多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利敏感基線的建立及抗藥性監測

溫智浩，朱廣雪，孫炳學，周榮佳，謝學文，柴阿麗，李磊，范騰飛，李寶聚，石延霞

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

多主棒孢菌（Corynesporacassiicola）引起的黃瓜棒孢葉斑病是我國黃瓜生產上的重要葉部病害，造成了嚴重的經濟損失（于淑晶 等，2014；王泉城 等，2023）。多主棒孢菌寄主范圍廣泛，可侵染53 科380 屬530 多種植物（李寶聚 等，2012）。目前，黃瓜棒孢葉斑病在我國大面積發生，已遍及山東、河北、遼寧等地區，初夏和冬春季節發生尤為嚴重，田間發病率一般為10%～25%，嚴重時可達60%～70%，甚至100%，對黃瓜產業發展構成嚴重威脅，已成為設施黃瓜主要真菌性病害之一（李寶聚 等，2008；李長松 等，2009；楊雙娟 等，2012）。

化學殺菌劑是目前防治黃瓜棒孢葉斑病的主要方法，我國用于防治該病害的化學殺菌劑主要有琥珀酸脫氫酶抑制劑（succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs），如啶酰菌胺、噻呋酰胺、吡噻菌胺；苯醌外部抑制劑（quinone outside inhibitors，QoIs），如吡唑醚菌酯、苯醚菌酯、啶氧菌酯；以及14α-脫甲基化抑制劑（14α-demethylation inhibitors，DMIs），如苯醚甲環唑、戊唑醇、丙環唑等（李桂香 等，2022）。

乙霉威和腐霉利均為傳統殺菌劑，在設施黃瓜上的應用時間長、范圍廣。乙霉威是日本住友公司于1984 年開發的一種苯氨基甲酸酯類殺菌劑，作用機理為藥劑與真菌細胞內的β-微管蛋白相結合，進而影響菌體細胞的正常有絲分裂，使菌體死亡，其與多菌靈殺菌劑具有負交互抗性（謝學文等，2020）。腐霉利是德國巴斯夫公司開發的一種二甲酰亞胺類觸殺型殺菌劑，能顯著抑制孢子萌發及菌絲生長，廣泛應用于防治多種蔬菜病害（鄭遠，2020）。

乙霉威和腐霉利雖然在我國并未登記用于防治黃瓜棒孢葉斑病，但已經成為生產中防治黃瓜灰霉病的常用藥劑，且黃瓜灰霉病與黃瓜棒孢葉斑病在田間發生存在時間交集，由于這2 種殺菌劑長期在黃瓜上的應用，在防治黃瓜灰霉病的過程中也間接導致了乙霉威和腐霉利對多主棒孢菌的藥劑選擇壓，出現了大量抗性菌株，產生抗性風險（詹家綏等，2014；Sabine & Yigal，2016）。因此，建立多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的敏感基線，監測其田間抗性頻率和抗性狀況，可為黃瓜生產中的科學合理應用殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 多主棒孢菌 2017—2021 年，中國農業科學院蔬菜花卉研究所蔬菜病害防控創新團隊從山東省濟南市、壽光市、臨沂市、聊城市和遼寧省大連市、沈陽市、鞍山市、營口市、朝陽市采集黃瓜棒孢葉斑病病樣，經分離純化共獲得828 株多主棒孢菌（表1）。所有菌株驗證具有致病力后，轉接在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面上，25%甘油凍存管保存，備用。

表1 供試多主棒孢菌采集時間及地點

1.1.2 藥劑及試劑 95%乙霉威（Diethofencarb）原藥，購自山東億嘉農化有限公司；99%腐霉利（Procymidone）原藥，購自山東力發生物科技有限公司。采用丙酮溶解，配成10 000 μg · mL-1的母液。

1.1.3 培養基 菌株的分離、保存和對殺菌劑的敏感性測定均使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化 供試多主棒孢菌經單孢純化后編號，保存于PDA 斜面上，存放于4 ℃冰箱，以備后續使用。

