核桃銨態氮轉運蛋白基因JrAMT2 的功能分析

凡婷婷，張佳琦，劉會君，王鳳敏，馬宇航，吳宇偉，胡恒康，黃有軍，李 巖，王克濤，黃堅欽，張啟香

（1.浙江農林大學 浙江省森林芳香植物康養功能研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

核桃Juglansregia為胡桃科Juglandaceae 胡桃屬Juglans植物[1]，其種仁含油量高，有“木本油料之王”的稱號[2]。同時，核桃木材堅實，是良好的硬木材料。作為重要的經濟林樹種，核桃大多種植于土壤貧瘠的山坡溝坎，不與糧爭地[3]。然而，核桃樹體高大，與其他果樹相比對礦質營養元素需求量較高，大量元素與核桃產量和品質形成緊密相關[4]，因此，提高核桃樹體對礦質元素的吸收能力對于提高核桃產量和品質至關重要[5]。研究表明：在核桃樹各器官中種仁的氮素質量分數最高，核桃樹吸收累積的礦質營養元素中氮素被商品核桃(種仁、硬殼)攜走的比例也最高，葉片次之[6]?？梢?，氮素可能是提高核桃產量和品質的關鍵營養元素。然而，過量施用氮肥會導致嚴重的環境問題，因此，提高氮素利用效率是提高核桃產量與品質的重中之重[7]。

土壤中氮素主要分為無機氮和有機氮兩大類，植物根系能夠吸收利用的主要是無機氮，主要以硝態氮和銨態氮形式存在[8-9]。植物根系對無機氮轉運調節途徑可分為2 種，即高親和力(HATs)和低親和力(LATs)的氮轉運系統[10]，HATs 在外部銨態氮、硝態氮濃度低于 0.5 mmol·L-1時介導吸收大部分的無機氮，而 LATs 則是在、濃度高于 0.5 或 1.0 mmol·L-1時介導吸收無機氮[10]。植物對銨態氮和硝態氮的吸收主要由銨轉運蛋白和硝酸轉運蛋白介導。土壤中同時含有植物可吸收利用的硝態氮和銨態氮時，由于植物吸收硝態氮需要先將其還原成銨態氮后才能進行同化利用，消耗的能量更多，所以植物對銨態氮表現出明顯的偏好性，而且當植物受鹽脅迫及活性氧的傷害時，銨態氮具有緩解作用，因此，介導植物對銨態氮吸收的銨轉運蛋白在植物氮同化中起著重要作用[11]。銨轉運蛋白基因主要有兩大類族，分為AMT1 和AMT2。在已知的銨轉運蛋白中大部分 AMT1 家族的轉運蛋白屬于高親和轉運體[12]，如擬南芥Arabidopsisthaliana中有6 個編碼銨轉運蛋白被鑒定，包括5 個AMT1 家族基因，1 個AMT2 家族基因。AMT1 家族基因中，AtAMT1.1 和AtAMT1.3 對擬南芥根系銨態氮吸收的貢獻率最高，為30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5 對擬南芥根系高親和銨態氮吸收的貢獻率略低于AtAMT1.1 和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4 在花粉中特異性表達[14]，在水稻Oryzasativa銨轉運蛋白基因家族中AMT1 家族有基因3 個，其中OsAMT1.1 和OsAMT1.2 為高親和力轉運體[15]；而 AMT2 家族以低親和為主，在擬南芥AMT2 家族基因中AtAMT2.1 在低親和范圍內適度促進擬南芥根系對銨態氮吸收，主要在銨從根部到地上部運輸中發揮作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同組織中包括根、芽和葉中都有表達，如AtAMT2.1 基因在擬南芥各器官中均有表達，主要表達在擬南芥的維管束及上皮層[17]，在擬南芥中AtAMT2.1 與AtAMT1s 之間還存在協同作用。此外，毛果楊PopulustrichocarpaPtAMT2.1 主要在葉片中，PtAMT2.2 在葉柄中高表達。除此之外，玉米Zeamays[18]、番茄Lycopersiconesculentum[19]、歐洲油菜Brassicanapus[20]等高等作物均鑒別出了AMT 基因，但到目前為止，研究大多集中于高親和的銨轉運蛋白AMT1 基因家族，對低親和的銨轉運蛋白AMT2 基因家族的研究較少。因此，闡明AMT2 的生物學功能和調控機制，對于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意義。

