略的Core Finder 分別篩選得到的核心種質均保留了原有種質100%的等位基因數。但Core Finder 核心種質包含的種質(72 份)少于Power Core (79 份)，且兩者間各遺傳多樣性參數差異不顯著(P＞0.05)。綜合以上分析表明：選擇M 策略抽取72 份抗性馬尾松種質能夠以最小的種質份數最大程度地代表收集區內抗性馬尾松種質資源的遺傳多樣性。利用M 策略構建的核心種質中包含廣西2 份(100.0%)、貴州1 份(100.0%)、福建4 份(66.7%)、安徽33 份(其中4 份為皖馬抗良種)(78.6%)、江西8 份(30.8%)和浙江24 份(64.8%)種質材料。

表7 不同策略構建的核心種質遺傳多樣性指標比較Table 7 Comparisons of genetic diversity index of core collections constructed by different tactics

由表8 可見：構建的72 份抗性馬尾松核心種質占114 份原有種質的63.16%，其Na均值、Ne均值、I均值分別占原有種質相應遺傳參數的100.00%、95.67%和94.96%。t檢驗結果表明：列入研究的抗性馬尾松種質與入選的核心種質的遺傳多樣性無顯著差異(P＞0.05)，說明本研究基于M 策略構建的抗性馬尾松核心種質能充分代表列入研究的原抗性馬尾松種質資源的遺傳多樣性，剔除了與114 份原有種質重復或親緣關系較近的材料。

表8 72 份抗性馬尾松核心種質與114 份原有種質遺傳多樣性對比Table 8 Comparison of genetic diversity between 72 core germplasm and 114 original germplasm of resistant P.massoniana

PCoA 分析(圖5)顯示：抗性馬尾松核心種質均勻分布在整個馬尾松種質資源中，表明本研究所構建的抗性馬尾松核心種質具有很好的代表性。UPGMA 進化樹(圖6)顯示：72 份抗性馬尾松可分為3 個類群，其中類群Ⅰ的11 份抗性馬尾松種質全部位于亞群Ⅰ(91.7%)，類群Ⅱ的30 份抗性馬尾松種質全部位于亞群Ⅳ(61.2%)，類群Ⅲ的抗性馬尾松種質18 份位于亞群Ⅱ(75.0%)，其余13 份位于亞群Ⅲ(44.8%)。結合結構分析可知：位于亞群Ⅱ中混雜有黃色和紅色的核心種質與亞群Ⅲ中的核心種質聚為一個亞類，亞群Ⅱ中以黃色為主的核心種質聚為另一個亞類，但抗性馬尾松核心種質的UPGMA 聚類結果與列入研究的原有種質結構分析和PCoA 分析結果基本一致，進一步對核心種質進行了確認。

圖5 72 份核心種質與114 份原有種質主坐標分析Figure 5 Principal coordinate analysis of 72 core germplasm and 114 original germplasm

圖6 72 份抗性馬尾松核心種質的UPGMA 聚類圖Figure 6 UPGMA clustering map of 72 samples of resistant P.massoniana

3 討論

3.1 抗松材線蟲病馬尾松種質資源遺傳多樣性及群體結構

遺傳多樣性在生物育種工作中至關重要，是評價生物多樣性的重要組成部分，物種的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，其對環境變化的適應能力也就越強[26]。本研究利用14 對 SSR 引物對經高強度人工接種松材線蟲后存活下來的103 份馬尾松種質和安徽省林業科學研究院審定的11 份高抗良種進行遺傳多樣性和群體結構分析。Na是衡量SSR 位點多態性高低的重要指標，其中所有種質的平均Na為8.17，高于沈敬理等[27]利用SSR 分子標記技術對131 個馬尾松無性系的研究(Na=3.67)，可能是本研究選擇的 SSR 引物具有較高多態性和基因分型檢測手段不一樣造成的。Ne、He、I等是評價遺傳多樣性的重要指標。高景斌等[28]利用 SCAR 分子標記對抗性馬尾松材料進行遺傳多樣性研究，其Ne和I分別為1.51 和0.46；YANG 等[19]運用20 對 SSR 引物分析馬尾松二代親本種質的遺傳多樣性，其Ne為3.01，I為1.26，PIC為0.89；董虹妤等[18]對選自馬尾松第2 代育種群體的12 份馬尾松材料運用13 對 SSR 引物進行研究，其中Na和I分別為3.17 和0.47。與上述研究結果相比，本研究所選擇的14 對 SSR 引物能有效用于檢測馬尾松的遺傳多樣性(Ne=5.54、He=0.64、I=1.51、PIC=0.90)，同時表明篩選獲得的103 份抗性馬尾松種質和安徽省林業科學研究院審定的11 份良種具有豐富的遺傳多樣性，在未來的抗性育種進程中具有很大的遺傳增益潛力。

