SNHG3靶向miR-532逆轉上皮間質轉化對宮頸癌細胞侵襲、遷移及DPP耐藥的研究*

曾卉 蒲騰達 蘇炳鳳 張程圓 樊俐俐

(海南省腫瘤醫院婦科,海南 ?？?570312)

宮頸癌是女性臨床常見惡性腫瘤,具有高發病率及高死亡率的特點[1]。導致宮頸癌患者死亡的主要原因除了治療失敗外,就是轉移和復發,而癌細胞的侵襲及遷移是腫瘤發生轉移的核心步驟,因此探討細胞侵襲及遷移機制,抑制其發生、發展一直是臨床工作的重點及難點[2]。癌細胞的上皮間質轉化可使癌細胞失去上皮細胞典型形態,并使細胞的基因表達譜發生變化,從而為細胞侵襲及轉移提供有利條件,進而使癌細胞易于定植、增殖,并具有自我更新、耐受放療及抗化療藥的能力,最終引起腫瘤發生遠處轉移,因此如何逆上皮間質轉化是目前醫學領域關注的焦點之一[3]。目前臨床對于宮頸癌的治療主要采取放化療治療,而順鉑(DPP)是同步放化療的首選藥物,但隨著其不斷使用,DPP的耐藥性逐漸顯露,已經成為化療失敗及預后不良的主要原因,因此闡明宮頸癌DPP耐藥機制就顯得尤為重要,這將有利于開發新穎的治療策略,提高治療效果[4]。隨著測序技術的進步以及人類基因組計劃的順利完成,越來越多的研究證實,非編碼RNA在包括宮頸癌在內的多種癌癥中發揮重要作用,如長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,Lnc RNA)可參與調控亞細胞結構、基因表達、蛋白復合物的穩定等多種生物進程,從而影響腫瘤的發生、發展、侵襲、遷移、耐藥等過程;微小RNA(mirco RNAs,miR)可起到轉錄因子、基因及蛋白水平的分子調控作用,從而影響細胞的增殖、侵襲、遷移、上皮間質轉化等過程;此外,Lnc RNA還可作為競爭性內源性RNA靶向結合miR,從而調控其靶基因的表達,進而共同影響腫瘤的發生、發展[5-6]。SNHG3和miR-532是近年來發現的與宮頸癌密切相關的非編碼RNA,其均在宮頸癌的發生、發展中發揮著重要作用[7-8]。且starBase 數據庫預測顯示,SNHG3 和miR-532之間存在結合位點,因此本文就SNHG3靶向miR-532逆轉上皮間質轉化對宮頸癌細胞侵襲、遷移及DPP耐藥進行研究探討,以期為臨床治療宮頸癌提供新的靶點及依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HUCEC正常宮頸上皮細胞(貨號:XY1481,上海烜雅有限公司);HeLa宮頸癌細胞(貨號:HT-X1651,深圳豪地華拓有限公司);AV3宮頸癌細胞(貨號:CL-318h,武漢賽奧斯有限公司);MS751宮頸癌細胞(貨號:MS751,上海賽百慷股份有限公司);WISH宮頸癌細胞(貨號:SY4813,上海酶研有限公司);熒光實時定量PCR儀(型號:CFX96,上海土森視覺有限公司);PowerPacTM基礎電泳儀(型號:164-5051,美國 Bio-Rad公司);紫外分光光度計(型號:NP80,無錫萊弗思有限公司);實時Real-Time PCR 試劑盒(貨號:7000,美國 ABI 公司);Trizol試劑(貨號:Invitrogen,上海文韌有限公司);逆轉錄試劑盒(貨號:RT3,上海海方有限公司);SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(貨號:KGP113,江蘇凱基有限公司);質粒大量提取試劑盒(貨號:D1130,北京索萊寶有限公司);脂質體2000(貨號:AL7800-0.75 mL,上海吉至有限公司);E-cadherin抗體(貨號:10204-T52,北京義翹神州有限公司);Vimentin抗體(貨號:100254-T08,北京義翹神州有限公司);GAPDH抗體(貨號:FNab03343,武漢菲恩生物科技有限公司);ECL檢測試劑盒(貨號:CDLG-4911,武漢純度生物科技有限公司);結晶紫(貨號:G1061-500,北京索萊寶有限公司);CCK-8試劑(貨號:SH-1558,北京凱詩源有限公司);二甲基亞砜(貨號:D2650,上海睿安有限公司)。

