多花指甲蘭開花特性與繁育系統研究

鄭棚汭，董春燕，陳之光,，徐 言，葛 紅，楊樹華，趙 鑫，寇亞平，朱晉宇，賈瑞冬，武榮花

（1.河南農業大學 林學院，河南 鄭州 450002；2.青州市亞泰農業科技有限公司，山東 青州 262501；3.中國農業科學院 蔬菜花卉研究所 蔬菜生物育種全國重點實驗室/農業農村部花卉生物學與種質創制重點實驗室 (北方)，北京 100081）

指甲蘭屬Aerides是蘭科Orchidaceae 重要的觀賞植物及藥用植物，屬下有30 種，主要分布在印度、斯里蘭卡、尼泊爾、不丹、緬甸、越南、老撾、泰國、馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞、巴布新幾內亞，及中國南方亞熱帶區域[1]。中國共有多花指甲蘭A.rosea、香花指甲蘭A.odorata、小藍指甲蘭A.orthocentra、扇唇指甲蘭A.flabellate和指甲蘭A.flacata等5 種。指甲蘭屬為單軸分枝類蘭花，與蝴蝶蘭屬Phalaenopsis、萬代蘭屬Vanda、鉆喙蘭屬Rhynchostylis等關系較近，都屬于樹蘭亞科Epidendroideae 萬代蘭族Vandeae 指甲蘭亞族Aeridinae，屬間雜交親和，可培育新品種[2]。據英國皇家園藝學會蘭科登陸機構(RHS)記載，蝴蝶蘭屬與指甲蘭屬的遠緣雜交種已有20 余個。

多花指甲蘭原生境花期為5—7 月，果期為8 月至次年5 月，產于中國廣西、貴州、云南，在不丹、印度、緬甸、老撾和越南也有分布，生于海拔320～1 530 m 的山地林緣或山坡疏生的常綠闊葉林樹干上。被《中國物種紅色名錄》記為極危(CR)；被《中國生物多樣性紅色名錄：高等植物卷》記為瀕危(EN)?；ㄉ勰?、花量大、花型奇特、花香馥郁，是觀賞價值極高的蘭花，也可與蝴蝶蘭進行遠緣雜交，培育有香味的蝴蝶蘭。

目前，對于多花指甲蘭的研究較少，主要在組織培養、非共生萌發技術[3]、功能性成分分析[4]等方面。王清蕓等[5]對其花粉活力和柱頭可授性研究發現：開花6 d 時的花粉活力最強，盛花期柱頭可授性最高，但對其開花進程及繁育系統未進行系統研究。開展花部特征和繁育系統研究，不僅可以深入研究花朵的結構、傳粉方式和媒介種類，還能夠了解植物的生態適應機制，為雜交育種工作提供依據。以往蘭科植物繁育系統研究[6-13]為本研究提供了參考。觀察多花指甲蘭開花進程，并進行繁育系統研究，可為該物種種質資源的保護提供有力保障，也為實現多花指甲蘭的人工繁殖和產業化生產，及遠緣雜交育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與樣地

多花指甲蘭種植于中國農業科學院蔬菜花卉研究所溫室，該溫室春秋季常開天窗；夏季開風機，水簾降溫；冬季有暖氣供暖。室溫保持在26～30 ℃，相對濕度為65%～70%。取200 株生長狀況良好、無病蟲害的5 年生多花指甲蘭進行試驗。

1.2 研究方法

1.2.1 花器官特征和開花進程觀測 隨機選取盛花期全天開放的植株10 株，測量株高、花序長、中萼片、側萼片、花瓣、唇瓣、花序、花朵數及葉片數。按照DAFNI[14]的標準，選取10 株植株進行開花進程觀察，觀察記錄群體水平(群體內第1 朵花至最后1 朵花開放的日期)、單株水平(單株上第1 朵花開放至最后1 朵花凋謝的日期)、單花水平的開花進程(單朵花花瓣從兩側打開至花朵枯黃脫落的日期)。

1.2.2 電鏡掃描和花粉活力測定 選取初花期和末花期的花粉團，經配置的FAA 固定液(100 mL FAA 中含體積分數為50%的乙醇89 mL、冰乙酸6 mL、甲醛5 mL)處理24 h 后，用乙醇溶液按梯度(體積分數分別為70%、80%、90%、95%、100%)脫水15 min，放入加有干燥劑的1.5 mL 離心管中，用CO2臨界點干燥儀(Leica CPD 300)干燥5 h，用雙面膠將干燥后的植物樣品粘在金屬臺上，待觀察部位朝上。離子濺射儀(Hitachi E-1010)對金屬臺噴金、鍍膜。在掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800)下觀察和測量花粉團的表面紋飾、花粉外形態，并拍照。