Structure 結構分析、UPGMA 聚類分析和PCoA 分析被廣泛應用于推斷植物的群體結構，但三者的統計原理不同。PCoA 分析是一種非約束性的數據降維方法，通過對特征值和特征向量進行排序來尋找主坐標，從而有效地繪制所分析的樣本；Structure 結構分析基于貝葉斯模型的計算方法，根據基因型信息對多組樣本進行分類；UPGMA 聚類分析利用非加權組平均法對參試樣本進行層次聚類。PCoA 和UPGMA 聚類分析可直觀看到材料間的分類關系，但Structure 結構分析能清晰地反映材料間的遺傳背景和基因交流情況[29-30]?？傮w而言，Structure 結構分析、UPGMA 聚類分析和PCoA 分析相輔相成，兩兩使用有助于全面了解不同樣本間的遺傳差異。本研究Structure 結構分析結果表明：114 份抗性馬尾松種質資源被分成4 個亞群，而PCoA 分析將所有抗性馬尾松種質劃分為3 組，將結構分析所得4 個亞群中的亞群Ⅱ和亞群Ⅲ合并為一組，可能是因為這2 個亞群中的部分抗性馬尾松種質Q＜0.6，存在一定頻率的基因交流和滲透。在結構分析中，每個亞群內都包含來自不同地區的個體，地理來源一致的抗性馬尾松種質并沒有完全聚在一起，這可能是由于不同地區育種者之間親本交換或頻繁的人工引種，導致新環境中種質的遺傳信息發生了改變。安徽省林業科學研究院審定的11 份抗松材線蟲病良種是中國所有的抗松材線蟲病馬尾松優良種質，已在安徽省松材線蟲病疫區進行了大面積的林相改造和造林，在松材線蟲病防控中發揮了重要作用。這11 份抗松材線蟲病良種主要分布在亞群Ⅲ中，僅與19 份抗性馬尾松種質聚為一個亞群，這表明本研究篩選獲得的大部分抗性馬尾松優良品系與審定的良種遺傳關系較遠，具有較低的遺傳相似性。因此，本研究篩選獲得的103 份抗性馬尾松種質與審定的11 份良種遺傳信息同質性程度較低，且具有較高的遺傳多樣性，可保障今后營造的抗性林在生態系統上具有較強的穩定性。

3.2 抗松材線蟲病馬尾松核心種質庫構建

傳統的核心種質構建方法是對比不同種質資源在植物學、形態學等性狀上的差異來剔除親緣關系相近的樣本并且抽取核心種質，但表型性狀容易受到外界因素影響而表現不穩定[31]?；诜肿訕擞洈祿嫿ê诵姆N質可減少溫度、氣候、環境等外界因素的影響，能夠很好地作為植物形態和生理特性的有效補充。本研究根據SSR 分子標記基因分型數據，利用Core Finder 和Power Core，基于M 策略和隨機取樣策略構建抗松材線蟲病馬尾松核心種質。綜合對比分析不同構建策略，得到72 份抗性馬尾松核心種質，其保留了列入研究的原有種質全部的等位基因數，且各遺傳多樣性參數如Ne、I、He、PIC分別為5.30、1.43、0.63、0.92，均與114 份原有種質的遺傳多樣性參數無顯著差異(P＞0.05)。本研究構建的72 份抗性馬尾松核心種質在廣西、貴州、福建、安徽、江西和浙江6 省中均有分布，但江西抗性馬尾松核心種質抽取比例為30.8%，低于其他省份抗性馬尾松種質的入選比例，表明該省抗性馬尾松樣本存在較高的遺傳相似性。結合結構分析可知：72 份抗性馬尾松核心種質全面涵蓋了列入研究的抗性馬尾松種質的4 個亞群，亞群Ⅲ抗性馬尾松核心種質入選比例最低(44.8%)，表明該亞群抗性馬尾松種質遺傳信息比較一致；亞群Ⅰ的抗性馬尾松核心種質入選比例最高(91.7%)，表明該亞群可能存在最豐富的遺傳多樣性。

取樣比例的大小是核心種質庫能否構建成功的重要因素。WANG 等[32]和ESCEIBANO 等[33]認為核心種質取樣比例為5%～40%，大多數為5%～15%。李魁鵬等[34]利用SSR 分子標記從864 份杉木Cunninghamialanceolata中篩選獲得了80 份核心種質，占原有種質的9.3%；黃小鳳等[35]利用SNP 分子標記從221 份荔枝Litchichinensis品種(品系)中獲得了44 份核心種質，占原有種質的20%；張馨芳等[36]基于SSR 分子標記數據，從161 份板栗Yanshanchestnut中構建了含46 份種質的核心種質，取樣比例為28.6%。但本研究核心種質取樣比例為63.13%，高于其他木本植物的取樣比例。李自超等[37]認為核心種質取樣比例通常由原有種質的數量、群體結構和遺傳多樣性水平等決定，對于遺傳多樣性豐富、原有種質數量較小的群體，可適當增大取樣比例。

4 結論

利用14 對 SSR 引物對114 份抗松材線蟲病馬尾松種質的遺傳多樣性分析表明：所選抗性馬尾松種質具有豐富的遺傳多樣性(Na=8.17，Ne=5.54，He=0.64，I=1.51，PIC=0.90)，且本研究篩選的103 份抗性馬尾松材料遺傳結構簡單、遺傳變異豐富，可用于開展馬尾松重要性狀的關聯分析研究。根據SSR 分子標記數據基于M 策略構建了含有72 份材料的抗性馬尾松核心種質，保留了列入研究的原有種質100%的等位基因。經過t檢驗、PCoA 分析和UPGMA 聚類分析，構建的抗性馬尾松核心種質與列入研究的原有種質之間無顯著差異，剔除了遺傳相近的材料，具有良好的代表性。