PTC-209誘導體外螺旋神經元損傷作用及機制*

朱國霞 羅家勝 張霞婧 吳永翔

(1.西安市人民醫院·西安市第四醫院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710004;2.西北工業大學醫學研究院,陜西 西安 710004; 3.新疆軍區總醫院耳鼻咽喉頭頸外科,新疆 烏魯木齊 830099)

Bmi1是一種Polycomb group(PcG)蛋白,其參與H2A泛素化相關轉錄沉默[1],且在很多種腫瘤中異常增高[2]。Bmi1(-/-)小鼠食管癌的輻射敏感性增加,以及細胞活力顯著抑制,這可能導致G0/G1期細胞比例增加,并通過抑制PI3K/Akt信號通路導致細胞凋亡[3]。在鼻咽癌CNE2細胞株中通過轉染慢病毒重組載體來敲低Bmi1表達可提高細胞的放射敏感性[4]。研究發現Bmi1在同源重組(HR)修復DNA雙鏈斷裂中的作用中促進DNA末端切除;機制上,Bmi1通過促進CtIP的募集介導DNA末端切除,從而使RPA和RAD51在DNA損傷部位積累[5]。Bmi1在耳蝸的生理和病理情況也有相關研究。Bmi1通過Wnt信號通路啟動新生小鼠耳蝸支持細胞(Supporting cells,SCs)和lgr5陽性祖細胞的增殖程序[6]。在耳蝸螺旋韌帶纖維細胞中,D-半乳糖可能是通過降低Bmi1的表達,使Bmi1抑制p16INK4a表達的作用減弱,從而促進纖維細胞的衰老[7]。另外,Bmi1(-/-)小鼠體內體外耳毒藥物誘導的毛細胞(Hair cells, HCs)損失顯著增加,以及HCs的自由基和線粒體ROS水平明顯升高,乙酰半胱氨酸(Acetylcysteine,NAC)可以減輕上述藥物所致的損傷[8]。以及在噪聲暴露前予低頻聲預處理可以提高機體內源性抗氧化水平,可一定程度減輕噪聲暴露所致的氧化損傷,且Bmi1-SOD參與了這一過程[9]。那么Bmi1在體外耳蝸器官培養SGNs中起到如何的作用,目前尚少相關研究。為此本研究使用Bmi1的特異性抑制劑PTC-209誘發SGNs損傷,進而探討其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 80只P3新生SD 仔鼠,均購于空軍軍醫大學實驗動物中心。動物的領取和使用受到學校實驗動物倫理委員會的監督和管理。

1.2 主要試劑 PTC-209(A specific inhibitor of Bmi1)購自美國Selleckchem公司;谷胱甘肽(glutathione, GSH)購自美國Sigma-Aldrich公司;β-Tubulin購自德國Millipore 公司、美國Abcam公司;二抗驢抗鼠IgG H&L購自美國Life technology公司、美國Abcam公司;MitoSOXTMRed mitochondrial superoxide indicator購自美國ThermoFisher Scientific公司;Hoechst 33258 trihydrochloride 購自美國MCE公司。

1.3 耳蝸器官培養方法

1.3.1 制備鼠尾膠 將90 μL 0.02N CH3COOH、(50×) Collagen gel溶液、10 μL 10× Basal Medium Eagle溶液以及10 μL 2% NaHCO3分別加入無菌離心管。在每個培養皿皿底正中滴入混勻的鼠尾膠,靜置30 min,待膠凝固后,于鼠尾膠周圍加入1 mL無血漿培養基。

1.3.2 SFM培養液制備 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin) 2 g;Serum-free Supplement 2 mL;20%葡萄糖4.8 mL;青霉素G 0.2 g;200 mmol/L 谷氨酰胺2 mL;碳酸氫鈉0.2 g;1X BME190.8 mL。