本研究以核桃JrAMT2 過表達株系為供試材料，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)及生理檢測的方法鑒定JrAMT2 基因在核桃植株體內的表達模式，進一步對核桃JrAMT2 基因進行生物學功能分析，為核桃優良品種選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實驗材料來自浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室保存的核桃野生型(WT)以及課題組2019 年獲得的核桃JrAMT2 過表達陽性植株[21]，其中JrAMT2 基因構建于PCMBIA1300 植物表達載體，載體抗性為卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3103 菌株介導將構建好的35S::JrAMT2::GFP 過表達載體轉化到核桃野生型體細胞胚中，植物篩選標記為潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃組培苗為野生型體胚和JrAMT2 過表達陽性體胚經脫水萌發獲得，溫室苗則由上述組培苗經生根、煉苗、馴化獲得。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息分析運用 SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)網站在線分析JrAMT2 蛋白質二級結構，運用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件對JrAMT2 蛋白進行跨膜結構域的預測，通過 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)軟件在線分析JrAMT2 基因結構。

1.2.2 植株的培養 同一JrAMT2 過表達陽性體胚萌出的植株為1 個株系，選取3 個核桃JrAMT2 陽性株系，命名為JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每個株系繼代培養至50 株以上，培養條件：溫度為25 ℃，濕度為 75%～80%，光照強度為2～15 klx，光照周期為16 h 光照8 h 黑暗，培養基為Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培養基。

采用2 步生根法獲得核桃馴化植株，選取陽性體胚萌發后經4 次繼代培養的核桃組培苗作為實驗材料。第1 步進行根誘導，5～8 cm 長的光生芽，轉移到補充有10 mg·L-1吲哚丁酸鉀(K-IBA)的DKW 固體培養基，在黑暗中培養7 d，誘導根原基的發生；第2 步，不定根誘導結束后將其轉移到粗蛭石∶DKW 培養基比例(體積比)為3∶2 的固體培養基中，溫度為25 ℃，濕度為75%～80%，光照強度為2～15 klx，光照周期為16 h 光照8 h 黑暗，培養時間為21～28 d，形成不定根，獲得核桃不同株系生根植株[22]。

核桃苗不定根形成后取出用清水沖洗，多菌靈浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠巖比例(體積比)為2∶1∶1 的混合土中，將移栽馴化成活后獲得的核桃再生植株在溫度為 25 ℃，濕度為 75%～80%，光照強度為2～15 klx，光照周期為16 h 光照8 h 黑暗的條件下培養[23]，獲得核桃不同株系溫室植株。

1.2.3 核桃JrAMT2 基因陽性鑒定 選用陽性體胚萌發后經4 次繼代培養的核桃組培苗進行綠色熒光蛋白(GFP) 檢測、PCR 及RT-qPCR 驗證，引物見表1。從再生植株頂芽開始向下截取 1.5 cm，培養14 d后觀察植株表型，每個株系均5 個生物學重復。選取植株頂芽、葉片、莖段混樣提取DNA 及RNA。PCR 反應程序為：94 ℃預變性 2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火溫度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 個循環；68 ℃延伸 7 min，PCR 反應產物進行質量分數為1.2%瓊脂糖凝膠電泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 儀器進行RT-qPCR，測定轉基因植株中JrAMT2 的相對表達量。反應程序為：95℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 個循環；95 ℃15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通過 2-ΔΔCt方法計算定量結果[24]。

