miR-126-3p.1通過SLC7A5調控間變性甲狀腺癌細胞糖酵解的作用機制*

丁雯鈺 高楊麗 楊一飛

(河北工程大學附屬醫院,河北 邯鄲 056000)

甲狀腺癌是世界上最常見的內分泌腫瘤,其發病率逐年上升[1]。其中80%～85%的甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer,PTC),其5年生存率達94%,而間變性甲狀腺癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)占2%左右,其侵襲性較強,1年生存率約為20%[2-3]。隨著醫學技術的不斷進步,甲狀腺癌發病機制的研究也取得較大發展,但其發病率仍在增長。因此,探索ATC的發病機制,提高ATC的存活率具有重要意義。微小核糖核苷酸(MicroRNAs,miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的非編碼RNA片段,在PTC的預后和治療中起著至關重要的作用[4-5]。miR-126在很多癌癥中扮演抑癌基因的角色,抵抗癌癥的惡化[6]。近兩年,有研究[7]報道,miR-126在甲狀腺癌中表達失調,與癌癥的進展存在聯系,但是其在ATC糖酵解中的作用及機制尚少有人研究。溶質運載家族7成員5(Solute carrier family 7 member 5,SLC7A5)是必需氨基酸(如亮氨酸和苯丙氨酸)的膜轉運蛋白,其在細胞增殖所需蛋白的合成中起關鍵作用[8]。SLC7A5在人類的多種實體腫瘤中過度表達,其中包括甲狀腺癌[9]。但是,SLC7A5是否參與miR-126-3p.1在甲狀腺癌進展中的作用尚未可知。本研究旨在探討miR-126-3p.1調控甲狀腺癌細胞糖酵解的作用機制及其與SLC7A5之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人正常甲狀腺細胞Htori-3、人間變性甲狀腺癌細胞SW1736、人乳頭瘤狀甲狀腺癌細胞TPC-1(中國科學研究院上海細胞庫);TRIzol液、逆轉錄酶、BCA蛋白檢測試劑盒(美國Invitrogen);ReadyPrep 蛋白質萃取試劑盒(總蛋白)(美國Bio-Rad);SLC7A5一抗、GAPDH一抗、HRP標記的IgG二抗體(Abcam);BeyoECL Plus試劑盒、增強型CCK-8試劑盒、EdU試劑盒(中國上海碧云天生物科技公司);葡萄糖含量檢測試劑盒(微量法)、乳酸含量(LA)檢測試劑盒(可見分光光度法)(北京索萊寶生物科技有限公司);CKX31型奧林巴斯倒置顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染及分組 Htori-3、SW1736、TPC-1均使用DMEM培養基(10%胎牛血清+100 μg/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素)培養。在37 ℃、5%CO2飽和濕度空氣的恒溫細胞培養箱中常規傳代培養。TPC-1細胞分為agomiRNA(轉染agomiRNA)組、agomiR-126-3p.1(轉染agomiR-126-3p.1)組、si-NC(轉染si-NC)組、si-SLC7A5(轉染si-SLC7A5)組、agomiR-126-3p.1+pcDNA(共轉染agomiR-126-3p.1和pcDNA)組、agomiR-126-3p.1+ pcDNA-SLC7A5(共轉染agomiR-126-3p.1和pcDNA-SLC7A5)組,各組細胞用脂質體法轉染至SW1736。RT-qPCR確定轉染是否成功。

1.2.2 RT-qPCR實驗檢測miR-126-3p.1、SLC7A5的表達 TRIzol液提取細胞總RNA,逆轉錄酶合成cDNA。分別使用TaqMan miRNA檢測試劑盒、SYBR?預混料Ex TaqTMII進行miR-126-3p.1、SLC7A5的qPCR分析。條件為(95 ℃,10 min與95 ℃,15 s和60 ℃,1 min,40循環)。U6、GAPDH分別用作miR-126-3p.1、SLC7A5的內部參照,2-△△Ct法計算結果。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖 使用增強型CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖。將細胞以每孔100 μL(1×104個細胞)接種96孔板,每孔加入10 μLCCK-8溶液,孵育30 min。450 nm波長處檢測細胞的吸光度(OD450)。增殖率(%)=OD450實驗/OD450對照×100%。

1.2.4 EdU法檢測細胞增殖 將待測細胞以每孔500 μL(5×104個細胞)接種24孔板,培養過夜。再用250 μL含有20 μM EdU的新鮮培養液替換一半的培養液,繼續培養8 h。4%多聚甲醛固定細胞15 min,并用0.5%Triton X-100滲透細胞20 min。用3%牛血清白蛋白沖洗后,添加500 μL 1×Click反應液,室溫避光孵育30 min。加入5 μg/mL Hoechst 33342對細胞核染色30 min。熒光顯微鏡觀察,拍照。Hoechst 33342核染為藍色,EdU染色為紅色。用紅色細胞數/藍色細胞數×100%表示EdU陽性率。