篩選測定多花指甲蘭花粉活力最適宜的方法：①醋酸洋紅染色法。于每日9:00—10:00 采集多花指甲蘭各生長階段的新鮮花粉，將花粉置于載玻片上，用解剖針將花粉團輕輕搗碎，滴入1～2 滴的醋酸洋紅染液后輕輕將其均勻分散開，蓋上蓋玻片，每次制片3 張。靜置10～15 min后，于倒置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察，選取6 個不同視野進行拍照?；ǚ刍盍姷幕ǚ蹠蝗境杉t色，較淡的顏色被視為活力較弱。②氯化三苯四氮唑(質量濃度為1%的TTC)染色法。參照邊子星[15]的方法：將新鮮的花粉置于2 mL 的試管中，用解剖針將其輕輕搗碎，后滴入1 滴質量濃度為1%的TTC 染色液，黑暗培養24 h。搖晃試管，使得花粉分散均勻，用移液槍吸取含有花粉的TTC 染液，置于載玻片上，用解剖針輕輕將花粉細胞均勻分散開，制片3 張。放至倒置顯微鏡(Olympus BX53)下進行觀察并拍照，選取6 個不同的視野。以花粉細胞被染成紅色為活力較強標準，白色為活力較弱標準。③花粉離體萌發法。參照歐陽英等[16]的方法：以質量濃度為5.000%蔗糖+質量濃度為0.050%硼酸+質量濃度為0.001%氯化鈣+體積分數為5.000%椰汁為液體培養基。將花粉用解剖針取下置于雙面凹載玻片上并散開，用滴管吸取上述培養液滴入含花粉的凹面里，后將載玻片放于墊有3～5 張濕潤濾紙的培養皿中，蓋上蓋子置于組培室(室內溫度25 ℃，相對濕度80%以上)培養48 h 后統計花粉萌發數。以花粉管長度超過花粉直徑的2 倍記為萌發。每階段取3 份樣，制片后隨機選取3 個視野統計萌發數，重復3 次?；ǚ勖劝l率=萌發的花粉數/視野內總花粉數×100%。

1.2.3 柱頭可授性測定 采用聯苯胺-過氧化氫法[V(質量濃度為1%聯苯胺)∶V(體積分數為3%過氧化氫)∶V(水)=4∶11∶22]測定各階段柱頭的可授性。用體視顯微鏡(Olympus SZ)觀察并拍照。柱頭周圍反應液伴有大量的氣泡產生表示柱頭具有可授性，氣泡越多表示可授性越強。

1.2.4 花粉組織化學 隨機采取多花指甲蘭成熟的花粉團，將其放置載玻片上碾碎，滴入碘-碘化鉀浸染15 min，放置在倒置顯微鏡(Olympus BX53)下觀察，花粉若經碘-碘化鉀處理后顯示紅色說明花粉有脂質存在，處理后若呈藍色或黑色則說明花粉有淀粉存在。

1.2.5 雜交指數(OCI)估算 根據DAFNI[14]的標準計算OCI 值?；ǘ渲睆剑? mm 記為0；1～2 mm 記為1；2～6 mm 記為2；＞6 mm 則記為3?；ㄋ幣c柱頭的空間位置在同一高度記為0，空間分離記為1?；ㄋ庨_裂時間和柱頭可授粉期同步或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1。三者之和為OCI。繁育系統的評判標準：OCI=0，為閉花受精；OCI=1，為專性自交；OCI=3，為自交親和，有時需要傳粉者；OCI≥4，為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

1.2.6 人工控制授粉 隨機選取初花Ⅱ期花朵進行人工控制授粉試驗，設置6 個處理(不去雄不套袋不授粉、不去雄套袋不授粉、去雄不授粉、人工自花授粉、人工同株異花授粉、人工異株授粉)，檢測多花指甲蘭傳粉方式。每個處理重復3 次，共計20～30 朵花。授粉30 d 后統計結實率。結實率＝結實數/授粉數×100%。

1.2.7 數據分析 利用Excel 2016 進行表格繪制，SPSS 25.0 進行數據處理、標準誤計算及顯著性分析(單因素方差分析、鄧肯法)，Photoshop 2021 進行圖片制作。

2 結果和分析

2.1 花器官特征

由圖1 可見：多花指甲蘭有1～4 個花梗，其總狀花序長10～30 cm，花序形態似“狐尾”。莖粗壯，長約5～20 cm，花序葉腋生，花序軸較長，密生數十至近百朵花；花由1 個中萼片、2 個側萼片、2 個花瓣和1 個唇瓣組成。子房棒狀帶縱棱，花梗和子房白色帶淡紫色暈；中萼片和側萼片呈卵圓形，花瓣披針形，花瓣與中萼片有粉紫色斑點。唇瓣上密布紫紅色斑點，邊緣稍具不整齊的鋸齒。表1 為多花指甲蘭株高、最大葉長寬、花序長、中萼片和側萼片的長寬、花瓣長寬及唇瓣的橫縱徑等花部表型性狀。