表1 引物Table 1 Primers

取核桃野生型及核桃JrAMT2 過表達株系組培苗的根、莖、小葉，根縱切、莖橫切臨時切片分別放置于體視熒光顯微鏡(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明場和藍光(488 nm)激發條件下利用 ZEN lite 成像軟件連續拍照[25-26]。

1.2.4 生長參數、銨態氮和硝態氮測定 分別選取生長狀態一致的核桃野生型與3 個核桃JrAMT2 過表達株系組培苗，從頂尖向下剪取1.5 cm 莖段，含2～4 片復葉，培養14 d，每個株系均5 個生物學重復，測量株高及節間數。選取長勢相同的核桃野生型及JrAMT2 過表達植株采用2 步生根法馴化，移栽后用直尺測量統計不同株系生長0、20、40 d 的株高、節間長、葉片長度及葉片寬度。

分別選取生長狀態一致的核桃野生型與3 個核桃JrAMT2 過表達株系組培苗，培養14 d，采用2 步生根法獲得核桃生根植株，植株分為地上部分及地下部分2 個部分，清洗植株，分別測定地上部分及地下部分鮮質量，于105 ℃下殺青，80 ℃烘干至恒量，稱取干質量。使用蘇州科銘生物技術有限公司的植物銨態氮(ZATD-1-G)和植物硝態氮(ZXTD-1-G)試劑盒測定地上部分及地下部分銨態氮和硝態氮質量分數，每個株系均5 個生物學重復。

1.2.5 植株葉綠體觀察、葉綠素質量分數及葉綠素熒光測定 分別選取生長狀態一致的核桃野生型與3 個核桃JrAMT2 過表達株系組培苗，取頂尖向下第2 節間處復葉。將該葉片置于0.35 mol·L-1氯化鈉中研磨破碎至絮狀，取懸液于高倍光學顯微鏡下觀察，找到視野中單個完整的葉肉細胞，觀察細胞中的葉綠體, 使用image J 軟件計算葉綠體表面積與單層細胞表面積比率。每個株系均5 個生物學重復。

采用丙酮浸取法測定葉綠素質量分數。分別取0.1 g 核桃野生型與3 個核桃JrAMT2 過表達株系組培苗長勢一致的葉片，剪碎，置于15 mL 離心管中，加入10 mL 體積分數 80%丙酮溶液，于室溫黑暗處浸提，直至管內材料褪色變白，以80%丙酮溶液為對照，測定663 和646 nm 處吸光值，每個株系均5 個生物學重復。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)-1]，葉綠素 a 質量分數(wa) =20.3×D(646)，葉綠素 b 質量分數(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt為葉綠素質量分數(mg·g-1)，Vt為提取液總體積(mL)，mFW為葉片鮮質量(g)，D(646)和D(663)分別為646 和663 nm 處的吸光度。

葉綠素熒光測定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析儀(英國Hansatech 公司)測定。選取生長狀態一致的核桃野生型與3 個核桃JrAMT2過表達株系溫室苗由上向下第3 片葉片暗處理30 min，在飽和脈沖光(5 000 μmol·m-2·s-1) 下進行快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP 曲線) 的測定和繪制。參照SCHANSKE 等[27]的方法分析葉綠素熒光誘導動力學參數(JIP-test)。

1.2.6 數據分析 利用SPSS 26 軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(鄧肯法)，顯著性水平為0.05。使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 核桃JrAMT2 基因生物信息學分析