1.2.5 ELISA法檢測細胞葡萄糖、乳酸 通過葡萄糖攝取和乳酸生成評估細胞的糖酵解水平。使用葡萄糖含量檢測試劑盒(微量法)、乳酸含量(LA)檢測試劑盒(可見分光光度法)檢測細胞葡萄糖含量、乳酸含量。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書要求操作、計算。以對照組細胞葡萄糖含量、乳酸含量最為單位,實驗組葡萄糖含量、乳酸含量占對照組葡萄糖含量、乳酸含量的百分比表示相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率。

1.2.6 WB實驗檢測細胞SLC7A5蛋白 使用ReadyPrep 蛋白質萃取試劑盒(總蛋白)從各組細胞中提取總蛋白,BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白,再轉移到PVDF膜。PVDF膜封閉處理后,使用SLC7A5(1∶2000)、GAPDH(1∶3000)一抗孵育(4 ℃,12 h)。然后用HRP標記的IgG二抗(1∶1000)孵育(37 ℃,2 h)。ECL顯色,Image J軟件分析每個蛋白條帶的灰度。使用目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值之間的比值表示蛋白的相對表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗檢測細胞熒光活性 生物信息學靶標預測網站Targetscan(https://www.targetscan.org)、starbase(https://starbase.sysu.edu.cn)預測miR-126-3p.1的靶標,發現SLC7A5為其下游靶基因之一。根據結合位點合成野生型SLC7A5(含SLC7A5 3′ UTR-WT結合序列)、突變型SLC7A5(不含SLC7A5 3′ UTR-MUT結合序列),克隆至熒光載體psiCHECK2,形成熒光報告基因(SLC7A5 3′ UTR-WT、SLC7A5 3′ UTR-MUT)。Lipofectamine 2000將熒光報告基因與agomiRNA、agomiR-126-3p.1、antagomiRNA、antagomiR-126-3p.1共轉染SW1736細胞。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞的熒光活性。

2 結果

2.1 miR-126-3p.1在甲狀腺癌中的表達 TCGA數據庫顯示,miR-126-3p.1在甲狀腺癌組織中表達水平顯著降低(見圖1A),作為癌癥診斷指標的AUC值為0.68(見圖1B),高表達患者的存活率明顯升高(見圖1C)。Htori-3、SW1736、TPC-1細胞miR-126-3p.1表達分別為0.98±0.07、0.31±0.03、0.46±0.04,與Htori-3相比,SW1736、TPC-1細胞miR-126-3p.1表達顯著降低(F=451.095,P<0.001)。

圖1 miR-126-3p.1與甲狀腺癌之間的關系分析Figure 1 Analysis of the relationship between miR-126-3p.1 and thyroid cancer注:A.miR-126-3p.1在癌組織中的表達;B.miR-126-3p.1在甲狀腺癌中的ROC分析;C.miR-126-3p.1與甲狀腺癌患者的生存分析。

2.2 過表達miR-126-3p.1對TPC-1細胞糖酵解的調控 與agomiRNA組相比,agomiR-126-3p.1組細胞miR-126-3p.1表達顯著升高,細胞增殖率、EdU陽性率、相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率均顯著降低(均P<0.05), 見表1。

表1 過表達miR-126-3p.1的SW1736細胞增殖、糖酵解Table 1 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells overexpressing miR-126-3p.1

2.3 miR-126-3p.1靶向SLC7A5 Targetscan(https://www.targetscan.org)發現,SLC7A5 3′UTR與miR-126-3p.1之間存在連續的6個互補結合位點。轉染agomiR-126-3p.1和SLC7A5 3′UTR-WT的TPC-1細胞熒光活性顯著降低,轉染antagomiR-126-3p.1和SLC7A5 3′UTR-WT的TPC-1細胞熒光活性顯著升高(均P<0.05)。在甲狀腺癌組織中miR-126-3p.1與SLC7A5之間呈顯著的負相關(R=-0.266,P<0.05)。與agomiRNA組相比,agomiR-126-3p.1組TPC-1細胞SLC7A5蛋白表達量顯著降低,與antagomiRNA組相比,antagomiR-126-3p.1組TPC-1細胞SLC7A5蛋白表達量顯著升高,差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-126-3p.1靶向SLC7A5Figure 2 miR-126-3p.1 targets SLC7A5注:A.互補結合位點;B.雙熒光素酶報告實驗結果;C.miR-126-3p.1與SLC7A5在甲狀腺癌中的相關性;D.miR-126-3p.1負向調控SLC7A5蛋白。與agomiRNA組比較,①P<0.05;與agomiR-126-3p.1組比較,②P<0.05。