1.2 細胞培養 正常宮頸上皮細胞及宮頸癌細胞,在5% CO2、 37 ℃的條件,置于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養箱培養,培養至細胞貼壁到達80%時進行傳代培養,培養2～3代,收集細胞進行后續實驗。

1.3 Real-time PCR法檢測mRNA相對表達 嚴格按照實時Real-Time PCR試劑盒步驟檢測HUCEC正常宮頸上皮細胞和4種宮頸癌細胞系中的SNHG3及miR-532 mRNA表達,分別取待檢測細胞,消化、離心后,將其以密度1×106/mL接種于6孔板中,PBS洗滌3次,于冰上加入1 mL裂解液,搖勻后,用Trizol 試劑提取總RNA,提取完成后用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度,用電泳儀檢測其完整性,用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄,轉錄完成后將cDNA、熒光染料、引物合無酶水按照說明書比例混合,然后利用熒光實時定量PCR儀進行 PCR擴增,在95 ℃條件下預變性10 min,變性15 s,70 ℃延伸1 min,60 ℃退火60 s,此循環進行40次,收集SNHG3及miR-532熒光信號,反應結束后進行數據分析,以同一樣本中的U6的Ct值作為內參,采用 2-ΔΔCt計算其基因相對表達量。引物序列,見表1。

表1 SNHG3及miR-532引物序列Table 1 Primer sequences of SNHG3 and miR-532

1.4 實驗分組 取HeLa細胞將其分為宮頸癌細胞(CC)組、宮頸癌細胞+SNHG3-NC(SN)組、宮頸癌細胞+SNHG3激動劑(SM)組、宮頸癌細胞+SNHG3抑制劑(SI)組、宮頸癌細胞+miR-532-NC(MN)組、宮頸癌細胞+miR-532抑制劑(MI)組、宮頸癌細胞+miR-532激動劑(MM)組、宮頸癌細胞+SNHG3抑制劑+miR-532激動劑(IM)組。

1.5 細胞轉染 取各組生長狀態良好且密度為40%～60%的細胞,消化、離心后接種于6孔板中,取不含血清的DMEM培養基,將按照質粒大量提取試劑盒說明書提取的相關分組目的基因質粒DNA與脂質體分別加入其中,冰上靜置5 min,再分別取等量目的基因加入脂質體中配置成轉染液,室溫靜置5 min,將轉染液按分組依次加入孔板,每孔加0.3 mL,并加入含10%胎牛血清的培養基使總體積到達1 mL,輕輕混勻后置于孵箱,6 h后換全培養基,然后轉染48 h后,收集各組細胞用于后續實驗。

1.6 免疫印跡法檢測上皮間質轉化相關蛋白表達 取轉染后各組細胞,進行消化、離心,棄掉上清液后重懸細胞,以密度為1×106個/mL接種于6孔板中,培養24 h,PBS洗滌3次,RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,以8%分離膠,5%濃縮膠的條件進行SDS-PAGE 電泳分離,電泳完成后,取浸泡在無水甲醇中激活的PVDF 膜進行轉膜1.5 h,5%的脫脂奶粉封閉2 h,加入稀釋的E-cadherin、Vimentin一抗(1∶1000),4 ℃搖床振蕩孵育過夜后洗膜;加入辣根過氧化氫酶標記的二抗(1∶5000),37 ℃輕搖室溫孵育 2 h;洗膜后,用ECL熒光試劑盒發光,Gene Sys 軟件自動曝光后,計算與GAPDH比值求得E-cadherin、Vimentin蛋白的相對表達含量。