核桃JrAMT2 基因的全長為 1 464 bp，起始密碼子為 ATG，終止密碼子為 TGA。經過美國國家生物技術信息中心(NCBI)在線序列比對顯示：該基因的序列編碼的氨基酸序列屬于 Ammonium Transporter Family，編碼487 個氨基酸(圖1)，蛋白分子量為52.458 kD，預測分子式為C2433H3715N601O646S23，含有7 418 個原子，理論等電點為7.11，不穩定指數為35.61，脂溶指數為101.56，親水性平均值為0.472。該段蛋白質中包含20 種常見氨基酸：亮氨酸質量分數最高，達到11.7%，其次分別為甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，纈氨酸8.6%，半胱氨酸質量分數最低，僅為1.0%。JrAMT2 蛋白中分別含有29 個酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)和29 個堿性氨基酸殘基(Arg+Lys) (表2)。

圖1 JrAMT2 基因氨基酸序列Figure 1 Amino acid sequence of JrAMT2 gene

表2 JrAMT2 基因氨基酸組成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids

對核桃JrAMT2 蛋白跨膜區的預測結果表明：該蛋白N 端在膜外，C 端存在膜內，共含有11 個跨膜螺旋，跨膜螺旋區段分別位于24～46、59～81、129～151、158～180、195～214、227～244、254～276、288～310、314～333、346～368 和398～420，推測JrAMT2 屬于跨膜蛋白，并在N 端存在信號肽(圖2A)。

圖2 核桃JrAMT2 基因生物信息學分析Figure 2 Bioinformatics analysis of JrAMT2 gene in J.regia

對JrAMT2 蛋白二級結構的預測結果顯示：JrAMT2 的氨基酸組成中有4 種構象，其中 α- 螺旋有201 個氨基酸，占比 43.12%；延伸鏈有 93 個氨基酸，占比19.10%；β- 轉角有 30 個氨基酸，占比6.16%；無規則卷曲有154 個氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 銨轉運蛋白主要由 α- 螺旋和無規則卷曲組成(圖2B)。

對JrAMT2 基因結構的分析顯示：JrAMT2 基因由4 個外顯子，3 個內含子組成。與擬南芥AtAMT2 基因相比，擬南芥基因結構多了1 個外顯子和1 個內含子，與山核桃Caryacathayensis CcAMT2 基因[28]、栓皮櫟QuercussuberQsAMT2 基因[29]相比，外顯子和內含子數量相同，同源性較高(圖2C)。

2.2 核桃JrAMT2 過表達植株陽性驗證

在成功構建35S::JrAMT2::GFP 的過表達載體并通過農桿菌介導轉化核桃體胚后，對同一無性系JrAMT2 體胚經脫水萌發獲得的再生植株進行陽性鑒定。利用PCR 技術，以核桃JrAMT2 過表達植株3 個株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2 和JrAMT2-3) DNA 為模板，進行外源GFP 基因(729 bp)的PCR 驗證，檢測到大小約為 750 bp 的電泳條帶，與GFP 基因大小符合(圖3A)；進行目的基因JrAMT2 加外源GFP 基因全長(2 193 bp)的PCR 驗證，檢測到大小為2 000 bp 的電泳條帶，與目的基因大小符合(圖3B)；以核桃JrAMT2 過表達植株3 個株系的cDNA 為模板，利用實時定量PCR 技術對JrAMT2 基因表達量進行檢測，結果顯示：核桃JrAMT2 過表達植株3 個株系JrAMT2 基因相對表達量分別為野生型的10.58、12.80 和14.94 倍，顯著上調(圖3C)，表明核桃JrAMT2 過表達植株中JrAMT2 基因穩定表達。

圖3 PCR 和RT-qPCR 對核桃組培苗的JrAMT2 基因的檢測Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J.regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR

對獲得的過表達株系進行GFP 熒光陽性鑒定，分別將核桃過表達及野生型幼苗(圖4A)的小葉、莖、根置于熒光體視顯微鏡下在波長為488 nm 藍光激發下拍攝。結果顯示：過表達植株的小葉、莖、根表面呈現均勻的綠色熒光，其中腋芽處熒光更明亮(圖4B1～6)，野生型核桃幼苗的小葉、莖、根在熒光下拍攝無綠色熒光激發(圖4B7～12)，說明JrAMT2 蛋白在腋芽處積累。為進一步研究JrAMT2 基因在核桃幼苗中的表達，對過表達株系及野生型組培苗的莖段進行橫切，根進行縱切后，進行GFP 熒光檢測，結果顯示：核桃JrAMT2 過表達植株莖段橫切中呈現均勻的綠色熒光，其中在維管組織中熒光更明亮，野生型植株莖段橫切面無綠色熒面光(圖4B1～12)；核桃JrAMT2 過表達植株根段縱切面中呈現均勻的綠色熒光，且在維管組織中熒光更明亮，野生型植株根段縱切面無綠色熒光(圖4C1～8)。表明JrAMT2 基因在核桃幼苗的根和莖中均可穩定表達，其中JrAMT2 蛋白在根和莖的維管束組織中積累。

圖4 銨態氮轉蛋白基因JrAMT2 在核桃苗中穩定表達Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J.regia

2.3 核桃JrAMT2 基因的生物學功能分析

2.3.1 核桃JrAMT2 過表達植株生長表型分析 為了進一步研究核桃JrAMT2 基因的生物學功能，將3 個JrAMT2 過表達植株與野生型核桃植株培養14 d。結果表明：與野生型相比，核桃JrAMT2 過表達植株均生長旺盛，株高顯著增加，節間顯著增長(P＜0.05，圖5A)。3 個JrAMT2 過表達株系株高分別為3.87、4.23 和4.12 cm，節間長分別為0.33、0.35 和0.34 cm，野生型植株株高為3.30 cm，節間長為0.28 cm，與野生型相比，3 個JrAMT2 過表達株系株高分別增加了17.0%、28.0%和29.0% (圖5B)，節間長分別增加了19.0%、25.0%和24.0% (圖5C)。綜上所述，JrAMT2 過表達對核桃幼苗的生長有顯著提高作用。

圖5 核桃JrAMT2 過表達離體培養植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J.regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture

對核桃JrAMT2 過表達植株進一步馴化培養，成功獲得核桃JrAMT2 過表達溫室苗。對其生長表型進行分析(圖6A)，定植后培養40 d，核桃JrAMT2 過表達溫室苗的株高、節間長、葉片長度、葉片寬度增加顯著高于野生型(P＜0.05)。培養至第20 天時，與野生型相比，核桃JrAMT2 過表達溫室苗3 個株系株高分別增加21.9%、26.0%和24.6% (圖6B)，節間長分別增加41.2%、27.7%和26.3% (圖6C)，葉片長度分別增加18.7%、16%和30.7% (圖6D)，葉片寬度分別增加41.3%、48.2%和55.1% (圖6E)；培養至第40 天時，與野生型相比，JrAMT2 過表達溫室苗3 個株系株高分別增加53.6%、68.2%和62.1%，節間長分別增加37.2%、50.3%和44.8%，葉片長度分別增加了27.8%、34.1%和49.3%，葉片寬度分別增加24.3%、19.5%和29.2%。綜上所述，核桃JrAMT2 過表達溫室苗與野生型相比，株高、節間長、葉片大小均顯著增加，進一步證明JrAMT2 基因過表達加快了核桃的生長速度。

圖6 核桃JrAMT2 過表達陽性溫室苗性狀分析Figure 6 Character analysis of J.regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings

2.3.2 核桃JrAMT2 過表達植株對氮素吸收分析 為探究JrAMT2 基因在核桃中是否存在差異表達，將核桃野生型及核桃JrAMT2 過表達植株進行2 步生根，獲得核桃JrAMT2 過表達生根植株，將其分為地上部分與地下部分。與野生型相比，核桃JrAMT2 過表達生根植株地下部分不定根生長旺盛(圖7A)。對核桃JrAMT2 過表達植株地上部分及地下部分差異分析，分別提取3 個核桃JrAMT2 過表達株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用實時定量PCR 技術，分析地上部分及地下部分JrAMT2 基因表達的差異。結果表明：3 個JrAMT2 過表達株系地上部分JrAMT2 基因表達量分別是野生型的11.94、12.70 和15.06 倍，地下部分JrAMT2 基因表達量分別是野生型的19.07、23.34 和24.00 倍(圖7B)。對核桃野生型及3 個JrAMT2 過表達株系地上部分及地下部分進行干質量和鮮質量測定。結果表明：3 個JrAMT2 過表達株系地上部分鮮質量和干質量顯著高于野生型(P＜0.05)，與野生型相比，鮮質量分別增加23.45%、33.67%和56.26%，干質量分別增加23.45%、43.89%和56.26%；3 個JrAMT2 過表達株系地下部分干質量和鮮質量顯著高于野生型(P＜0.05)，與野生型相比，鮮質量分別增加222.65%、199.24%和344.38%，干質量分別增加222.65%、199.24%和354.33%(圖7C)。

圖7 核桃JrAMT2 過表達植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J.regia

基于核桃JrAMT2 過表達植株表型變化，本研究進一步測定核桃JrAMT2 過表達植株對硝態氮及銨態氮吸收。結果表明：與野生型相比，核桃3 個JrAMT2 過表達株系地上部分及地下部分銨態氮質量分數顯著增加(P＜0.05)，地上部分分別增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分別增加68.1%、61.9%和114.1% (圖7D)；核桃3 個JrAMT2 過表達株系地上部分硝態氮質量分數顯著降低(P＜0.05)，地下部分硝態氮質量分數顯著增加(P＜0.05)，地上部分分別降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分別增加63.5%、75.7%和70.3% (圖7E)。綜上所述，JrAMT2 基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2 基因過表達促進植株地下部分對銨態氮和硝態氮的吸收，并介導了銨態氮從地下部到地上部的運輸。

2.3.3 核桃JrAMT2 過表達植株葉綠素質量分數及葉綠素熒光特性分析 對核桃JrAMT2 過表達植株葉色與葉片細胞葉綠體進行觀察。核桃JrAMT2 過表達植株葉色與野生型相比顏色較深(圖8A)，在顯微鏡下觀察3 個核桃JrAMT2 過表達植株株系及野生型葉綠體特征發現，3 個核桃JrAMT2 過表達株系擴張的柵欄葉肉細胞中的葉綠體更致密(圖8B)。進一步分析發現：對3 個陽性株系進行總葉綠素質量分數測定，3 個核桃JrAMT2 過表達株系葉綠素質量分數顯著高于野生型(P＜0.05)，野生型總葉綠素質量分數為3.53 mg·g-1，核桃JrAMT2 過表達陽性植株3 個株系總葉綠素質量分數分別為4.64、4.69 和6.10 mg·g-1，與野生型相比分別增加了32.6%、34.0%和74.3% (圖8C)；JrAMT2 過表達株系葉綠體表面積在單層細胞表面積的占比顯著高于野生型(P＜0.05)，野生型葉綠體表面積與單層細胞表面積的比率為0.56，3 個核桃JrAMT2 過表達株系葉綠體表面積與單層細胞表面積的比值分別為0.67、0.68 和0.69，與野生型相比分別增加了19.41%、21.18%和22.94% (圖8D)。綜上所述，JrAMT2 基因過表達提高了葉綠體表面積與單層細胞表面積的比率及核桃葉肉細胞內葉綠素的積累。

圖8 核桃JrAMT2 過表達植株葉綠體及葉綠素質量分數分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J.regia with JrAMT2 overexpression