1.3.3 耳蝸基底膜和螺旋神經節的顯微解剖 將P3仔鼠用酒精消毒、處死,快速取出耳蝸。無菌生理鹽水沖洗后,放置于預冷的Hank′s液中,在解剖顯微鏡下保留耳蝸基底膜,并于耳蝸底轉,從 hook region延耳蝸螺旋方向輕柔分離基底膜和螺旋神經節,并將分離出的耳蝸基底膜和螺旋神經節組織平鋪于凝固的膠上。將其放置于培養箱中培養4 h后加入1 mL無血漿培養基,繼續培養過夜。次日在倒置顯微鏡下觀察耳蝸器官有無漂浮或者形態變化,選擇形態完整以及貼附良好的作為實驗組。該培養方法技術成熟,具體步驟據文獻[10-11]的研究內容。

1.4 PTC-209誘導體外培養耳蝸器官損傷模型的建立 PTC-209的儲存濃度為5 mM,用無血清培養液(Serum-free medium,SFM)分別稀釋至10、20、50 μM。取P3仔鼠耳蝸器官,培養箱中培養12 h,每組分別加入對應濃度的PTC-209,分別繼續培養24、48、72 h。每個時間段均分為四組,第一組:Ctrl組(培養液僅添加SFM);第二組:10 μM PTC-209組;第三組:20 μM PTC-209組;第四組:50 μM PTC-209組。

1.5 GSH預處理對PTC-209誘導體外培養耳蝸器官損傷的保護模型的建立 經前期的實驗驗證,PTC-209的最終工作濃度為10 μM,作用時間為48 h。此外,在GSH對PTC-209誘導體外培養耳蝸器官損傷的保護模型,其工作濃度為5 mM。取P3仔鼠耳蝸器官,待耳蝸器官培養穩定后,加入GSH在培養箱中先培養1～24 h不等,再經PTC-209處理后48 h結束培養。實驗共分為PTC-209 10 μM組、Pre1 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre1h)組、Pre2 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre2 h)組、Pre4 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre4 h)組、Pre6 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre6 h)組、Pre8 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre8 h)組、Pre12 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre12 h)組、Pre24 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM(pre24 h)組8組。

1.6 機制研究實驗分組 根據前期的預實驗,確定損傷模型(PTC-209組),即10μM PTC-209與耳蝸器官共培養48 h;最佳保護模型(GSH+PTC-209組),即Pre6 h 5 mM GSH對10 μM PTC-209培養48 h。故將實驗分為Ctrl組、GSH組、PTC-209組及GSH+PTC-209組4組,其中Ctrl組耳蝸器官僅使用培養液SFM,GSH組使用SFM稀釋的GSH作為培養液進行培養。PTC-209組、GSH+PTC-209組培養方法同上。培養結束后予MitoSOXRed 進行組織染色,激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.7 免疫熒光染色 吸棄培養皿上清,MitoSOX Red mitochondrial superoxide indicator 著染耳蝸活體組織,孵育30 min,0.01 M PBS清洗3次(5 min/次),4%多聚甲醛固定20 min,PBS清洗3次;隨后0.5% Triton X-100,37 ℃打孔10 min,PBS清洗3次。爾后5% BSA封閉液室溫封閉1 h,遂后滴加合適濃度的一抗β-Tubulin(1:200),置于濕盒內4 ℃過夜。取片后PBS清洗4次。避光加入稀釋好的二抗驢抗小鼠IgG H&L(1:200),并將切片置于濕暗盒內4 ℃過夜。次日PBS清洗4次后,避光加入Hoechst 33258(1:1000)室溫10 min,PBS清洗4次,甘油封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

2 結果

2.1 PTC-209誘導耳蝸螺旋神經元(Spiral ganglion neuronl,SGNs)損傷隨濃度增高和時間延長而加重 用標記SGNs和聽覺神經纖維(Anditory nervs fibers,ANFs)的β-Tubulin進行免疫熒光檢測,結果提示:PTC-209對SGNs和ANFs的損傷作用呈時間和濃度依賴性,當PTC-209低濃度時,如低于20 μM,時間的影響因素對損傷的作用更為顯著;當提高PTC-209濃度時,如50 μM,濃度依賴性的作用因素則更為明確。為此,損傷模型(PTC-209)確定為10 μM PTC-209與耳蝸器官共培養48 h。見圖1。