1.7 小室法檢測細胞侵襲及遷移 取各組轉染后的細胞,以無血清培養液將細胞饑餓12 h,進行消化、離心,棄掉上清液后重懸細胞,調整密度為8×104個/mL,進行侵襲實驗,首先將每個小室水化并加入35 μL基質膠進行鋪膠,37 ℃孵育1 h,上層加入200 μL單細胞懸液,下層加入600 μL含20%血清的培養液,常規培養48 h,PBS洗滌2次后,4%多聚甲醛15 min,PBS洗滌2次,向每孔加入0.1%的結晶紫染色15 min,棉簽拭去未穿透至對側的細胞,顯微鏡下拍照并計算細胞數,調整密度為4×104個/mL,進行遷移實驗,步驟與侵襲實驗相同,只是不做鋪膠處理。

1.8 CCK-8法檢測DPP耐藥 取轉染后的各組細胞進行消化、離心,棄掉上清液后重懸細胞,以密度為5×103個/mL接種于96孔板中,常規培養24 h,待細胞貼壁后,向每孔加入5 μmol /L的DPP,同時設置無細胞的空白對照組、加入二甲基亞砜的溶劑對照組,培養48 h時,向每孔加入10 μL 8%的CCK-8,避光孵育2 h,用酶標儀在450 nm處測量每孔吸光度(A),根據[1-(加藥組A-空白組A)/(溶劑對照組A-空白組A)]×100%,計算DPP抑制率。

1.9 雙熒光素酶報告基因檢測 利用點突變技術擴增出含有Hind Ⅲ和 SpeⅠ酶切位點的miR-532突變位點3′ UTR后,分別將野生型和突變型miR-532 3′UTR插LipofectamineTM2000載體,然后取宮頸癌細胞將其接種于6孔板中,參照轉染試劑說明書將構建好的miR-532 -3′-UTR-WT和miR-532 -3′-UTR-MUT質粒分別與SNHG3-NC和SNHG3共轉染至細胞,轉染48 h后,嚴格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測操作步驟檢測各組細胞熒光素酶活性。

2 結果

2.1 HUCEC和4種宮頸癌細胞系中SNHG3及miR-532 mRNA的表達 宮頸癌細胞系中的SNHG3 mRNA表達量顯著高于正常宮頸癌上皮細胞系HUCEC(P<0.05),miR-532 mRNA表達量顯著低于正常宮頸癌上皮細胞系HUCEC(P<0.05),其中HeLa的SNHG3、miR-532 mRNA值變化最大(P<0.05),因此選取其作為此次實驗細胞,見圖1。

圖1 HUCEC和4種宮頸癌細胞系中SNHG3及miR-532 mRNA的表達Figure 1 mRNA expression of SNHG3 and miR-532 in HUCEC and four cervical cancer cell lines注:與HUCEC相比,①P<0.05;與HeLa相比,②P<0.05。

2.2 SNHG3對宮頸癌癌細胞上皮間質轉化、侵襲、遷移、DPP耐藥的作用 CC組與SN組相比,細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量、DPP抑制率差異無統計學意義(P>0.05);與SN組相比,SM組E-cadherin蛋白表達、DPP抑制率明顯降低,Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量明顯升高(均P<0.05);與SM組相比,SI組E-cadherin蛋白表達、DPP抑制率明顯升高,Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量明顯降低(均P<0.05)。見表2、圖 2、圖3。

圖2 各組細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達電泳圖Figure 2 Electrophoretic diagram of E-cadherin and Vimentin protein expression in each group

圖3 各組細胞侵襲及遷移圖(結晶紫,200×)Figure 3 Cell invasion and migration in each group

表2 4組宮頸癌細胞上皮間質轉化、侵襲、遷移、DPP耐藥結果比較Table 2 Comparison of the results of epithelial-mesenchymal transition, invasion, migration and DPP resistance of cervical cancer cells in the four groups