對3 個核桃JrAMT2 過表達株系進行快速葉綠素熒光誘導動力學曲線測定。結果顯示：與野生型相比，3 個核桃JrAMT2 過表達株系的O (Fo點)相、K 相降低，J 點、I 點、P (Fm)及J～P 點振幅均提高，OJIP 曲線較陡，表明JrAMT2 基因一定程度上提高了葉片的活性(圖9A)。與野生型相比，3 個核桃JrAMT2 過表達株系暗適應后的最大熒光強度(Fm)、最大量子產額(Fv/Fm)均提高，Fm分別提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分別提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2 基因一定程度上提高了光系統Ⅱ(PSⅡ)的光化學效率(圖9B)。計算歸一化處理的OJIP 曲線(Vt)[Vt=(Ft-Fo/(Fm-Fo)，Ft為任意時刻t的熒光值]，并計算相對熒光差異ΔVt[ΔVt=Vt處理-Vt對照，用ΔK、ΔJ值分別顯示在300 μs 和20 ms處的ΔVt值，表示放氧復活體的活性(OEC)]。結果顯示：與野生型相比，3 個核桃JrAMT2 過表達株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (圖9C)，表明JrAMT2 基因一定程度上提升了核桃葉片PSⅡ供體側及受體側電子傳遞效率及放氧復活體的活性。

圖9 銨態氮轉運蛋白JrAMT2 基因表達對核桃葉綠素熒光的影響Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J.regia

用JIP-test 參數對OJIP 曲線進行定量分析，結果顯示：核桃3 個JrAMT2 過表達株系在t=0 時的最大光化學效率(φPo)、反應中心捕獲的光能用于下游電子傳遞的量子產量(ΨEo)、吸收的能量用于電子傳遞的量子產量(φEo)上升，分別上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J 點的相對可變熒光強度(VJ)、最小熒光強度與最大熒光強度比值(Fo/Fm)、反應中心關閉凈速率(dV/dto)下降，分別下降了31.03%、35.29%、49.34% (圖9D)，表明JrAMT2 基因一定程度上提高了PS 反應中心的量子比率及產額；對單位PS 反應中心比活性參數分析，結果顯示：與野生型相比，3 個核桃JrAMT2 過表達株系在t=0 時的單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、在t=0 時的單位反應中心傳遞到電子鏈末端的能量(REo/RC)無明顯變化，在t=0 時單位反應中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 時單位反應中心耗散的能量(DIo/RC)、在t=0 時單位反應中心捕獲的用于還原QA 的能量(TRo/RC)顯著下降，分別為36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2 基因一定程度提高了核桃葉片反應中心活性和用于電子傳遞的能量份額，增強了電子傳遞能力(圖9E)；對單位受光截面比活性參數分析，結果顯示：與野生型相比，3 個核桃JrAMT2 過表達株系在t=tFM(暗適應后達到最大熒光強度時間點)時的單位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)無明顯變化，在t=tFM時單位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM時單位受光截面捕獲的用于還原QA 的能量(TRo/CSm)、在t=tFM時單位受光截面捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/CSm)、在t=tFM時單位受光截面傳遞到電子鏈末端的能量(REo/CSm)上升，分別上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(圖9F)，表明JrAMT2 基因一定程度提高核桃葉片單位受光截面的電子傳遞的份額及電子傳遞效率。綜上所述，JrAMT2 基因過表達促進核桃的光合作用。

3 討論

氮素作為植物生長發育必不可少的營養元素，是核酸、蛋白質、酶、葉綠素、植物激素等的重要組成部分[30]。自然界中可供利用的氮素資源有限，作物高產就需要化肥的投入。中國的化肥投入總量逐漸升高，但化肥利用率很低，給自然環境帶來極大的負擔[31-32]，因此合理使用化肥，提高作物對氮素的吸收效率是促進農業生態化發展的重要途徑。銨轉運蛋白基因AMTs 是廣泛存在于動物、植物、微生物中用于運輸的載體蛋白，從分子層面提高植物對氮素的利用具有重要意義。前人研究發現：在擬南芥中，氮饑餓能誘導AtAMT1.1、AtAMT2.1 基因上調表達，并且AtAMT2 基因的表達水平隨著氮饑餓時間的延長而增加[33-34]。在充足或高氮條件下，觀察到擬南芥中AtAMT2.1 及水稻根中OsAMT1.2 基因表達水平仍上調[35-36]，其中氮素形態對AMT 基因轉錄水平的調控也取決于AMT 基因個體和植物物種。