圖1 PTC-209在體外對SGNs和ANFs的損傷作用(n=6)Figure 1 The damaging effect induced by PTC-209 on SGNs and ANFs in vitro注:A.耳蝸SGNs和ANFs數量隨著PTC-209濃度增加和培養時間延長而逐步減少(比例尺=50 μm); B.PTC-209對耳蝸損傷作用的統計分析。50 μM PTC-209 24 h組與Ctrl組24 h比較,①P<0.05;10、20、50 μM PTC-209 48 h組與Ctrl組48 h比較, ②P<0.01; 10、20、50 μM PTC-209 72 h組與Ctrl組72 h比較, ③P<0.05。

2.2 不同時間預處理GSH對PTC-209誘導耳蝸SGNs損傷存在差異保護作用 前期實驗證實10 μM PTC-209 在作用48 h后SGNs有明確損傷,同時在預實驗中使用5 mM GSH 預處理體外培養耳蝸器官,發現不同時間預處理GSH對10 μM PTC-209誘導SGNs損傷有不同的保護作用。實驗將8組的ANFs進行統計分析,以明確最佳預處理GSH時間。結果提示,Pre 6 h GSH 5 mM+ PTC-209 10 μM組與其余各組ANFs差異均有統計學意義(P<0.01),提示Pre 6 h 5 mM GSH對10μM PTC-209培養48 h誘導SGNs和ANFs的損傷有顯著保護作用。見圖2。

圖2 GSH對10μM PTC-209誘導SGNs和ANFs的損傷有保護作用(n=6)Figure 2 Pretreatment with GSH had protective effect on SGNs and ANFs induced by 10μM PTC-209注:A.提前6 h預處理GSH對10 μM PTC-209誘導的損傷呈最佳的保護作用(標尺=100 μm); B.GSH對10 μM PTC-209誘導的損傷保護作用的統計分析。Pre6 h組與其余各組比較,①P<0.01。

2.3 GSH預處理和PTC-209誘導耳蝸SGNs ROS的影響 收集四組耳蝸器官行MitoSOXTMRed染色,其中綠色熒光β-Tubulin標記SGNs和ANFs,藍色熒光Hoechst標記細胞核。結果提示,Ctrl組、GSH組以及GSH+PTC-209組均未見紅色熒光標記的ROS在SGNs和SCs蓄積。PTC-209組紅色熒光標記的ROS在該處有大量蓄積。同時對各組ROS的紅色熒光光密度值測定并行統計分析,發現PTC-209組和Ctrl組、GSH+PTC-209組ROS的紅色熒光光密度值差異均有統計學意義(q=343.5/349.3,P<0.01)。見圖3。

圖3 GSH預處理和PTC-209對SGNs和ANFs ROS的影響(n=6)Figure 3 Effects of GSH pretreatment and PTC-209 on ROS in SGNs and ANFs注:A.PTC-209誘導ROS在SGNs和ANFs蓄積,而GSH預處理可明顯減輕ROS蓄積(比例尺=50μm); B.各組耳蝸SGNs ROS熒光光密度值測定及分析。PTC-209組與Ctrl組比較, ①P<0.01; PTC-209組與GSH+PTC-209組比較, ②P<0.01。