表1 多花指甲蘭表型性狀Table 1 Phenotype of the A.rosea

圖1 多花指甲蘭的花器官特征Figure 1 Floral syndrome of A.rosea

通過電子掃描顯微鏡觀察(圖2)可見：多花指甲蘭在開花1～2 d 花粉團比末花期花粉團更加飽滿(圖2A 和B)?；ǚ蹐F表面不平整，有極多凸起，由數萬個花粉細胞緊密聚集而形成(圖2C)，花粉粒類球形(圖2D)，直徑約200 μm。

圖2 多花指甲蘭花粉電鏡掃描Figure 2 Floral syndrome of A.rosea

2.2 開花進程

溫室內，多花指甲蘭在5 月底零星開放，群體花期為5—7 月，單花花期7～10 d，單株花期15 d?？偁罨ㄐ?，花序的花朵從下至上開放，花序上第1 朵花開放至整個花序的花全部開放約需10 d。按DAFNI[14]的標準將多花指甲蘭的發育分為7 個階段(圖3)。①花蕾Ⅰ期(開花前4～5 d)?；ɡ傥撮_放，呈不規則橢圓形，中萼片和唇瓣緊閉，可見距。②花蕾Ⅱ期(開花前1～3 d)?；ɡ匍_始開放，中萼片和唇瓣開始分離，有紫色的花瓣露出。③初花Ⅰ期(開花1～2 d)?；ɡ匍_始開放，唇瓣與花瓣分離，橫徑距離1.5 cm，柱頭有黏液分泌。④初花Ⅱ期(開花3～4 d)?；ɡ俅蟛糠珠_放，萼片微微卷曲，唇瓣向下豎起，花瓣和唇瓣縱徑距離大于3.0 cm，能明顯看到合蕊柱，柱頭黏液量分泌達到最高。⑤盛花期(開花5～6 d)?；ǘ渫耆_放，花瓣完全打開，花粉團由鵝黃變成深黃。⑥末花期(開花7～8 d)?；ǘ淇菸?，萼片卷曲，唇瓣凹陷，萼片和唇瓣的顏色變褐色。⑦凋謝期(開花9～10 d)?；ǘ渫耆ニ?，整體呈現褐色，花粉團變硬，花朵枯萎。

圖3 不同發育階段的多花指甲蘭Figure 3 Different development stages of A.rosea

2.3 花粉活力與柱頭可授性

由圖4 可知：相對于醋酸洋紅染色法，TTC 染色法可明顯區分有活性花粉，且TTC 染色法所測得的結果略高于醋酸洋紅染液測定的活力，花粉離體萌發法不能準確測定多花指甲蘭花粉活力，其花粉管雜亂無章不易查數。因此選用TTC 染色法測定多花指甲蘭各時期花粉活力，由表2 可以看出在盛花期花粉活力最高，可達74.57%，其次為初花Ⅱ期。

表2 花粉活力與柱頭可授性檢測Table 2 Test of pollen viability and stigma acceptability

圖4 不同方法測定花粉活力Figure 4 Pollen viability determined by different methods

在對柱頭可授性進行檢測時發現(圖5)：在初花Ⅱ期和盛花期時柱頭周圍有大量的氣泡產生，說明此階段的可授性最強。故對多花指甲蘭進行人工授粉時，應選擇初花Ⅱ期或盛花期，盛花期授粉效率最高。授粉時，先將花粉用鑷子取出，此時花粉團具有很強的黏性，易黏在柱頭腔內，授粉成功后，通常在1 周后即可看到子房開始膨大。

圖5 不同時期柱頭可授性Figure 5 Stigma accessibility test

2.4 花粉組織學

經碘-碘化鉀對多花指甲蘭的花粉進行染色后，在顯微鏡下可看到花粉會被染成紅色(圖6)，表明多花指甲蘭花粉中淀粉較少，脂質較多。以往研究表明[17]：蘭科植物的花粉含有脂類，一般以花蜜和油類較多[18]，而淀粉并不是經常存在，這與系統發育有關。有推斷，脂質花粉營養豐富，更容易吸引昆蟲進行傳粉，而淀粉花粉有利于風媒傳粉。

圖6 碘-碘化鉀花粉組織染色Figure 6 Staining of iodide-potassium iodide pollen tissue

2.5 雜交指數(OCI)

多花指甲蘭花朵直徑為2.5～3.6 cm，大于6 mm，分值為3；花粉成熟時聚成典型花粉團位于柱頭上方，兩者存在一定距離，無法接觸，且花粉與柱頭腔間的蕊喙發育，阻止自交授粉發生，分值為1；花粉和柱頭同步成熟，分值為0。多花指甲蘭的OCI 為4，其繁育系統以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。