2.3 miR-532對宮頸癌癌細胞上皮間質轉化、侵襲、遷移、DPP耐藥的作用 CC組與MN組相比,細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量、DPP抑制率差異無統計學意義(P>0.05);與MN組相比,MI組E-cadherin蛋白表達、DPP抑制率明顯降低,Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量明顯升高(均P<0.05);與MI組相比,MM組E-cadherin蛋白表達、DPP抑制率明顯升高,Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量明顯降低(均P<0.05)。見表3、圖4、圖5。

圖4 各組細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達電泳圖Figure 4 Electrophoretic diagram of E-cadherin and Vimentin protein expression in each group

圖5 各組細胞侵襲及遷移圖(結晶紫,200×)Figure 5 Cell invasion and migration in each group

表3 4組宮頸癌細胞上皮間質轉化、侵襲、遷移及DPP耐藥結果比較Table 3 Comparison of epithelial mesenchymal transition, invasion, migration and DPP resistance of cervical cancer cells among the four groups

2.4 SNHG3聯合miR-532對宮頸癌癌細胞上皮間質轉化、侵襲、遷移、DPP耐藥的作用 SI組與MM組相比,細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量、DPP抑制率差異無統計學意義(P>0.05);與MM組相比,IM組E-cadherin蛋白表達、DPP抑制率明顯升高,Vimentin蛋白表達、侵襲及遷移數量明顯降低(均P<0.05)。見表4、圖6、圖7。

圖6 各組細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達電泳圖Figure 6 Electrophoretic diagram of E-cadherin and Vimentin protein expression in each group

圖7 各組細胞侵襲及遷移圖(結晶紫,200×)Figure 7 Cell invasion and migration in each group

表4 3組宮頸癌細胞上皮間質轉化、侵襲、遷移、DPP耐藥結果比較Table 4 Comparison of epithelial mesenchymal transition, invasion, migration and DPP resistance of cervical cancer cells among the three groups

2.5 雙熒光素酶報告檢測結果 雙熒光素酶報告結果顯示,轉染SNHG3后可顯著降低miR-532-3′-UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05),但對突變基因無顯著影響(P>0.05),且SNHG3與miR-532呈現負相關,見表5、圖8、圖9。

圖8 SNHG3與miR-532靶向結合位點圖Figure 8 Target binding sites of SNHG3 and miR-532

圖9 SNHG3與miR-532相關性圖Figure 9 Correlation between SNHG3 and miR-532

表5 雙熒光素酶報告Table 5 Dual luciferase report

3 討論

近年來,隨著宮頸癌疫苗的出現及人們健康意識的提高,宮頸癌的發病也有所降低。但宮頸癌的死亡率仍然較高,是嚴重影響女性健康的一大殺手,因此,繼續深入研究宮頸癌發病及進展分子機制,尋找新的生物治療靶點是目前臨床治療亟待解決的重大課題[9]。本研究結果顯示,宮頸癌細胞系中的SNHG3 mRNA表達量顯著高于正常宮頸癌上皮細胞,miR-532 mRNA表達量顯著低于正常宮頸癌上皮細胞,這表明SNHG3、miR-532可能參與癌癥進程。目前已被證實,如LcnRNA、miRNA 等非編碼RNA在人類的生理乃至疾病和癌癥的發生、發展中發揮重要作用,可通過多種途徑調控靶基因,從而對機體生長、發育、分化等過程起重要調控作用,對機體各種生理及病理過程造成影響[10]。SNHG3是近年來研究最多的一種LcnRNAs,其可通過RNA剪接、tRNA處理、信號轉導等,參與細胞轉錄、凋亡、粘附等方面的調控;miR-532則是miRNAs的一種,其可通過堿基配對結合靶基因信使RNA,來抑制靶基因翻譯或引起其降解,從而對細胞的增殖、凋亡、轉移等生命進程起重要作用,最終影響腫瘤的發生、發展[11-12]。而對于SNHG3高表達,miR-532低表達,可能是由于宮頸癌中其基化區域出現異常,從而導致其上游靶基因轉錄異常,進而導致SNHG3大量轉錄,miR-532過度降解,最終在機體內SNHG3呈高表達,miR-532呈低表達。Zhu等[13]表明,SNHG3在宮頸癌中表達顯著增加,且SNHG3表達上調與轉移相關,這說明SNHG3可以作為預后的生物標志物和宮頸癌的治療靶點,這與本文結果類似。