3 討論

GSH作為一種廣譜抗氧化劑,其生化結構決定其生物學特點。GSH分子結構中半胱氨酸側基團上巰基可保護細胞內蛋白巰基不被氧化,與自由基結合,加速自由基的清除,減少自由基對機體的氧化損傷,是GSH抗氧化功能的結構基礎[12]。研究[13]表明鑒定/發現誘導激活SIRT3或谷胱甘肽還原酶,或者增加線粒體GSH水平的化合物在通過模擬能量限制在人內耳細胞對預防老年性聾的發生。另有研究[14]認為乙酰半胱氨酸通過刺激GSH的產生對順鉑誘導的耳蝸損傷有明確保護作用。這進一步表明氧化還原狀態的失衡導致氧化產物的蓄積以及隨后發生的生化級聯反應在聽力損失的發生和發展進程中起著重要作用。在本研究中發現5 mM GSH 在Pre6 h、Pre8 h 預處理10 μM PTC-209 共培養48 h對SGNs和ANFs有顯著的保護作用,即預處理時間越小或越大于6～8 h,GSH的保護效應越弱,尚存的SGNs和ANFs就越少。為此,分析可能原因為GSH在培養液中維持較高濃度時,便可抵消部分由PTC-209誘導SGN和ANF損傷產生的自由基和ROS,從而達到最大的保護效應。

回顧文獻[8-9]發現Bmi1無論在耳蝸HCs還是在SGNs中,其反應氧化還原狀態以及ROS水平。Bmi1(-/-)小鼠耳蝸HCs在體內外對耳毒藥物損傷敏感性顯著增加,并進一步證實其HCs的自由基和線粒體ROS水平升高導致氧化還原狀態失衡,進而促進凋亡的發生[8]。

在大鼠噪聲暴露前予低頻聲預處理可提高SGNs Hsp70、Bmi1、FoXO1以及SOD1/2的表達水平。當在體外培養SGNs中過表達Hsp70時,可進一步提高上述分子表達水平、降低ROS蓄積,因此初步證實Hsp70/Bmi1-FoxO1-SOD參與聲預處理提高機體內源性抗氧化能力的這一過程[9]。本研究中10 μM PTC-209與體外耳蝸器官共培養48 h后,SGNs和ANFs有明顯損傷作用。隨后研究對各組的耳蝸器官進行MitoSOX Red染色,發現PTC-209組SGNs和SCs可見大量ROS蓄積,GSH+PTC-209組均未見ROS蓄積。因此推測,PTC-209作為Bmi1的特異性抑制劑,可能通過抑制Bmi1的表達,促進了耳蝸器官局部的氧化還原狀態失衡的發生,進而引發SGNs和ANFs的死亡。

Bmi1作為Polycomb群蛋白之一,是抑制基因表達的表觀遺傳因子,其因促進細胞增殖和減少凋亡參與多種腫瘤的發生,在生物網絡受多種分子和信號通路的調控,其中與PI3K/Akt關系密切。研究[15]發現阻斷PI3K/Akt信號通路增加噪聲引起的暫時性閾移的敏感性,內源性PI3K/Akt信號通路被認為是內耳內在的保護機制。另外,Bmi1通過PTEN-PI3K/Akt-mTOR 信號通路促進缺血性心力衰竭的心肌纖維化[16]。在骨肉瘤細胞中過表達Bmi1時可通過增加PI3K/AKT活性來提高其對順鉑的耐藥性[17]。在急性髓系白血病中,缺氧暴露通過激活HIF-1α/BMI-1信號通路調控白血病干細胞,進而調控PI3K/Akt信號通路和促進上皮-間質轉化的進程[18]。MiR-15通過PI3K/Akt信號通路靶向調控Bmi1進而抑制膀胱癌細胞進展[19]。研究[20]顯示Bmi1通過調控PHLPP(PH結構域和富含亮氨酸的重復蛋白磷酸酶)表達水平來影響AKT的磷酸化水平,即Bmi1缺失導致PHLPP1和PHLPP2表達增加,pAKT水平降低。

4 小結與展望

PTC-209和耳蝸器官共培養后發現SGNs和SCs中自由基和ROS大量蓄積,促進SGNs和ANFs死亡的發生,但是調控機制尚不明確。在后續研究中,將進一步檢測PI3K/Ak的底物p85α、p-Akt (S473)等表達水平,以及使用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002,深入探索PI3K/Akt信號通路是否參與調控這一過程。