本研究對核桃JrAMT2 過表達植株進行初步的功能驗證，對JrAMT2 基因進行生物信息學分析表明：JrAMT2 蛋白中含有29 個酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)和29 個堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)。該蛋白N 端在膜外，C 端存在膜內，共含有11 個跨膜螺旋結構域，與李暢[36]預測的OsAMT2.1 蛋白結構域特點相同，且與夏金澤等[37]研究的木薯ManihotesculentaMeAMT2.6 基因的蛋白結構相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各種組織中表達，包括根、芽和葉。前人研究發現：杜梨PyrusbetulifoliaPbAMT2 基因在所有器官中均有表達，但在根部表達最高[38]。在擬南芥中發現：AtAMT2.1 基因主要在維管組織中表達，在芽中的表達高于根[15]。本研究對核桃JrAMT2 過表達植株進行綠色熒光觀察發現：JrAMT2 蛋白在核桃苗整株均有表達，且在芽及根莖的維管束中熒光更明亮，說明與擬南芥相同，核桃JrAMT2 蛋白在所有器官中表達，且主要在維管組織中表達。

在植物生長發育重要階段充足的氮素營養供給可以促進其生長發育，增加產量，對植物外施氮素能增加植株株高及葉面積[39]。本研究對核桃JrAMT2 過表達植株生長性狀分析發現：JrAMT2 基因在核桃中過表達對植株生長發育有調控作用，主要表現在過表達植株株高、節間長顯著增加。對過表達植株生根馴化結果顯示：過表達植株生物量顯著增加，根系發達。對核桃JrAMT2 過表達植株移栽馴化，定植后植株生長速率顯著高于野生型，主要表現在節間伸長快，葉面積增加。AMT2 是具有銨吸收功能的銨轉運蛋白，且在維管組織表達，暗示著該基因可能參與銨向木質部的裝載，介導銨在植物中的長距離運輸。研究發現：擬南芥AtAMT2.1 除了對根吸收氮素有一定貢獻外，主要作用于從根部到莖部的運輸[40]。本研究對核桃JrAMT2 過表達植株地上部分和地下部分基因表達測定發現：植株地下部分JrAMT2 基因表達量顯著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加顯著高于地下部分，說明核桃JrAMT2 基因主要在地下部分表達。對核桃JrAMT2 過表達植株對銨態氮和硝態氮吸收測定結果表明：核桃JrAMT2 過表達植株地上部分僅對銨態氮的吸收顯著上調，地下部分對銨態氮與硝態氮的吸收均顯著上調，說明JrAMT2 基因促進植株對銨態氮和硝態氮的吸收，并介導了銨態氮從地下部分到地上部分的運輸。氮素營養還會通過影響葉綠素合成和葉綠素熒光參數的變化來參與光能的利用和調控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1 基因敲除株系的光合特性與野生型相比出現下降趨勢，同樣說明了AMT2 基因對植物光合作用有調控作用[36]。本研究對核桃JrAMT2 過表達植株葉綠素質量分數及葉綠素熒光參數變化的測定結果顯示：JrAMT2 基因顯著提高了核桃的葉綠體表面積與單層細胞表面積比率、葉綠素質量分數及葉綠素熒光參數中葉片放氧復活體活性、量子產額、電子傳遞效率。

4 結論

JrAMT2 作為銨態氮轉運基因，促進核桃對銨態氮和硝態氮的吸收，且介導銨態氮從根部到莖部的運輸，對核桃生長發育、光合作用等有積極作用，對研究核桃高效利用氮素及良種的篩選有重要意義。