2.6 人工控制授粉

成功授粉后的花朵，5 d 后可見柱頭微微膨大，花瓣、唇瓣與萼片開始枯萎脫落；10 d 左右子房膨大。授粉未成功的花朵在開花7 d 左右花瓣開始枯黃，萎縮，約10 d 后連同子房一起脫落。授粉成功的花朵比未授粉的花朵先枯萎。授粉30 d 后統計果莢結實情況(表3)可知：多花指甲蘭無論是否去雄、套袋，不進行人工授粉的結實率均為0，而人工自花授粉、人工同株異花授粉、人工異株授粉的結實率分別為85.71%、88.00%、84.00%，無顯著差異。這表明多花指甲蘭需要借助傳粉媒介進行傳粉，不存在自然自花授粉和無融合生殖現象。

表3 不同處理下結實率Table 3 Percentage of fertile fruit in different pollination treatments

3 討論

多花指甲蘭有2 枚側萼片、1 枚中萼片、2 枚花瓣和1 枚唇瓣，具有較高的觀賞價值，是蝴蝶蘭屬不可多得的香花遠緣雜交親本。多花指甲蘭的花期在5—7 月，總狀花序，開花時有香味，花自下而上循序開放，但時間差別不大。單株有1～4 個花梗，數十朵花。單朵花自然狀態下花期為7～10 d，整株花期約15 d。而王清蕓等[5]對種植于云南省的多花指甲蘭觀察，發現其整株花期僅有10 d，說明溫室栽培條件相比于露地條件，更適合多花指甲蘭生長，可延長其花期。

花粉活力是決定授粉成功與否的關鍵，花粉活力的高低及柱頭可授性的強弱與花朵開放時間有關。多花指甲蘭的花粉為四分體結構，花粉進行離體萌發培養時，花粉團在培養液中自然散開，四合花粉粒均保持完整的膜結構，能夠萌發，但經過物理碾壓，花粉粒的膜結構易遭到破壞，對花粉粒的萌發造成一定的影響，從而加大記數時的誤差，所以當嘗試用花粉萌發法測定花粉活性，統計數據結果活性偏低，因此本研究并未采用花粉離體萌發法測定數據。本研究也比較了TTC 和醋酸洋紅2 種染色液對多花指甲蘭有活力花粉的染色狀況。結果表明：2 種染色液測定的花粉活力均隨著花朵開放時間延長，呈先上升后下降的趨勢，與其他蘭花結果一致[12,19]。但是TTC 所測花粉活力略高于醋酸洋紅，可見在溫室條件下栽培的多花指甲蘭更適合用TTC 染色法測定花粉活力。采用聯苯胺-過氧化氫法是檢測柱頭可授性較為簡單常用的方法[20-22]，多花指甲蘭同樣適用此方法。開花時間的長短影響著柱頭可授性的強弱，多花指甲蘭在初花Ⅱ期和盛花期可授性達到最高強度，之后又逐步降低。多花指甲蘭花粉與柱頭同熟，在初花Ⅱ期和盛花期花粉活力與柱頭的可授性都較強，因此，此時期開展授粉工作成功率最高。

植物的繁育系統是判斷其種群能否延續的重要體系標準，通常是指對直接影響后代遺傳組成的所有有性特征進行研究，人工授粉是最基本的研究方法。在對多花指甲蘭進行人工控制授粉試驗中，不去雄且不套袋、不去雄且套袋以及去雄不授粉的結實率均為0，但是人工自花授粉、人工同株異花授粉及人工異株授粉后，都有80%以上結實率。這些結果皆表明多花指甲蘭有高度的自交和異交的能力。根據DANFI[14]的標準所得出的雜交指數也表明：多花指甲蘭為自交和異交的混合交配模式，需要特定的傳粉者。根據花粉組織化學染色結果表明：多花指甲蘭花粉脂質含量較多，初步判斷為蟲媒傳粉，但仍需后期野外驗證?；诙嗷ㄖ讣滋m繁育系統研究的結果，本研究在初花Ⅱ期和盛花期進行人工授粉，已經獲得大量種苗。今后將在自然條件下對其進行人工授粉，提高繁殖效率，從而最大限度地保護多花指甲蘭的種質資源。

4 結論

多花指甲蘭為總狀花序，單花花期7～10 d，群體花期為5 月初至7 月底，開放時有香味。雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(開花5～6 d)花粉活力與柱頭可授性均達到最強，花粉活力高達74.57%。多花指甲蘭花粉為近圓形四合花粉，主要由脂質組成。OCI 為4，多花指甲蘭不存在無融合生殖現象，繁育系統是需要傳粉者傳粉的自交和異交混合交配模式。