2.4 SLC7A5在甲狀腺癌中的表達 SLC7A5在甲狀腺癌組織中的表達顯著高于正常組織(見圖3A),在SW1736、TPC-1細胞中的表達顯著高于Htori-3細胞(見圖3B)。與Htori-3相比,SW1736、TPC-1細胞SLC7A5表達顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 SLC7A5在Htori-3、SW1736、TPC-1細胞中的表達Table 2 SLC7A5 expression in Htori-3, SW1736 and TPC-1 cells

圖3 SLC7A5在甲狀腺癌中的表達Figure 3 SLC7A5 expression in thyroid carcinoma注:A.SLC7A5在甲狀腺癌組織中的表達;B.SLC7A5在甲狀腺癌細胞中的表達。

2.5 敲減SLC7A5對SW1736細胞糖酵解的調控 與si-NC組相比,si-SLC7A5組SW1736細胞SLC7A5表達、細胞增殖率、EdU陽性率、相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率均顯著降低(P<0.05),見圖4、表3。

表3 敲減SLC7A5的SW1736細胞的增殖、糖酵解Table 3 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells knockdown SLC7A5

圖4 SLC7A5蛋白表達Figure 4 SLC7A5 protein expression

2.6 過表達SLC7A5逆轉miR-126-3p.1對SW1736細胞糖酵解的作用 與agomiR-126-3p.1+pcDNA組相比,agomiR-126-3p.1+pcDNA-SLC7A5組SW1736細胞SLC7A5表達顯著升高,miR-126-3p.1表達顯著降低,細胞增殖率、EdU陽性率、相對葡萄糖消耗率、相對乳酸生成率顯著升高(均P<0.05)。見圖5、表4。

表4 過表達SLC7A5和miR-126-3p.1的SW1736細胞增殖、糖酵解Table 4 Proliferation and glycolysis of SW1736 cells overexpressing SLC7A5 and miR-126-3p.1

圖5 SLC7A5蛋白表達Figure 5 SLC7A5 protein expression

3 討論

miR-126表達廣泛,在人類癌癥中具有診斷價值,其在某些癌癥中作為腫瘤抑制因子發貨作用,包括肺癌、胃癌、胰腺癌及惡性甲狀腺癌[10-11]。Tao等[12]報道,miR-126作為circPVT1的靶點,在甲狀腺癌組織、細胞中低表達,并且下調miR-126可逆轉沉默circPVT1對癌細胞增殖、遷移侵襲的抑制和凋亡的促進作用。Zeng等[13]在甲狀腺癌的研究中報道,miR-126在PTC-1、ATC細胞SW1736中低表達,與NEAT1、VEGFA存在靶向關系,調控甲狀腺癌細胞的增殖、遷移侵襲及凋亡,暗示miR-126在甲狀腺癌中的潛在作用。本課題組的此研究發現,miR-126-3p.1在甲狀腺癌組織、細胞中表達下調,這也與上述研究結果相一致。進一步研究發現,過表達miR-126-3p.1抑制了癌細胞的增殖、葡萄糖消耗率、乳酸生成,表現出抑制癌細胞糖酵解的抑癌功能。深入研究發現,miR-126-3p.1可靶向SLC7A5,并且他們在癌組織中的表達水平呈明顯的負相關性,這也許可能與miR-126-3p.1在甲狀腺癌中發揮調控作用存在一定聯系。

據報道[14-15],在PTC中,SLC7A3、SLC7A5和SLC7A11表達水平的升高預示著患者的生存率較低或預后不良。在ATC的研究[16-17]中報道,SLC7A5在ATC小鼠腫瘤模型、ATC患者組織樣本中的表達均上調,SLC7A5阻斷劑JPH203給藥后,模型小鼠腫瘤生長停滯,這些臨床前的研究結果表明,SLC7A5抑制劑在甲狀腺癌中的治療前景。體外研究[18-20]顯示,JPH203通過抑制mTOR信號,阻斷細胞從G0/G1期到S期的進展,抑制ATC細胞的增殖,腫瘤生長,再次表明SLC7A5抑制劑是控制ATC的候選藥物。但是,SLC7A5對甲狀腺癌糖酵解過程是否有影響尚未可知。本研究結果顯示:SLC7A5在甲狀腺癌組織、細胞中表達升高,敲減SLC7A5不但抑制癌細胞的增殖,更抑制了癌細胞的糖酵解,這再次證實了SLC7A5在甲狀腺癌惡化過程中的關鍵作用,也說明其作為miR-126-3p.1靶標在miR-126-3p.1調控甲狀腺癌過程中的重要性。過表達SLC7A5逆轉了miR-126-3p.1對癌細胞增殖、糖酵解的抑制作用。

4 結論

miR-126-3p.1抑制甲狀腺癌細胞增殖、糖酵解,這種抗癌作用的潛在機制與靶向SLC7A5有聯系,可為甲狀腺癌的治療提供新靶點。