1.2.2 多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的敏感性測定 采用菌絲生長速率法。將供試菌株接種至PDA平板上，25 ℃培養5 d，使用打孔器沿菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌絲面向下分別接種至乙霉威濃度為0、0.2、0.4、0.8、2.0 μg · mL-1的PDA含藥平板和腐霉利濃度為0、0.1、1.0、1.5、10.0、100.0 μg · mL-1的PDA 含藥平板中央，每處理3 次重復，以接種至不含藥PDA 平板為空白對照，以接種至等量丙酮溶液為溶劑對照，置于25 ℃條件下培養4 d。待空白對照平板菌落直徑接近培養皿邊緣時，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率（%）（楊名佳 等，2021）。

菌絲生長抑制率 = （對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）× 100%

利用SPSS 軟件對藥劑濃度的對數（x）和菌絲生長抑制率的幾率值（y）進行線性回歸分析，建立毒力回歸方程，計算乙霉威和腐霉利對各菌株的抑制中濃度（EC50）。根據菌株對乙霉威和腐霉利的敏感性頻率分布，觀察其是否呈正態分布，以此來建立敏感基線。

1.2.3 乙霉威和腐霉利對多主棒孢菌抗性區分劑量的確定及田間抗藥性監測 對不同濃度乙霉威和腐霉利處理的菌絲生長數據進行分析得出：當乙霉威濃度為0.4 μg · mL-1時，敏感菌株的菌絲生長抑制率大于50%，抗性菌株菌絲生長不受抑制；當腐霉利濃度為1.5 μg · mL-1時，敏感菌株的菌絲生長抑制率大于40%，抗性菌株菌絲生長不受抑制。因此，選擇0.4 μg · mL-1作為多主棒孢菌對乙霉威抗性水平的區分劑量，1.5 μg · mL-1作為多主棒孢菌對腐霉利抗性水平的區分劑量（Hideo et al.，2011；陳杰，2015）。采用區分劑量法，測定2017—2021 年采集的828 株多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的抗藥性。將多主棒孢菌5 mm 菌餅接種于含有乙霉威和腐霉利區分劑量的PDA 平板中央，每處理3 次重復，以接種至不含藥劑的PDA 平板為對照，置于25 ℃培養4 d 后進行調查，分別計算敏感菌株和抗性菌株的發生頻率（裴龍飛 等，2016）。

抗性頻率 = 抗性菌株數/總菌株數× 100%

2 結果與分析

2.1 多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的敏感基線

2.1.1 多主棒孢菌對乙霉威的敏感基線 通過測定828 株多主棒孢菌對乙霉威的EC50值，其中最小值為0.09 μg · mL-1。選取104 株多主棒孢菌進行敏感基線建立，該104 株菌的EC50值范圍在0.09～0.44 μg · mL-1之間（圖1），多主棒孢菌對乙霉威的敏感性頻率整體呈正態曲線分布，因此可將該104 株多主棒孢菌群體的平均EC50值（0.22 ± 0.06）μg ·mL-1作為多主棒孢菌對乙霉威的敏感基線（圖2）。2.1.2 多主棒孢菌對腐霉利的敏感基線 通過測定828 株多主棒孢菌對腐霉利的EC50值，其中最小為0.15 μg · mL-1。選取254 株對腐霉利的敏感菌株，其EC50值范圍在0.15～4.73 μg · mL-1（圖3），多主棒孢菌對腐霉利的敏感性頻率總體呈正態曲線分布，因此可將該群體的平均EC50值（2.75 ±0.91）μg · mL-1作為多主棒孢菌對腐霉利的敏感基線（圖4）。

圖1 104 株多主棒孢菌對乙霉威的敏感性分布

圖2 多主棒孢菌對乙霉威的敏感基線

圖4 多主棒孢菌對腐霉利的敏感基線

2.2 多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的抗藥性監測

采用區分劑量法對多主棒孢菌所有供試菌株進行抗性水平測定，評價抗性水平。結果表明，多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的抗性發展迅速。2017年，山東省和遼寧省多主棒孢菌對乙霉威的抗性頻率分別為58.06%和67.44%，2021 年則分別達到了91.30%和82.14%（表2）；同時山東省和遼寧省多主棒孢菌對腐霉利的抗性頻率2017 年為43.55%和53.49%，2021 年達到了78.99%和83.33%（表3）。表明在山東省和遼寧省，多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利已產生抗性，抗性頻率呈逐年上升趨勢。