本文結果提示,抑制SNHG3可顯著抑制細胞侵襲及遷移,并改善上皮間質轉化和DPP耐藥,這說明SNHG3可成為治療宮頸癌的有效靶點。宮頸癌癌細胞的侵襲和轉移是導致包括宮頸癌在內的所有腫瘤患者死亡的主要原因,因此探尋其侵襲和轉移的分子機制就顯得尤為重要[14]。而近年來研究[15-16]發現,上皮源性腫瘤的侵襲、轉移與細胞間質轉化密切相關,為了獲得運動和侵襲能力,腫瘤細胞必須發生間質轉化,因為間質轉化可使原發腫瘤發生許多表型的改變,從而有利于癌細胞離開腫瘤原發部位,播散至遠處組織、器官,最終形成新的腫瘤,E-cadherin 、Vimentin是間質轉化過程的關鍵分子,E-cadherin下調或缺失、 Vimentin 表達增加被視為癌細胞發生間質轉化的最重要標志,因此檢測其水平的變化可有效反映宮頸癌細胞上皮間質轉化逆轉情況。DPP是宮頸癌化學治療的重要藥物,不僅潛力最佳,應用也最為廣泛,也正是因為這一特性,DPP耐藥成為了限制其臨床療效以及部分患者治療進展的關鍵原因,因此如何改善宮頸癌DPP耐藥一直是臨床關注的焦點之一[17]。而對于宮頸癌細胞,抑制SNHG3主要通過調控相關信號通路的表達,來改善腫瘤微環境,從而調控腫瘤間質轉化相關蛋白,抑制上皮間質轉化的發生,進而抑制細胞侵襲及遷移,促進細胞凋亡,增加細胞間黏附性和極性等,最終有效改善DPP耐藥,提高治療效果。有發現,下調SNHG3可顯著抑制宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,其機制可能與抑制上皮間質轉化通路有關,這與本文結果類似[18]。

雙熒光素酶報告結果顯示,轉染SNHG3后可顯著抑制miR-532-3′-UTR-WT的熒光素酶活性,但對突變基因無顯著影響,且SNHG3與miR-532呈現負相關,這說明miR-532可能是SNHG3的靶基因。近年來研究[18]發現,LncRNA可競爭結合 miRNAs,從而影響miRNAs的功能與活性,而miR與上皮間質轉化,上皮間質轉化與細胞惡性行為和化療耐藥之間的關系也早有研究證實,這說明LncRNA可通過靶向 miRNAs對癌細胞皮間質轉化造成影響,從而調控惡性行為及耐藥。故可推測SNHG3可抑制宮頸癌細胞侵襲及遷移,并改善DPP耐藥,可能是通過吸附miR-532的競爭內源性 RNA,來參與表觀遺傳學調控,從而調節鄰近蛋白質編碼基因的表達,調控相關信號通路的表達,改善腫瘤微環境,進而抑制癌細胞發生間質轉化,抑制其獲得間質細胞特征,最終達到抑制宮頸癌細胞侵襲及遷移,并改善DPP耐藥的目的。鄭志遠等[19]表明,SNHG3具有致癌作用,可顯著促進細胞增殖、侵襲以及上皮間質轉化,這與本文結果類似。

本文為治療宮頸癌的科學研究提供了新的思路及實驗經驗,有望成為宮頸癌治療的新靶點。但本文實驗仍存在一定不足,實驗室尚未建立SNHG3慢病毒對大鼠的干預,在今后的實驗中會進一步添加SNHG3對宮頸癌的參考依據。

4 結論

抑制SNHG3可有效逆轉宮頸癌細胞上皮間質轉化,抑制細胞侵襲及遷移,并提高DPP耐藥,其作用機制可能與靶向激活miR-532有關。