表2 山東省和遼寧省多主棒孢菌對乙霉威的抗性頻率

表3 山東省和遼寧省多主棒孢菌對腐霉利的抗性頻率

3 結論與討論

黃瓜棒孢葉斑病是一種世界性的真菌病害，在美國、日本、韓國、新西蘭等地均有報道（Dixon et al.，2009；朱廣雪 等；2023）。設施蔬菜生產過程中長期的高溫高濕環境，為病原菌的積累和病害的暴發提供了良好環境條件（Kwon et al.，2003）。目前防治該病害主要以化學殺菌劑防治為主，隨著化學殺菌劑長期、大量、高頻率地使用，田間病原菌出現了不同程度的抗藥性，使得化學藥劑田間防效大幅度下降（Miyamoto et al.，2009，2010）。蔬菜病害防控創新團隊前期工作發現，黃瓜棒孢葉斑病也對啶酰菌胺、多菌靈等多種殺菌劑產生了不同程度的抗藥性（朱發娣，2018；Zhu et al.，2019）。由于田間應用乙霉威和腐霉利防治黃瓜灰霉病時，這兩種藥劑對同期發生的黃瓜棒孢葉斑病可能造成選擇壓，因此監測多主棒孢菌對這兩種殺菌劑的抗性風險，對于預防抗藥性產生及田間合理用藥尤為重要（裴艷剛 等，2021）。

建立病原菌對殺菌劑的敏感基線及抗性評估有助于明晰化學殺菌劑防效的高低，也為合理使用殺菌劑提供理論支撐（毛玉帥 等，2022）。目前，已經通過腐霉利對蘋果輪紋病菌和油菜菌核病菌的抑菌率測定結果，建立了蘋果輪紋病菌和油菜菌核病菌對腐霉利的敏感基線，分別為（1.289 1 ± 0.060 0）μg · mL-1和（0.198 1 ± 0.022 0）μg · mL-1（曹敏娟，2008；顧乃圖 等，2016）。本試驗采用菌絲生長速率法測定了多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的敏感性，兩者敏感菌株的頻率分布圖均呈正態曲線分布，可將（0.22 ± 0.06）μg · mL-1和（2.75 ± 0.91）μg · mL-1作為多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的敏感基線。分別以0.4 μg · mL-1和1.5 μg · mL-1作為多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利抗性水平的區分劑量，監測了2017—2021 年山東省和遼寧省黃瓜生產大棚采集的多主棒孢菌對這兩種藥劑的抗藥性。結果表明：山東省和遼寧省多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的抗性發展迅速，其抗性頻率常年處于高水平，對乙霉威和腐霉利的抗性菌株已成優勢群體。本研究在國內率先建立了多主棒孢菌對乙霉威和腐霉利的敏感基線，為黃瓜棒孢葉斑病的抗藥性風險評估及合理使用藥劑奠定了基礎。

已有研究表明，我國多個省份其他病原菌對乙霉威和腐霉利產生了較強的抗藥性。例如，在山西省黃瓜種植產區，由于乙霉威和腐霉利的過度施用，導致黃瓜灰霉病菌對乙霉威和腐霉利產生了抗藥性，且抗性頻率分別達到84.00%和81.36%（趙曉軍 等，2010，2011）；在云南省彌勒葡萄產區，葡萄灰霉病菌對腐霉利、乙霉威和多菌靈均產生了嚴重的抗藥性，不僅抗性頻率高，而且出現了雙抗和多抗菌株（普繼雄 等，2021）。本試驗對2017—2021 年山東和遼寧地區采集的多主棒孢菌進行抗性評估，發現這兩個地區多主棒孢菌已對乙霉威和腐霉利產生抗性，抗性頻率逐年增加。由此可見，隨著化學殺菌劑的長期施用，病原菌對多種殺菌劑產生了普遍的抗藥性。生產中應盡量少用或不施用單一的化學殺菌劑，可與其他作用機理的殺菌劑交替使用，并與農業防治、生物防治和物理防治相結合，多維控制病原菌的蔓延與發展，以延緩黃瓜棒孢葉斑病的抗藥性發展，提高田間防效。